本发明属于高分子材料和医学工程领域，具体涉及一种多功能纳米药物载体，具体涉及一种用于逆转肿瘤药耐药性的，将磁热疗与ph响应型化疗复合的前药纳米载体。
背景技术：
利用化疗药物治疗肿瘤是目前肿瘤治疗的常规手段，但是临床化疗中常伴随有肿瘤耐药性的发生，这是目前已知的导致肿瘤化疗失败的最主要原因。肿瘤的耐药性可分为原发性耐药和获得性耐药。原发性耐药即肿瘤细胞本身就对某些化疗药物不敏感，首次用药就表现出耐药性。而获得性耐药则是经过一段时间的化疗后，残存的肿瘤细胞对化疗药物的敏感程度降低而表现出耐药性。尽管机理研究方面证实肿瘤的耐药性是多种耐药机制共同作用的结果，但是其临床表现均为肿瘤细胞对化疗药物的敏感程度降低甚至不敏感，因此提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性是逆转肿瘤耐药性的关键。
目前的研究证实，热疗可以显著增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，因此将热疗和化疗结合，即热化疗，是提高化疗药物疗效，降低用药浓度，减轻化疗药物副作用的有效途径，也是有效逆转肿瘤耐药性的有力手段。为实现热疗和化疗的高效协同作用，一个简单可行的思路就是将纳米热疗介质与化疗药物共载在同一药物载体内，包括多孔纳米硅球、脂质体、条件响应型的药物载体等，从而实现热疗和化疗在作用空间和作用时间上的同步性。但是上述类型的药物载体，基本上都是通过物理包裹或者物理吸附作用共载纳米热疗介质和化疗药物，通常存在以下两个问题：
1.药物容易通过自由扩散的方式从载体中泄露。由于物理包裹或者吸附作用是属于比较弱的作用力，因此当药物载体在体内循环时，内载的药物就会通过自由扩散而缓慢泄露，从而削弱了热疗和化疗的同步性。
2.具有较高的非靶向性热疗和化疗协同作用的风险，从而升高了化疗药物的副作用。由于热疗会加速药物的自由扩散，在热疗的作用下，药物能以更快的速度从载体中泄露出来，特别是利用温敏材料构成的药物载体，会在纳米热疗介质导致的局部升温中引起药物的瞬间突然释放。因此，利用物理包裹或者物理吸附作用共载纳米热疗介质和化疗药物的药物载体，其化疗的作用时间和位点都受制于热疗作用，而非对肿瘤组织的特异性识别。这就对药物载体的肿瘤靶向能力要求更高，但是到目前为止，肿瘤的靶向性识别和分布仍然是世界性难题。而这种非靶向性的热化疗会造成对正常组织更加严重的副作用。所以如何将热疗和化疗协同高效并针对性地作用于肿瘤组织，也是目前纳米热疗介质和化疗药物共载的药物载体所应亟待解决的问题。
为解决上述两个难题，特别是热化疗的非靶向性作用所导致的高副作用，本发明利用与药物偶联的两亲性ph敏感型大分子前药替代其他类型的药物载体，通过疏水相互作用包裹超顺磁性纳米颗粒，构建化疗和磁热疗高效协同的复合前药纳米载体。由于药物通过对ph敏感的共价键连接在两亲性大分子上，这样不仅极大地降低了药物泄露的概率，同时也保证了化疗作用只受环境ph值的影响，而不受磁热作用的干扰。如果这种复合前药纳米载体分布于具有生理ph值环境的正常组织中，外界磁场的引入只能引起非靶向性的热疗，而不会引起药物释放导致非靶向性的热化疗。而当这种复合前药纳米载体分布于ph值较低的肿瘤组织处时，其低ph值环境可引起两亲性ph敏感型大分子前药中对ph敏感的共价键的水解。该共价键的水解，一方面可以使化疗药物从大分子上脱离下来并作用于肿瘤细胞。另一方面，两亲性的大分子前药会因此变成全亲水的大分子，从而不能再包裹疏水的超顺磁性纳米颗粒构成胶束。伴随着胶束的解体，疏水的超顺磁性纳米颗粒会团聚并集中分散在肿瘤组织中。由于纳米热疗介质和化疗药物同时分布于肿瘤组织中，因此在外加磁场的作用下，磁热疗和化疗可同步作用于肿瘤组织，因此这种复合前药纳米载体可以实现对肿瘤组织，特别是耐药肿瘤组织的靶向性热化疗的协同作用，从而实现肿瘤耐药性的逆转。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种用于逆转肿瘤药耐药性的兼具磁热疗和靶向性化疗的复合前药纳米载体，即利用药物偶联的两亲性ph敏感型大分子前药，通过疏水相互作用包裹超顺磁性纳米颗粒，得到化疗和磁热疗高效协同的复合前药纳米载体。该复合前药纳米载体具有更高的载药稳定性和靶向性，使药物的释放不受磁热作用的干扰，药物能集中分布于ph值较低的肿瘤组织中。同时疏水的超顺磁性纳米颗粒也会伴随着药物的释放脱离药物载体，与药物同步分散于肿瘤组织中。因此这种由两亲性ph敏感型大分子前药构建的磁热疗-化疗协同的复合前药纳米载体，可以更好地将热化疗靶向性作用于肿瘤组织，在实现两种疗法的高效协同，提高化疗药物的细胞毒性，降低非靶向性热化疗的潜在副作用方面具有很大的应用潜力，特别适合于对药物作用剂量和药物的细胞毒性要求较高的耐药肿瘤的治疗和逆转。
为了实现上述目标，本发明提供的技术方案为：
一种用于逆转肿瘤药耐药性的复合前药纳米载体，其特征在于所述的复合前药纳米载体是由超顺磁性纳米颗粒和两亲性ph敏感型大分子前药组成通过自组装形成，具有典型的核壳结构，粒径在30nm～300nm之间，其中两亲性ph敏感型大分子前药为全亲水的两嵌段聚合物与疏水药物通过对ph敏感的化学键键合的偶连体，两亲性ph敏感型大分子前药中偶联了药物的疏水链段和超顺磁性纳米颗粒通过疏水相互作用形成复合前药纳米载体的疏水内核，而复合前药纳米载体的亲水外壳则由两亲性ph敏感型大分子前药中不含药物的亲水链段组成。
本发明中所述的超顺磁性纳米颗粒，其组成为mnxzn1-xfe2o4，其中x在0-1之间，粒径在5-20nm之间，表面被油胺或者油酸稳定，具有很强的疏水性。
本发明中所述的两亲性ph敏感型大分子前药为全亲水的两嵌段聚合物与疏水药物通过对ph敏感的化学键键合的偶连体，其中全亲水的两嵌段聚合物，其中的一个嵌段为聚乙二醇，分子量在5000～20000，另一个嵌段为含有羟基的聚甲基丙烯酸酯或者聚丙烯酰胺类聚合物组成，包括但不限于聚甲基丙烯酸羟丙酯、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚n-羟甲基丙烯酰胺、聚n-羟乙基丙烯酰胺，分子量为2000～10000，为同一全亲水两嵌段聚合物上聚乙二醇分子量的40％～50％。
本发明中所述的两亲性ph敏感型大分子前药为全亲水的两嵌段聚合物与疏水药物通过对ph敏感的化学键键合的偶连体，其中全亲水两嵌段聚合物中含有羟基的聚甲基丙烯酸酯或者聚丙烯酰胺类聚合物，其侧链羟基可以通过与酸酐或者硝基苯酰氯反应改性为羧基或者联胺。
本发明中所述的两亲性ph敏感型大分子前药，其疏水链段中与聚甲基丙烯酸酯或者聚丙烯酰胺偶联的药物为含有羧基、羟基、醛基或者酮基的疏水性抗肿瘤药物，或者可以经过适当后处理携带上述基团的疏水性抗肿瘤药物，包括但不限于喜树碱、紫杉醇、姜黄素、甲氨喋呤、阿霉素、顺铂等。
本发明中所述的两亲性ph敏感型大分子前药的疏水链段中，疏水药物通过对环境ph敏感的酯键或者腙键与聚甲基丙烯酸酯或者聚丙烯酰胺类聚合物偶联，且偶联率大于80％。
本发明中所述的一种用于逆转肿瘤耐药性的复合前药纳米载体的制备方法，其特征在于按照下述步骤进行：
将超顺磁性纳米颗粒和两亲性ph敏感型大分子前药以适当质量比例分散在有机溶剂中，在超声辅助下分散在水相中，然后除掉有机溶剂，即得到复合前药纳米载体。
其中，为提高复合前药纳米载体的磁热效应，超顺磁性纳米颗粒/两亲性ph敏感型大分子前药的质量比在1∶(0.1～10)。
其中，为保证复合前药纳米载体的形成，超顺磁性纳米颗粒和两亲性ph敏感型大分子前药、有机溶剂的比例为0.1～5mg∶0.1～10mg∶1～5ml，分散超顺磁性纳米颗粒和两亲性ph敏感型大分子前药的有机溶剂与水相的比例为1∶(10～100)。
其中，为有效控制复合前药纳米载体的粒径，制备过程中用于分散超顺磁性纳米颗粒和两亲性ph敏感型大分子前药的有机溶剂为单一组成或者按一定比例混合的有机溶剂，其中单一组成的有机溶剂为可以与水互溶的nn-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或者四氢呋喃，而按照一定比例混合的有机溶剂为四氢呋喃和nn-二甲基甲酰胺或者四氢呋喃和二甲基亚砜的混合物，且上述两种混合溶剂中，四氢呋喃/nn-二甲基甲酰胺和四氢呋喃/二甲基亚砜的体积均比为1∶(0.1～10)。
相对于现有的技术，本发明具有以下特点：
1、克服了通过物理包裹或者物理吸附作用装载药物的纳米药物载体，化疗药物容易发生泄露，从而非靶向性作用于正常组织的缺陷。
2、克服了原有热疗和化疗联合作用的纳米药物载体中，化疗药物的释放容易受到热疗作用的干扰，因而非靶向性的热疗常引起化疗药物的非靶向性释放，从而导致非靶向性的热化疗，对正常组织造成严重的副作用。
3、现有的热疗和化疗联合作用的纳米药物载体中，热疗会显著影响化疗药物的体内分布，但是化疗药物的释放则不会干扰纳米热疗介质的体内分布。而本发明的所涉及的复合前药纳米载体正好与其相反，药物的释放同时会引起复合前药纳米载体的解体，从而影响了疏水纳米热疗介质的体内分布。
4、与现有的热疗和化疗联合作用的纳米药物载体相比，本发明所涉及的这种复合前药纳米载体通过独特的协同靶向机制，保证了超顺磁性纳米颗粒和化疗药物可同时集中分布于肿瘤组织，使磁热疗和化疗可靶向性高效协同作用于肿瘤组织，因而有利于可肿瘤耐药性的逆转。
附图说明
图1为本发明工艺流程示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
实施例1：
称取100mg的聚甲基丙烯酸羟丙酯-聚乙二醇共聚物，将其与20mg的羧基化四价铂反应，得到通过酯键与四价铂连接的大分子前药，聚(甲基丙烯酸羟丙酯-四价铂)-聚乙二醇，其中聚甲基丙烯酸羟丙酯与羧基化四价铂的偶联率为90％。
取5mg的粒径为8nm超顺磁性纳米颗粒mnfe2o4和5mg铂的大分子前药聚(甲基丙烯酸羟丙酯-四价铂)-聚乙二醇，分散在2ml的四氢呋喃/nn-二甲基甲酰胺＝1/1的混合溶液中，然后在超声作用下将混合溶液滴加入20倍体积的去离子水中，然后在去离子水中透析24小时，除掉有机溶剂得到复合前药纳米载体的水溶液。然后将复合前药纳米载体冻干，得到粉末状固体。(如图1本发明工艺流程示意图所示)。将该产物以较低浓度(0.1mg/ml)分散在水中，用动态激光光散射仪测定的复合前药纳米载体的粒径分布在70nm左右，其多分散性为0.047。tem照片显示复合前药纳米载体的平均粒径为60nm，呈球形，分散均匀。
实施例2：
称取80mg聚n-羟甲基丙烯酰胺-聚乙二醇共聚物，将聚n-羟甲基丙烯酰胺的羟基修饰成联胺，然后与20mg的盐酸阿霉素反应，得到通过腙键与阿霉素连接的大分子前药，聚(n-甲基丙烯酸羟乙酯-阿霉素)-聚乙二醇，其中修饰后的聚n-甲基丙烯酸羟乙酯与阿霉素的偶联率为86％。
取2mg的粒径为15nm的超顺磁性纳米颗粒mn0.6zn0.4fe2o4和5mg的大分子前药聚(n-羟甲基丙烯酰胺-阿霉素)-聚乙二醇，加入5ml的四氢呋喃/二甲基亚砜＝1/1的混合溶液中，然后在超声作用下将混合溶液滴加入10倍体积的去离子水中，然后在去离子水中透析24小时，除掉有机溶剂得到复合前药纳米载体的水溶液。然后将复合前药纳米载体冻干，得到粉末状固体。将该产物以较低浓度(0.1mg/ml)分散在水中，用动态激光光散射仪测定的复合前药纳米载体的粒径分布在132nm左右，其多分散性为0.056。tem照片显示复合前药纳米载体的平均粒径为115nm，呈球形，分散均匀。
实施例3：
称取50mg的聚甲基丙烯酸羟乙酯-聚乙二醇共聚物，将其与10mg的甲氨喋呤反应，得到通过酯键与甲氨喋呤连接的大分子前药，聚(甲基丙烯酸羟丙酯-甲氨喋呤)-聚乙二醇，其中聚甲基丙烯酸羟乙酯与甲氨喋呤的偶联率为88％。
取2mg的粒径为12nm的超顺磁性纳米颗粒mn0.4zn0.6fe2o4和4mg的大分子前药聚(甲基丙烯酸羟丙酯-甲氨喋呤)-聚乙二醇，加入4ml的四氢呋喃/nn-二甲基甲酰胺＝3/7的混合溶液中，然后在超声作用下将混合溶液滴加入20倍体积的去离子水中，然后在去离子水中透析24小时，除掉有机溶剂得到复合前药纳米载体的水溶液。然后将复合前药纳米载体冻干，得到粉末状固体。将该产物以较低浓度(0.1mg/ml)分散在水中，用动态激光光散射仪测定的复合前药纳米载体的粒径分布在102nm左右，其多分散性为0.035。tem照片显示复合前药纳米载体的平均粒径为95nm，呈球形，分散均匀。
实施例4：
称取100mg聚n-羟乙基丙烯酰胺-聚乙二醇共聚物，将聚n-羟乙基丙烯酰胺中的羟基修饰成羧基，然后与20mg的紫杉醇反应，得到通过酯键与紫杉醇连接的大分子前药，聚(n-羟乙基丙烯酰胺-紫杉醇)-聚乙二醇，其中修饰后的聚n-羟乙基丙烯酰胺与阿霉素的偶联率为84％。
取1mg的粒径为20nm的超顺磁性纳米颗粒znfe2o4和5mg的大分子前药聚(n-羟乙基丙烯酰胺-紫杉醇)-聚乙二醇，加入5ml的四氢呋喃/二甲基亚砜＝8/2的混合溶液中，然后在超声作用下将混合溶液滴加入40倍体积的去离子水中，然后在去离子水中透析24小时，除掉有机溶剂得到复合前药纳米载体的水溶液。然后将复合前药纳米载体冻干，得到粉末状固体。将该产物以较低浓度(0.1mg/ml)分散在水中，用动态激光光散射仪测定的复合前药纳米载体的粒径分布在149nm左右，其多分散性为0.029。tem照片显示复合前药纳米载体的平均粒径为132nm，呈球形，分散均匀。
实施例5：复合前药纳米载体在体外对多种耐药肿瘤细胞株的增殖抑制作用
选用顺铂作为化疗药物的模型，按照实施例1制备复合前药纳米载体。选用多种耐药细胞株：a549、a549/ddp、skov3、skov3/ddp作为体外的耐药逆转模型。各细胞株的起始浓度为1×106个/ml，于96孔板内培养24小时后，按照药物以5μg/ml的浓度梯度加入各细胞组，在37℃下培养细胞48小时作为对照。实验组则采用复合前药纳米载体，先静止培养24小时，然后在磁场作用下培养5分钟，再在37℃条件下培养24小时。同一时间测得对照组和实验组的细胞凋亡情况，以对照组的凋亡率为作为基准，算出实验组的细胞凋亡率与对照组相比的倍增率。
实施例6：复合前药纳米载体在体内对耐药性肿瘤的抑制作用
以4-6周大的裸鼠为实验对象，在腹部皮下注入1×106个mcf-7/adr，待肿瘤长到150mm3大小，随机分组，每组12只，以此作为的耐药肿瘤模型。选用对应的阿霉素作为药物模型，按照实施例2制备相关复合前药纳米载体。
采用尾静脉注射的方式给药，阴性对照选用生理盐水，阳性对照组1为阿霉素，阳性对照组2为内载了阿霉素的原位磁热温敏靶向纳米药物载体，材料组为复合前药纳米载体，各组的阿霉素的用量均以阳性对照组1的阿霉素用量为准。每天给药一次，注射后2小时，四组均接受磁场作用30分钟，材料组和阳性对照组2均可在磁场作用下升温。红外表明，材料组和阳性对照组2都会造成非肿瘤部位的升温，但是材料组更倾向于在肿瘤部位升温，同时有创测温也表明，材料组的热疗温度比阳性对照组2更高。此外药物的体内分布研究表明，复合前药纳米载体介导的肿瘤热化疗，药物在肿瘤部位集中程度更高，在其他主要脏器中的分布明显少于阳性对照组1和2。在给药的第0天、3天、6天、10天、15天、20天、30天这七个时间点对比测定肿瘤大小变化，以及裸鼠的存活情况。实验结果显示，材料组和阳性对照组1&2的肿瘤体积均出现缩小，但是材料组肿瘤体积缩小更明显，而阴性对照组的肿瘤体积明显增大。从第6天开始，阴性对照组与阳性对照组1&2和材料组对比，具有统计学差异，p﹤0.05；从第10天开始，阴性对照组与阳性对照组1&2和材料组对比具有极显著的统计学差异p﹤0.01；从第15天开始，材料组与阳性对照组1具有统计学差异，p﹤0.05；从第20天开始，材料组和阳性对照组2具有显著的统计学差异，p﹤0.05；到第30天，材料组和阳性对照组2具有极显著的统计学差异，p﹤0.01。
上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围。