本发明涉及生物医药领域，具体涉及盐酸青藤碱在促进系膜细胞凋亡中的应用。
背景技术：
青风藤是一种常用中药,在我国药源丰富。青藤碱(sinomenine，sin)是从青风藤中提取的生物碱单体，药用多为其盐酸盐。研究表明，盐酸青藤碱具有较强的抗炎、镇痛、免疫抑制、降压、抗心律失常等药理作用，是一种抗炎止痛效果好、副作用小的非甾体抗炎止痛药。现广泛应用于治疗类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等多种炎性、自身免疫性疾病，取得较好的临床疗效。目前已有正清风痛宁片、正清风痛宁注射液、毛青藤总碱片等制剂应用于临床，用于治疗各种风湿关节疼痛等各种风湿病及抗心律失常。
自噬(autophagy)是胞浆大分子物质和细胞器在膜包囊泡中降解的生物学过程，可以分成4个阶段：各种因素对自噬的诱导，来源于内质网的双层膜结构对被降解物进行包裹形成自噬体，自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，最终自噬体在溶酶体内被分解为其组成成分，供细胞再利用。因此，自噬被认为是真核细胞中广泛存在的降解/再循环系统。自噬对维持细胞健康存活有着积极的一面，如在生理状态下，清除老化的蛋白质、受损的细胞器等，如在饥饿刺激下，降解长寿命蛋白质所产生的氨基酸等产物为新陈代谢提供必需的营养物质。然而，自噬作为3种已知的细胞死亡方式(坏死性死亡、凋亡性死亡和自噬性死亡)之一，它与细胞坏死和凋亡可能存在着密切而复杂的内在联系。过度的自噬也可能诱导细胞死亡，自噬在人类疾病发生发展过程中具有两面性。
研究发现，自噬与肾脏固有细胞处理各种应急的病理生理过程也存在着密切关系。肾脏固有细胞如足细胞、系膜细胞、内皮细胞以及肾小管上皮细胞等经常会受到免疫因子、肾毒物、缺血缺氧等各种理化因素的刺激，这些刺激往往会诱导细胞损伤，导致肾脏疾病的发生。系膜细胞在肾小球疾病的发生、发展中起了至关重要的作用。采用任何能维持系膜细胞增生、肥大和凋亡之间的平衡以及改善系膜基质代谢的干预措施是缓解或逆转肾小球疾病的关键。系膜细胞增多与系膜基质增多是糖尿病肾病共同病理变化，无论系膜细胞增生或萎缩，均伴随系膜细胞外蛋白的蓄积，导致肾小球的硬化。脂多糖(lipopolysaccharide，lps)是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，目前可以用于建立多种细胞(包括系膜细胞)的损伤模型，建立组织纤维化的模型。
目前，盐酸青藤碱在缓解系膜细胞自噬、增殖和纤维化，尤其是在缓解lps导致的系膜细胞自噬、增殖和纤维化中的应用，还未见在现有技术中披露。盐酸青藤碱的应用，为中西医联合治疗肾纤维化疾病提供了一条新的思路。
技术实现要素：
本发明针对现有技术的不足，提供盐酸青藤碱在促进系膜细胞凋亡中的应用。
本发明提供了盐酸青藤碱在制备用于促进系膜细胞凋亡的药物中的用途。
本发明提供了盐酸青藤碱和自噬抑制剂的组合在制备用于促进系膜细胞凋亡的药物中的用途。
本发明提供了盐酸青藤碱在制备用于治疗肾脏纤维化的药物中的用途。
本发明提供了盐酸青藤碱和自噬抑制剂的组合在制备用于治疗肾脏纤维化的药物中的用途。
本发明提供了盐酸青藤碱在制备用于缓解lps导致的系膜细胞自噬、增殖和/或纤维化的药物中的用途。
本发明提供了盐酸青藤碱和自噬抑制剂的组合在制备用于缓解lps导致的系膜细胞自噬、增殖和/或纤维化的药物中的用途。
在一个方面中，所述自噬抑制剂选自3-甲基腺嘌呤(3-ma)。
本发明提供了一种药物组合物，其包含盐酸青藤碱和药学上可接受的载体。
在一个方面中，所述药物组合物还包含自噬抑制剂；优选的，所述自噬抑制剂选自3-甲基腺嘌呤(3-ma)。
在一个方面中，所述盐酸青藤碱的浓度为1-10mm；优选的，浓度为5mm。
在一个方面中，所述自噬抑制剂的浓度为1-5mm；优选的，浓度为2mm。
在一个方面中，所述药物组合物可根据常规方法制成药物制剂。制剂过程中，优选将所述的盐酸青藤碱与药学上可接受的载体混合或用载体稀释。
本发明的积极效果包括：本发明研究盐酸青藤碱缓解系膜细胞自噬、增殖、纤维化的生物调控机制，利用lps诱导系膜细胞自噬，这在现有技术中鲜有报道。在lps诱导系膜细胞自噬、增殖、纤维化的模型实验中，盐酸青藤碱能够缓解、降低或逆转系膜细胞的自噬，从而促进系膜细胞的凋亡。盐酸青藤碱和自噬抑制剂的组合，能够更加促进系膜细胞的凋亡。本发明中盐酸青藤碱的应用，以及盐酸青藤碱和自噬抑制剂组合的应用，为中西医联合治疗肾脏纤维化疾病提供研究基础，具有良好的临床应用前景。
附图说明
图1：肾脏组织的he、pasm及masson染色图片。
图2：肾脏组织的免疫组化图片。
图3：westernblot检测smad2/3、p-smad2/3、纤维连接蛋白(fibronectin，fn)、层粘连蛋白(laminin，ln)、beclin-1、bnip3、lc3βii/i的结果图。
图4：系膜细胞自噬染色检测试剂盒(mdc法)。
图5：系膜细胞荧光染色，激光共聚焦检测lc3β与线粒体的共定位的结果图。
图6：线粒体自噬的透射电镜图片。
具体实施方式
下述实验方法中所用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。在不背离本发明精神的情况下，本领域技术人员结合公知技术，可以对本发明做出诸多修改，这样的修改也落入本发明的保护范围之内。
实施例1、筛选细胞自噬抑制剂
一、主要实验材料
小鼠的血清、肾脏组织。可以在实验前现场分离提取(提取方法属于本领域的常规实验操作)，也可以从商业公司购买。
二、实验设置
设置不同的组别(对照组、模型组、药物组)：
(1)正常对照组；
(2)阿霉素模型组；
(3)iga模型组；
(4)阿霉素模型药物治疗组；
(5)iga模型药物治疗组；
三、实验方法
取肾脏组织，切成0.5cm3的小块，与血清按质量比1：5混合，置于培养皿中，备用。
正常对照组，使用生理盐水处理血清、肾脏组织。模型组分别使用阿霉素和iga处理血清、肾脏组织，添加的浓度为10μm，37℃下处理48h。之后，药物治疗组在已经完成的模型组的基础上，根据实验情况添加所筛选的药物，添加的浓度根据各自的情况调整为1μm～10mm，37℃下处理48h。
各组实验均完成后，收集各组中的血清、肾脏组织，准备进行下一步的检测。
实施例2、检测细胞自噬抑制剂
一、elisa检测(5组×1个指标)
采用elisa方法检测各组血清中tgf-β1的水平。
二、westernblot检测(5组×3个指标)
取各组肾脏组织，匀浆，提取总蛋白，westernblot检测肾脏纤维化的相关指标，纤维连接蛋白(fibronectin，fn)、层粘连蛋白(laminin，ln)，及自噬相关蛋白lc3βii/i的水平。
三、肾组织病理检测(5组×3个指标)
取各组肾脏组织，分离肾皮质，用10％甲醛固定，石蜡包埋，采用he、pasm及masson分别染色，制成薄切片用于光镜检查。
结果如图1所示，正常对照组中肾脏组织可见肾小球结构清晰完整，球囊比例正常，肾小球毛细血管无受压，肾小球内未见系膜细胞增生和系膜基质增多；肾小管排列有序，小管上皮细胞无异常。模型组则出现肾小球毛细血管球扩张，系膜细胞增生，系膜基质明显增多，局部毛细血管结构塌陷；肾小管排列紊乱，囊性扩张，小管上皮细胞变性，基底膜增厚。与模型组比较，药物治疗组中肾脏组织损伤均有不同程度的减轻。
四、免疫组化检测(5组×1个指标)
取各组肾脏组织，分离肾皮质，用10％甲醛固定，石蜡包埋，二甲苯脱蜡，高压热修复，降至室温，pbs冲洗后，行lc3β免疫组化染色，显微镜下观察目标出现阳性后，苏木素复染细胞核，氨水返蓝，中性树胶封片，图像采集，图像分析，以免疫组织化学染色阳性信号累积光密度作为组织表达的定量标准。
结果如图2所示，相对对照组(定量参考值为1100)，模型组自噬水平上升(定量参考值为2400)，经药物治疗后缓解(定量参考值为1400)。
五、实验结果
相比对照组，模型组的tgf-β1及纤维化、自噬相关标志分子水平上调，经所筛选的试剂或药物治疗后，得以缓解。根据上述结果，选择模型组水平上调，药物治疗得以缓解最明显的模型，即iga模型组/iga模型药物治疗组中的3-甲基腺嘌呤(3-ma)，进行下一步的细胞水平机制研究。
实施例3、盐酸青藤碱抑制细胞自噬实验
一、主要实验材料
小鼠肾脏系膜细胞，盐酸青藤碱，tgf-β1受体抑制剂ly-2157299，自噬抑制剂3-ma，tgf-β1elisa检测试剂盒，smad2/3、p-smad2/3、mmp-2、i型、iii型和iv型胶原蛋白，以及自噬相关蛋白beclin-1，lc3ii/i的westernblot检测一抗，cck-8检测试剂盒等。
二、实验设置
设置不同的组别(对照组、模型组、药物组)：
(1)正常对照组；
(2)lps模型组；
(3)lps模型+tgf-β1受体抑制剂(ly-2157299，1μm)组；
(4)lps模型+盐酸青藤碱组；
(5)lps模型+自噬抑制剂(3-ma，2mm)组；
(6)lps模型+盐酸青藤碱+自噬抑制剂(3-ma，2mm)组。
三、实验方法
将系膜细胞接种于10％胎牛血清的dmem培养基中，于37℃、5％co2中培养，取处于对数增殖期的细胞进行实验。系膜细胞接种于6孔板中，备用。
正常对照组，使用生理盐水处理系膜细胞。lps模型组使用lps处理系膜细胞，添加的浓度为20μg/ml，37℃下处理48h。之后，各药物治疗组在已经完成的模型组的基础上，添加所需药物，添加的浓度根据各自的情况调整为相应的浓度，37℃下处理48h。
各组实验均完成后，收集各组中的培养基、系膜细胞，准备进行下一步的检测。
实施例4、检测盐酸青藤碱抑制细胞自噬
一、elisa检测tgf-β1的水平(6组×1个指标)
采用elisa方法检测各组培养基中tgf-β1的水平。
由结果可知，lps模型组中tgf-β1上调，增长117±10％；此趋势可被盐酸青藤碱缓解，tgf-β1只增长30±5％；tgf-β1受体抑制剂引起tgf-β1的代偿性增高，tgf-β1增长182±12％；自噬抑制剂3-ma对tgf-β1的影响较小，tgf-β1只增长10±1％。
二、westernblot检测(6组×9个指标)
收取各组细胞，提取细胞总蛋白，westernblot检测smad2/3、p-smad2/3、肾脏纤维化相关指标纤维连接蛋白(fibronectin，fn)、层粘连蛋白(laminin，ln)，以及线粒体自噬相关蛋白beclin-1、bnip3、lc3βii/i的水平。
结果如图3所示，在lps模型组中，上述指标均上调；此趋势可被tgf-β1受体抑制剂(ly-2157299)缓解或逆转；此趋势也可被盐酸青藤碱缓解或逆转，其表明具有治疗作用；自噬抑制剂3-ma可逆转噬相关蛋白beclin-1、bnip3、lc3βii/i的水平以及纤维化相关蛋白的水平，但是对tgf-β1、smad2/3、p-smad2/3上游分子，可能无影响。
三、细胞增殖和活性检测(6组×1个指标)
收取各组细胞，使用cck-8试剂盒测定细胞增殖和活性。
由结果可知，lps模型组中系膜细胞增殖活性上调，细胞数量增加69±9％；tgf-β1受体抑制剂(ly-2157299)组中，细胞数量增加51±9％；盐酸青藤碱组中，细胞数量增加22±5％；自噬抑制剂3-ma组中，细胞数量增加36±7％；联合处理组中，细胞数量增加9±1％。
可见，系膜细胞的增殖趋势可被tgf-β1受体抑制剂(ly-2157299)、盐酸青藤碱、自噬抑制剂3-ma缓解或逆转，而联合处理组的效果更甚。
四、实验结果
根据以上分子检测结果和细胞检测结果可以判断，盐酸青藤碱能够通过tgf-β1-smad2/3-bnip3线粒体自噬通路缓解系膜细胞增殖、纤维化。
实施例5、线粒体自噬检测细胞自噬
一、细胞自噬染色检测试剂盒(mdc法)检测以及凋亡检测(6组×2个指标)
单丹磺酰尸胺(dansylcadaverine，mdc)是一种荧光色素，是嗜酸性染色剂，通常被用于检测自噬体形成的特异性标记染色剂，其检测激发滤光片波长355nm。阻断滤光片波长512nm。参考说明书进行自噬染色，同时利用hoechst33258染色细胞核，根据细胞核是否呈致密浓染，判定细胞是否发生凋亡。
结果如图4所示，第一行为正常对照组，第二行lps模型组促进自噬，第三行药物实验组则降低自噬。其中，盐酸青藤碱和3-ma最能缓解自噬，促进凋亡。
二、lc3β与线粒体共定位观察(6组×3个指标)
将系膜细胞置于6孔的共聚焦小皿内，用anti-lc3β、mitotrackerred、hoechst33258分别对自噬标志蛋白、线粒体和细胞核进行荧光染色，激光共聚焦检测lc3β与线粒体的共定位情况。
结果如图5所示，第一行为空白对照组，第二行lps模型组可使自噬体增加且与红色的线粒体有更多的共定位现象，第三行药物实验组则降低自噬，减少共定位，同时可能因为自噬被抑制，细胞自我保护技能减弱，线粒体荧光减弱(线粒体功能降低)，促进凋亡，其表明具有治疗效果。
三、透射电镜观察线粒体自噬(6组×1个指标)
系膜细胞经戊二醛固定，四氧化锇固定，逐级脱水，浸透，包埋，切片，柠檬酸铅电子染色等步骤，制样，置于透射电镜下观察。
结果如图6所示，左图为正常对照组，黄色箭头为正常线粒体，右图为lps模型组，红箭头表示被自噬泡包裹的受损线粒体，药物实验组治疗后能够减弱线粒体自噬。