本发明涉及一种具有ph响应的灵芝多糖-苯硼酸-甲氨蝶呤结合物载药纳米粒子及其制备方法，属于生物医药和纳米医药技术领域。
背景技术：
灵芝作为中国传统的名贵中药材，具有滋补强身、扶正固本、轻身延年的功效，灵芝多糖是灵芝最有效的成分之一。近年来，国内外大量的研究工作致力于灵芝多糖的提取、分离、纯化和结构验证，并且研究了灵芝多糖的抗肿瘤和增强免疫力的药理作用。但将灵芝多糖作为纳米药物载体材料的研究目前几乎没有报道。
药物递送系统(drugdeliverysystems,dds)具有增强渗透性和保留效应，且纳米载体可以有效地改善细胞摄取，增加疏水性药物的溶解能力，药物在疾病部位积累无泄漏，并控制细胞内药物释放以提高细胞内药物的浓度而导致细胞的死亡。智能的药物输运系统(ddss)提供了一种高效的治疗手段，可以在患病的组织或细胞定点释放，以及在特定的病变及特定生理环境下进行相应的智能控制释放，从而改善药物在体内分布，增强治疗作用，并降低毒副反应的效果，具有广阔的应用前景。
多糖不仅具有安全性、无毒性、亲水性和生物可降解性等特点，而且生物相容性好，可降解。此外，由于多糖分子链上存在数量较多的活泼基团(如羟基、氨基等)，因此可以很方便地对多糖进行化学修饰，获得不同种类的多糖衍生物。以上优点使多糖成为药物输送系统dds的重要组成材料。灵芝多糖glp是一种天然高分子多糖，是灵芝最有效的成分之一，由三股单糖链构成的、具有螺旋状立体构形(三级结构)的葡聚糖，是一种大分子化合物，其分子量从数千到数十万，其分子结构中的大量羟基使其具有较强的亲水能力，因此可作为大分子亲水链。研究表明，硼酸在弱碱性环境下会自发地与含邻二醇结构的化合物结合，形成在酸性环境下可断裂的硼酸酯键。人体正常组织的ph为7.4，是中性环境，而肿瘤部位为酸性环境。甲氨蝶呤(mtx)是一种有抗叶酸类抗肿瘤药物。但由于其水溶性很差，缺乏靶向性，在体内的循环时间很短，在很大程度上限制了它的临床应用。
在此基础上，本研究设计并制备了以硼酸为桥接段，利用化学键连接的方式，使疏水性的小分子抗癌药物甲氨蝶呤与灵芝多糖分子链连接，同时使其具有刺激-响应性能，自组装形成纳米胶束，灵芝多糖与甲氨蝶呤协同作用，增加药物的抗癌作用。迄今为止，还没有以灵芝多糖为材料的ph值响应型纳米药物载体研究的报道
技术实现要素：
本发明的目的是建立一种具有ph响应的灵芝多糖-苯硼酸-甲氨蝶呤结合物载药纳米粒子及其制备方法，本发明方法制备的灵芝多糖-苯硼酸-甲氨蝶呤载药纳米粒子具有良好的ph响应性能和生物相容性。本发明制备的以灵芝多糖为材料的载药纳米粒子制备方法操作简单，没有使用表面活性剂，具有靶向性和低毒性。
本发明提出的一种具有ph响应的灵芝多糖-苯硼酸-甲氨蝶呤结合物载药纳米粒子及其制备方法，其特征在于，所述的灵芝多糖-苯硼酸-甲氨蝶呤结合物由灵芝多糖、苯硼酸和甲氨蝶呤化学连接形成，灵芝多糖作为亲水段、甲氨蝶呤作为疏水段，灵芝多糖-苯硼酸-甲氨蝶呤结合物在水溶液中自组装包载10-羟基喜树碱以形成载药纳米粒子；
所述的灵芝多糖-苯硼酸-甲氨蝶呤复合物为式ⅰ所示的结构：
本发明的技术方案：
一种具有ph响应的灵芝多糖-苯硼酸-甲氨蝶呤结合物的合成：
本发明所述的灵芝多糖-苯硼酸-甲氨蝶呤结合物载药纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
(1)将苯硼酸与甲氨蝶呤化学连接形成苯硼酸-甲氨蝶呤前药，将甲氨蝶呤溶于二甲基亚砜中，加入碳二亚胺(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)有机碱活化甲氨蝶呤羧基3h后，再加入氨基苯硼酸，于室温n2保护下反应24h；然后将反应液滴入去离子水中，析出沉淀，并用去离子水、丙酮和nh4hco3洗涤沉淀，冷冻干燥，得到苯硼酸-甲氨蝶呤前药；
(2)将步骤(1)得到的苯硼酸-甲氨蝶呤前药与灵芝多糖反应，将苯硼酸-甲氨蝶呤前药与灵芝多糖溶解在二甲基亚砜中，利用0.05mol/l的naoh调节溶液ph为碱性，室温下反应6h，反应结束后，将反应液滴入冰乙醇中，析出沉淀，并用冰乙醇反复洗涤；随后用二甲基亚砜将固体复溶，用相应ph的pbs溶液透析48h，冷冻干燥得到灵芝多糖-苯硼酸-甲氨蝶呤结合物；
(3)灵芝多糖-苯硼酸-甲氨蝶呤结合物载药纳米粒子的制备，将灵芝多糖-苯硼酸-甲氨蝶呤结合物与10-羟基喜树碱(hcpt)溶于二甲基亚砜(dmso)中，然后将得到的溶液逐滴加入到高速搅拌的水溶液中自组装一段时间，然后再用磷酸盐缓冲液(pbs)透析3h，滤膜过滤后，冷冻干燥得到灵芝多糖-苯硼酸-甲氨蝶呤/10-羟基喜树碱载药纳米粒子(glp-pba-mtx/hcpt)。
本发明所述的灵芝多糖-苯硼酸-甲氨蝶呤结合物载药纳米粒子的制备方法，其特征在于，按质量比，苯硼酸：甲氨蝶呤＝0.2：1～2：1，优选0.5：1。
本发明所述的灵芝多糖-苯硼酸-甲氨蝶呤结合物载药纳米粒子的制备方法，其特征在于，按质量比，苯硼酸-甲氨蝶呤：灵芝多糖＝0.5：1～2：1，优选0.8：1。
本发明所述的灵芝多糖-苯硼酸-甲氨蝶呤结合物载药纳米粒子的制备方法，其特征在于，按质量比，edc：nhs：甲氨蝶呤＝0.2：0.2：1～1：1：1，优选0.5：0.4：1。
本发明所述的灵芝多糖-苯硼酸-甲氨蝶呤结合载药纳米粒子的制备方法，其特征在于，反应液ph为7.4～8.5，优选8.0。
本发明制备了一种具有ph响应的灵芝多糖-苯硼酸-甲氨蝶呤结合物载药纳米粒子，基于具有良好生物相容性、抗癌作用的天然高分子灵芝多糖为药物载体，提高了抗癌药物在体内的循环时间，同时通过接入苯硼酸，使其具有ph相应性能，可靶向作用于癌细胞，减少了药物对正常细胞的破坏。
附图说明
图1为灵芝多糖-苯硼酸-甲氨蝶呤聚合物核磁示意图；
图2为灵芝多糖-苯硼酸-甲氨蝶呤/10-羟基喜树碱纳米粒子tem示意图；
图3为灵芝多糖-苯硼酸-甲氨蝶呤/10-羟基喜树碱纳米粒子在不同ph磷酸盐缓冲液中药物缓释示意图；
图4为灵芝多糖-苯硼酸-甲氨蝶呤/10-羟基喜树碱纳米粒子细胞毒性示意图；
具体实施方式
实施例1：
1.称取150mgmtx置于50ml干燥的三口瓶中，加入5mln,n-二甲基甲酰胺dmf中，加入75mgedc和60mgnhs，在冰水浴中活化2h；之后向三口瓶中持续通入n2，加入200mgapba，于室温下反应24h；待反应结束后，将反应液滴入去离子水中，析出沉淀，分别用100ml去离子水、50ml丙酮和nh4hco3溶液反复洗涤沉淀，过滤得到固体，将固体冷冻干燥24h，得到苯硼酸-甲氨蝶呤前药；
2.称取100mg纯化后的灵芝多糖溶于10mldmso中，加入150mg苯硼酸-甲氨蝶呤前药，用0.05mol/lnaoh溶液调节反应液的ph为8.4，在n2的保护下，室温搅拌6h；待反应结束后，将反应液滴入冰乙醇，析出沉淀，用150ml冰乙醇反复洗涤沉淀后，将固体复溶于5mldmso中，在ph为8.4的pbs溶液中透析24h，除去杂质和有机溶剂，冷冻干燥，得到纯度95％以上的灵芝多糖-苯硼酸-甲氨蝶呤结合物；
3.称取16mg灵芝多糖-苯硼酸-甲氨蝶呤结合物与8mg10-羟基喜树碱溶于0.5mldmso中，充分溶解后，逐滴加入到3.5ml高速搅拌的ph为8.4的pbs溶液中，转速为550r/min搅拌15min；将反应液转移至1000d的透析袋中透析24h，之后冷冻干燥24h，得到载药纳米粒子；
实施例2：
1.称取100mgmtx置于50ml干燥的三口瓶中，加入5mln,n-二甲基甲酰胺dmf中，加入48mgedc和32mgnhs，在冰水浴中活化2h；之后向三口瓶中持续通入n2，加入50mgapba，于室温下反应24h；待反应结束后，将反应液滴入去离子水中，析出沉淀，分别用100ml去离子水、50ml丙酮和nh4hco3溶液反复洗涤沉淀，过滤得到固体，将固体冷冻干燥24h，得到苯硼酸-甲氨蝶呤前药；
2.称取50mg纯化后的灵芝多糖溶于10mldmso中，加入35.4mg苯硼酸-甲氨蝶呤前药，用0.05mol/lnaoh溶液调节反应液的ph为8.0，在n2的保护下，室温搅拌6h；待反应结束后，将反应液滴入冰乙醇，析出沉淀，用150ml冰乙醇反复洗涤沉淀后，将固体复溶于5mldmso中，在ph为8.0的pbs溶液中透析24h，除去杂质和有机溶剂，冷冻干燥，得到纯度95％以上的灵芝多糖-苯硼酸-甲氨蝶呤结合物；
3.称取20mg灵芝多糖-苯硼酸-甲氨蝶呤结物与10mg10-羟基喜树碱溶于0.5mldmso中，充分溶解后，逐滴加入到4.5ml高速搅拌的ph为8.0的pbs溶液中，转速为500r/min搅拌15min；将反应液转移至1000d的透析袋中透析24h，之后冷冻干燥24h，得到载药纳米粒子；
实施例3：
1.称取250mgmtx置于50ml干燥的三口瓶中，加入5mln,n-二甲基甲酰胺dmf中，加入120mgedc和80mgnhs，在冰水浴中活化2h；之后向三口瓶中持续通入n2，加入88mgapba，于室温下反应24h；待反应结束后，将反应液滴入去离子水中，析出沉淀，分别用100ml去离子水、50ml丙酮和nh4hco3溶液反复洗涤沉淀，过滤得到固体，将固体冷冻干燥24h，得到苯硼酸-甲氨蝶呤前药；
2.称取100mg纯化后的灵芝多糖溶于5mldmso中，加入75mg苯硼酸-甲氨蝶呤前药，用0.05mol/lnaoh溶液调节反应液的ph为7.4，在n2的保护下，室温搅拌6h；待反应结束后，将反应液滴入冰乙醇，析出沉淀，用150ml冰乙醇反复洗涤沉淀后，将固体复溶于5mldmso中，在ph为7.4的pbs溶液中透析24h，除去杂质和有机溶剂，冷冻干燥，得到纯度95％以上的灵芝多糖-苯硼酸-甲氨蝶呤结合物；
3.称取20mg灵芝多糖-苯硼酸-甲氨蝶呤结合物与10mg10-羟基喜树碱溶于0.5mldmso中，充分溶解后，逐滴加入到4.5ml高速搅拌的ph为7.4的pbs溶液中，转速为500r/min搅拌15min；将反应液转移至1000d的透析袋中透析24h，之后冷冻干燥24h，得到载药纳米粒子；
实施例4：
1.称取200mgmtx置于50ml干燥的三口瓶中，加入8mln,n-二甲基甲酰胺dmf中，加入96mgedc和64mgnhs，在冰水浴中活化2h；之后向三口瓶中持续通入n2，加入70.4mgapba，于室温下反应24h；待反应结束后，将反应液滴入去离子水中，析出沉淀，分别用150ml去离子水、50ml丙酮和nh4hco3溶液反复洗涤沉淀，过滤得到固体，将固体冷冻干燥24h，得到苯硼酸-甲氨蝶呤前药；
2.称取150mg纯化后的灵芝多糖溶于8mldmso中，加入106.2mg苯硼酸-甲氨蝶呤前药，用0.05mol/lnaoh溶液调节反应液的ph为8.4，在n2的保护下，室温搅拌6h；待反应结束后，将反应液滴入冰乙醇，析出沉淀，用150ml冰乙醇反复洗涤沉淀后，将固体复溶于5mldmso中，在ph为8.4的pbs溶液中透析24h，除去杂质和有机溶剂，冷冻干燥，得到纯度95％以上的灵芝多糖-苯硼酸-甲氨蝶呤结合物；
3.称取10mg灵芝多糖-苯硼酸-甲氨蝶呤结合物与5mg10-羟基喜树碱溶于0.5mldmso中，充分溶解后，逐滴加入到3.5ml高速搅拌的ph为8.4的pbs溶液中，转速为550r/min搅拌20min；将反应液转移至1000d的透析袋中透析24h，之后冷冻干燥24h，得到载药纳米粒子；
实施例5：
1.称取100mgmtx置于20ml干燥的三口瓶中，加入5mln,n-二甲基甲酰胺dmf中，加入20mgedc和20mgnhs，在冰水浴中活化2h；之后向三口瓶中持续通入n2，加入150mgapba，于室温下反应24h；待反应结束后，将反应液滴入去离子水中，析出沉淀，分别用50ml去离子水、20ml丙酮和nh4hco3溶液反复洗涤沉淀，过滤得到固体，将固体冷冻干燥24h，得到苯硼酸-甲氨蝶呤前药；
2.称取60mg纯化后的灵芝多糖溶于5mldmso中，加入90mg苯硼酸-甲氨蝶呤前药，用0.05mol/lnaoh溶液调节反应液的ph为8.0，在n2的保护下，室温搅拌6h；待反应结束后，将反应液滴入冰乙醇，析出沉淀，用100ml冰乙醇反复洗涤沉淀后，将固体复溶于5mldmso中，在ph为8.0的pbs溶液中透析24h，除去杂质和有机溶剂，冷冻干燥，得到纯度95％以上的灵芝多糖-苯硼酸-甲氨蝶呤结合物；
3.称取16mg灵芝多糖-苯硼酸-甲氨蝶呤结合物与8mg10-羟基喜树碱溶于0.5mldmso中，充分溶解后，逐滴加入到4.5ml高速搅拌的ph为8.0的pbs溶液中，转速为500r/min搅拌20min；将反应液转移至1000d的透析袋中透析24h，之后冷冻干燥24h，得到载药纳米粒子；
实施例6：
1.称取100mgmtx置于20ml干燥的三口瓶中，加入5mln,n-二甲基甲酰胺dmf中，加入50mgedc和40mgnhs，在冰水浴中活化2h；之后向三口瓶中持续通入n2，加入100mgapba，于室温下反应24h；待反应结束后，将反应液滴入去离子水中，析出沉淀，分别用100ml去离子水、50ml丙酮和nh4hco3溶液反复洗涤沉淀，过滤得到固体，将固体冷冻干燥24h，得到苯硼酸-甲氨蝶呤前药；
2.称取50mg纯化后的灵芝多糖溶于5mldmso中，加入100mg苯硼酸-甲氨蝶呤前药，用0.05mol/lnaoh溶液调节反应液的ph为8.4，在n2的保护下，室温搅拌6h；待反应结束后，将反应液滴入冰乙醇，析出沉淀，用100ml冰乙醇反复洗涤沉淀后，将固体复溶于5mldmso中，在ph为8.4的pbs溶液中透析24h，除去杂质和有机溶剂，冷冻干燥，得到纯度95％以上的灵芝多糖-苯硼酸-甲氨蝶呤结合物；
3.称取20mg灵芝多糖-苯硼酸-甲氨蝶呤结合物与10mg10-羟基喜树碱溶于0.5mldmso中，充分溶解后，逐滴加入到4.5ml高速搅拌的ph为8.4的pbs溶液中，转速为550r/min搅拌20min；将反应液转移至1000d的透析袋中透析24h，之后冷冻干燥24h，得到载药纳米粒子。