背景技术：
冠状病毒(coronavirus，cov)为有包膜的单股正链rna病毒，可引起动物和人的呼吸道、消化道和神经系统的感染，是一种重要的人兽共患病病毒。根据冠状病毒的进化特点，国际病毒分类委员会第九次报告将其分为α、β、γ以及δ四个群。其中，α与β群冠状病毒主要感染哺乳动物，γ与δ群冠状病毒主要感染禽类。
冠状病毒能感染人及多种动物，并可导致人罹患从普通感冒到严重的急性呼吸综合征等疾病。目前已知的能感染人的冠状病毒有六种，包括引起上呼吸道感染症状普通感冒的人冠状病毒229e(hcov-229e)、nl63(hcov-nl63)、hku1(hcov-hku1)、oc43(hcov-oc43)以及能导致重症呼吸道疾病的严重急性呼吸道综合症冠状病毒(severeacuterespiratorysyndromecoronavirus，sars-cov)和中东呼吸综合征冠状病毒(middleeastrespiratorysyndromecoronavirus，mers-cov)。其中，两种高致病性的冠状病毒sars-cov和mers-cov均属于β群冠状病毒，该群病毒还包括hcov-hku1、hcov-oc43以及作为人肝炎和肝脂肪变性和亚急性中枢系统病理重要动物模型的病原小鼠肝炎病毒(murinehepatitisvirus，mhv)等；引发的疾病症状较轻的hcov-229e、hcov-nl63属于α群冠状病毒。值得关注的是，虽然冠状病毒是引起人类急性呼吸道感染的常见病原体之一，但是，目前尚无批准的特异性药物治疗冠状病毒引起的感染，即使针对由sars-cov和mers-cov感染引起的严重急性呼吸道患者，临床也主要以对症治疗减少患者并发症为主。因此，亟需研制有效的药物来治疗冠状病毒引起的感染。
单克隆抗体、多肽和小分子化合物通常是抗病毒药物研究的热点，通过对fda已批准的药物库进行高通量筛选，探讨已有药物的新用途，已成为药物研发的一种重要途径。由于如候选药物已具有关于药理药效测试、功能靶点以及临床安全性等资料，有利于进一步的毒理学评价、药代动力学评价和制剂研发等，可以大大减少研发风险、缩短研发时间和研发成本，有着广阔的应用前景。针对mers-cov的抗病毒药物研究表明，将干扰素α-2b(interferonalfa-2b)和利巴韦林(ribavirin)联合用药能够抑制体外培养细胞内的mers-cov的复制，并能减少肺部病毒载量以及减轻宿主的免疫反应，且这种联合疗法可提高患者14天生存率。然而，该联合疗法可能只对某些早期诊断的患者有效，对具有严重感染并含有多种并发症的晚期诊断病人无效。新近的研究发现，治疗埃博拉病毒感染的核酸类似物前体药物gs-5734具有广谱抗病毒活性，也能够在体外细胞培养模型中抑制mers-cov的复制，为mers的治疗提供了一个新的方向。此外，mers-cov特异性多肽抑制剂、氯喹、氯丙嗪、霉酚酸和硝唑尼特等广谱药物也能够抑制病毒复制，但在临床上是否有效，需进一步确认。
麦考酚酸(mycophenolicacid，mpa)，也称霉酚酸，是由青霉属菌株产生的抗真菌、抗肿瘤并具免疫抑制作用的抗生素；麦考酚酸的2-乙基酯类衍生物——吗替麦考酚酯(mycophenolatemofetil，mmf)，也称霉酚酸酯，是瑞士罗氏(roche)公司研发的一种新型免疫抑制剂，于1995年首次在美国上市，商品名为骁悉(cellcept)，在体内脱酯化后形成具有免疫抑制活性的代谢产物麦考酚酸，通过抑制嘌呤核苷酸从头合成途径的关键限速酶——次黄嘌呤核苷磷酸脱氢酶，减少鸟嘌呤核苷酸的合成，因而能选择性抑制与排斥反应有关的t、b淋巴细胞的增殖和功能，主要用于肾脏、心脏移植后器官排斥的预防。
研究表明，麦考酚酸具有广谱抗病毒活性，可以在体外有效抑制包括西尼罗病毒、黄热病毒、基孔肯雅热病毒、丙型肝炎病毒以及mers-cov的感染。mers-cov抗病毒药物高通量筛选研究发现，麦考酚酸的半数有效浓度(concentrationfor50％ofmaximaleffect，ec50)为0.24um，半数细胞毒性浓度(concentrationcytotoxicity50％，cc50)为170um，选择指数(slectivityindex，si，si＝cc50/ec50，si＞1为有效)高达708(chanjf，chankh，kaory，etal.broad-spectrumantiviralsfortheemergingmiddleeastrespiratorysyndromecoronavirus.jinfect，2013，67，606-616.)。比较mers-cov对抗病毒药物(麦考酚酸和利巴韦林)以及不同ifn产品的敏感性的研究发现，ifn-β显示出对mers-cov最强的体外抑制活性，ec50为1.37u/ml；利巴韦林在当前治疗方案的剂量下并未表现出病毒抑制活性；相比之下，麦考酚酸表现出较强的抑制作用，ec50为2.87μmol/l(hartbj，dyallj，postnikovae，etal.interferon-βandmycophenolicacidarepotentinhibitorsofmiddleeastrespiratorysyndromecoronavirusincell-basedassays.jgenvirol，2014，95，571-577)。上述研究提示，麦考酚酸和ifn-β单用或联合使用可能对mers-cov感染者或作为高暴露人群的干预治疗发挥更好的作用。但是，目前尚未见麦考酚酸和吗替麦考酚酯作为广谱抗冠状病毒的药物的研究。
基于上述分析，本发明以β群冠状病毒(hcov-oc43、mers-cov和mhv-a59)以及α群冠状病毒(hcov-nl63)作为模式病毒，通过体外抗病毒效果研究，探讨麦考酚酸及其衍生物吗替麦考酚酯在制备广谱抗冠状病毒药物中的应用的可能性，发现麦考酚酸及其衍生物吗替麦考酚酯能在体外显著抑制β群冠状病毒hcov-oc43、mers-cov、mhv-a59以及α群冠状病毒hcov-nl63的复制，对于冠状病毒感染的防控和治疗具有重要意义。
技术实现要素：
本发明提供了一种麦考酚酸及其衍生物吗替麦考酚酯在制备广谱抗冠状病毒药物中的新应用，证实了麦考酚酸及其衍生物吗替麦考酚酯能在体外细胞模型中有效抑制β群冠状病毒hcov-oc43、mers-cov、mhv-a59以及α群冠状病毒hcov-nl63的核酸复制，为进一步开发广谱抗冠状病毒的药物奠定了基础。
附图说明
图1为麦考酚酸及其衍生物吗替麦考酚酯的化学分子结构示意图。图1a为麦考酚酸的化学分子结构示意图，图1b为吗替麦考酚酯的化学分子结构示意图。
图2为不同浓度麦考酚酸及其衍生物吗替麦考酚酯对四种冠状病毒抗病毒效果。
图2a为不同浓度麦考酚酸对对hcov-noc43病毒复制的抑制效果。横坐标为麦考酚酸的药物浓度，纵坐标为抑制率，其中方框深色点拟合的曲线表示对hcov-oc43的病毒复制抑制效率，圆形实心点拟合的浅色曲线表示对bhk-21细胞活性的抑制效率。结果显示，麦考酚酸在bhk-21细胞中可有效抑制hcov-oc43的病毒复制，使moi＝0.01剂量的hcov-oc43病毒复制效率受到50％抑制的药物半数有效浓度ec50为1.65um。
图2b为不同浓度麦考酚酸对对hcov-nl63病毒复制的抑制效果。横坐标为麦考酚酸的药物浓度，纵坐标为抑制率，其中方框深色点拟合的曲线表示对hcov-nl63的病毒复制抑制效率，圆形实心点拟合的浅色曲线表示对llc-mk2细胞活性的抑制效率。结果显示，麦考酚酸在llc-mk2细胞中可有效抑制hcov-nl63的病毒复制，使moi＝0.01剂量的hcov-nl63病毒复制效率受到50％抑制的药物半数有效浓度ec50为0.18um。
图2c为不同浓度麦考酚酸对mers-cov病毒复制的抑制效果。横坐标为麦考酚酸的药物浓度，纵坐标为抑制率，其中方框深色点拟合的曲线表示对mers-cov的病毒复制抑制效率，圆形实心点拟合的浅色曲线表示对vero-e6细胞活性的抑制效率。结果显示，麦考酚酸在vero-e6细胞中可有效抑制mers-cov的病毒复制，使moi＝0.01剂量的mers-cov病毒复制效率受到50％抑制的药物半数有效浓度ec50为1.81um。
图2d为不同浓度麦考酚酸对mhv-a59病毒复制的抑制效果。横坐标为麦考酚酸的药物浓度，纵坐标为抑制率，其中方框深色点拟合的曲线表示对mhv-a59的病毒复制抑制效率，圆形实心点拟合的浅色曲线表示对dbt细胞活性的抑制效率。结果显示，麦考酚酸在dbt细胞中可有效抑制mhv-a59的病毒复制，使moi＝0.01剂量的mhv-a59病毒复制效率受到50％抑制的药物半数有效浓度ec50为0.17um。
图2e为不同浓度吗替麦考酚酯对对hcov-noc43病毒复制的抑制效果。横坐标为吗替麦考酚酯的药物浓度，纵坐标为抑制率，其中方框深色点拟合的曲线表示对hcov-oc43的病毒复制抑制效率，圆形实心点拟合的浅色曲线表示对bhk-21细胞活性的抑制效率。结果显示，吗替麦考酚酯在bhk-21细胞中可有效抑制hcov-oc43的病毒复制，使moi＝0.01剂量的hcov-oc43病毒复制效率受到50％抑制的药物半数有效浓度ec50为1.45um。
图2f为不同浓度吗替麦考酚酯对对hcov-nl63病毒复制的抑制效果。横坐标为吗替麦考酚酯的药物浓度，纵坐标为抑制率，其中方框深色点拟合的曲线表示对hcov-nl63的病毒复制抑制效率，圆形实心点拟合的浅色曲线表示对llc-mk2细胞活性的抑制效率。结果显示，吗替麦考酚酯在llc-mk2细胞中可有效抑制hcov-nl63的病毒复制，使moi＝0.01剂量的hcov-nl63病毒复制效率受到50％抑制的药物半数有效浓度ec50为0.23um。
图2g为不同浓度吗替麦考酚酯对mers-cov病毒复制的抑制效果。横坐标为吗替麦考酚酯的药物浓度，纵坐标为抑制率，其中方框深色点拟合的曲线表示对mers-cov的病毒复制抑制效率，圆形实心点拟合的浅色曲线表示对vero-e6细胞活性的抑制效率。结果显示，吗替麦考酚酯在vero-e6细胞中可有效抑制mers-cov的病毒复制，使moi＝0.01剂量的mers-cov病毒复制效率受到50％抑制的药物半数有效浓度ec50为1.98um。
图2h为不同浓度吗替麦考酚酯对mhv-a59病毒复制的抑制效果。横坐标为吗替麦考酚酯的药物浓度，纵坐标为抑制率，其中方框深色点拟合的曲线表示对mhv-a59的病毒复制抑制效率，圆形实心点拟合的浅色曲线表示对dbt细胞活性的抑制效率。结果显示，吗替麦考酚酯在dbt细胞中可有效抑制mhv-a59的病毒复制，使moi＝0.01剂量的mhv-a59病毒复制效率受到50％抑制的药物半数有效浓度ec50为0.27um。
具体实施方式：
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社，2005)等本领域常用工具书中所述的条件，或按试剂生产厂家所建议的条件进行。
实施例1：麦考酚酸与吗替麦考酚酯的细胞毒性检测
本发明中涉及的四种冠状病毒hcov-oc43、hcov-nl63、mers-cov及mhva59的敏感细胞系分别是bhk-21、llc-mk2、vero-e6和dbt，为了测试麦考酚酸与吗替麦考酚酯的安全用药浓度，本研究使用mtt法检测了麦考酚酸与吗替麦考酚酯对这四种细胞系的毒性。检测原理是：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性mtt还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，dmso)能溶解细胞中的甲臜，用酶标仪在相应波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，mtt结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值(od值)来判断活细胞数量，od值越大，细胞活性越强，测药物毒性时则表示药物毒性越小。
具体操作如下：将bhk-21、llc-mk2、vero-e6和dbt四种细胞分别按照1×104细胞/孔接种于96孔培养板，用含10％胎牛血清的dmem培养16小时至80％成片；之后吸弃培养液，换成含2％胎牛血清的dmem培养基；麦考酚酸与吗替麦考酚酯购于北京禾秀诚生物科技有限公司，麦考酚酸来自selleck.cn，货号为s2487-50mg，纯度＞98％，吗替麦考酚酯购自sigma-aldrich公司，货号为y0000489，纯度＞98％；分别使用dmso溶解后，进一步用pbs稀释，将麦考酚酸与吗替麦考酚酯按终浓度为0.5um，2um，5um，10um加入细胞，每组浓度药物做三组平行，同时设置空白对照组和细胞对照组。放置于37℃，5％co2孵箱中继续培养72小时，每孔加入用pbs配制的5g/l的mtt溶液20μl，继续培养4h。之后小心地弃掉上清液，每孔用异丙醇100μl溶解沉淀物，并在96孔板振荡器上混匀30min，最后使用多功能酶标仪在570nm波长下测定其吸光度值。根据公式计算：细胞活性抑制率(％)＝(药物组-空白对照组)/(细胞对照组-空白组)×100％。以麦考酚酸与吗替麦考酚酯的药物浓度为横坐标，以细胞增殖抑制率为纵坐标，通过graphpadprism7软件计算平均值和标准差拟合曲线作图，将药物浓度转换为对数值后计算麦考酚酸与吗替麦考酚酯的细胞毒性cc50。结果如图2圆形实心点拟合的浅色曲线所示，麦考酚酸在bhk-21、llc-mk2、vero-e6和dbt细胞中的cc50分别为4.55um、5.04um、4.15um和5.37um；吗替麦考酚酯在bhk-21、llc-mk2、vero-e6和dbt细胞中的cc50分别为3.51um、4.30um、3.84um和4.45um。
实施例2：麦考酚酸与吗替麦考酚酯的体外抗冠状病毒活性效果检测
2.1病毒感染与药物作用
将bhk21、ccl-mk2、vero-e6和dbt细胞分别按照1×104细胞/孔接种于96孔培养板中，使用含10％胎牛血清的dmem培养16小时至80％成片；之后吸弃细胞培养液，换成含2％胎牛血清的dmem培养基；将麦考酚酸与吗替麦考酚酯按终浓度分别为0.5um，2um，5um，10um的剂量加入相应细胞孔内，同时设置相应不加药物的细胞对照孔和仅加病毒的病毒对照孔；加入药物后1小时内，分别于相应敏感细胞孔中以每孔10ul的体积加入hcov-oc43、hcov-nl63、mers-cov和mhv-a59，使病毒感染复数为0.01(multiplicityofinfection，moi＝0.01)，放置于37℃，5％co2孵箱中培养72小时后收集上清。
2.2荧光定量rt-pcr检测药物对hcov-oc43、hcov-nl63和mers-cov的抑制效果
使用绝对荧光定量方法rt-pcr方法检测hcov-oc43、hcov-nl63和mers-cov相应病毒靶基因转录水平以便反应出病毒的复制水平。按照qiagenviralrnaminikit说明书提取病毒rna，提取病毒rna后进行rt-pcr检测。其中，检测各病毒的引物探针序列如下：
检测hcov-oc43的引物探针序列如下：
上游引物序列(q-oc43-f)为：5’-gctcaggaaggtctgctcc-3’，
下游引物序列(q-oc43-r)为：5’-tcctgcactagaggctctgc-3’，
探针序列(q-oc43-probe)为：5’-ttccagatctacttcgcgcacatcc-3’。
检测hcov-nl63的引物探针序列如下：
上游引物序列(q-nl63-f)为：5’-aggaccttaaattcagacaacgttct-3’，
下游引物序列(q-nl63-r)为：5’-gattacgtttgcgattaccaagact-3’，
探针序列(q-nl63-probe)为：5’-aacagttttagcaccttccttagcaacccaaaca-3’。
检测mers-cov的引物探针序列如下：
上游引物序列(q-mers-f)为：5’-ggcactgaggacccacgtt-3’，
下游引物序列(q-mers-r)为：5’-ttgcgacatacccataaaagca-3’，
探针序列(q-mers-probe)为：5’-ccccaaattgctgagcttgctcctaca-3’。
反应体系为：12.5μl2×onestepsybrrt-pcrbufferiii、0.5μltakaraextaqhs、0.5μlprimescriptrtenzymemixii、1.5μl上游引物、1.5μl下游引物、2μlrna模板，并用无菌双蒸水补至25μl。反应参数为：42℃5min、95℃10s一个循环；95℃5s、60℃30s，循环40次，延伸后采集荧光信号。每个样品做3个重复，最后统计样品ct值，将所测得样品ct值代入标准曲线后计算出样品中的病毒拷贝数。根据公式计算：病毒复制抑制率(％)＝(病毒对照组-药物照组)/病毒对照组×100％。
2.3空斑减少抑制试验检测麦考酚酸与吗替麦考酚酯对mhv-a59病毒的抑制效果
使用空斑减少试验测定药物对mhv-a59病毒的复制抑制效果。将dbt按照1×105细胞/孔的量接种于6孔培养板中，使用含10％胎牛血清的dmem培养基培养16小时至80％成片；之后吸弃细胞培养液，换成含2％胎牛血清的dmem培养基；将麦考酚酸与吗替麦考酚酯按照终浓度分别为0.5um，2um，5um，10um的剂量加入相应细胞孔内，同时设置相应不加药物的细胞对照孔和仅加病毒的病毒对照孔；加入药物后1小时内，每孔加入10ul稀释好的病毒mhv-a59贮存液体，使病毒moi＝0.01，放置于37℃，5％co2孵箱中培养72小时后收集上清，使用空斑减少试验测定药物对病毒的复制抑制效果，将收集的上清液按照不同稀释度感染dbt细胞，72h后吸弃上清，4％多聚甲醛固定后使用结晶紫染色，计数孔板，根据公式计算：病毒复制抑制率(％)＝(病毒对照组-药物照组)/病毒对照组×100％。
2.4拟合曲线与计算ec50
以麦考酚酸与替麦考酚酯的浓度为横坐标，以病毒复制抑制率为纵坐标，通过graphpadprism7软件计算抑制效率的平均值和标准差拟合曲线作图，将药物浓度转换成对数后计算麦考酚酸及其衍生物吗替麦考酚酯的ec50，结果如图2方框深色点拟合的曲线所示。麦考酚酸对hcov-oc43、hcov-nl63、mers-cov和mhv-a59四种冠状病毒的抑制效果分别见图2a、2b、2c和2d；吗替麦考酚酯对hcov-oc43、hcov-nl63、mers-cov和mhv-a59四种冠状病毒的抑制效果分别见图2e、2f、2g和2h。如图2a所示，麦考酚酸在bhk-21细胞中可有效抑制hcov-oc43的复制，使moi＝0.01的hcov-oc43复制效率50％抑制的药物半数有效浓度ec50为1.65um；如图2b所示，麦考酚酸在llc-mk2细胞中可有效抑制hcov-nl63的复制，使0.01moi的hcov-nl63复制效率50％抑制的药物半数有效浓度ec50为0.18um；如图2c所示，麦考酚酸在vero-e6细胞中可有效抑制mers-cov的复制，使moi＝0.01的mers-cov复制效率50％抑制的药物半数有效浓度ec50为1.81um；如图2d所示，麦考酚酸在dbt细胞中可有效抑制mhv-a59的复制，使moi＝0.01的mhv-a59复制50％抑制的药物半数有效浓度ec50为0.17um。如图2e所示，吗替麦考酚酯在bhk-21细胞中可有效抑制hcov-oc43的复制，使moi＝0.01的hcov-oc43复制效率50％抑制的药物半数有效浓度ec50为1.45um；如图2f所示，吗替麦考酚酯在llc-mk2细胞中可有效抑制hcov-nl63的复制，使0.01moi的hcov-nl63复制效率50％抑制的药物半数有效浓度ec50为0.23um；如图2g所示，吗替麦考酚酯在vero-e6细胞中可有效抑制mers-cov的复制，使moi＝0.01的mers-cov复制效率50％抑制的药物半数有效浓度ec50为1.98um；如图2h所示，吗替麦考酚酯在dbt细胞中可有效抑制mhv-a59的复制，使moi＝0.01的mhv-a59复制50％抑制的药物半数有效浓度ec50为0.27um。