本发明涉及纳米硒负载利巴韦林，尤其是一种纳米硒负载利巴韦林及其制备方法与应用。
背景技术
流行性感冒是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染性疾病，临床症状表现为高烧、全身酸痛等多种症状。甲型流感病毒经常发生抗原性漂移或抗原性转变，传染性强，传播迅速，极易发生大范围流行。2009年初，墨西哥和美国相继爆发的甲型h1n1流感迅速蔓延至多个国家和地区，给人类健康造成了极大危害，全球已有214个国家报告甲型h1n1流感病例，共计近两万人死亡，该毒株已成为人际间传播的主要流行性毒株之一。
巴韦林(ribavirin,rbv)又名病毒唑、三氮唑核苷，是一种合成的核苷类似物，通过三氮唑核苷-5’-单磷酸抑制次黄苷单磷酸脱氢酶，进而抑制细胞尿苷三磷酸(gmp)的生物合成，最终抑制病毒复制，发挥抗流感病毒等多种呼吸道病毒的作用。
硒是人体必需微量元素，在生物体内主要以硒蛋白的形式发挥生物功能和参与各种生理环节。硒和硒蛋白参与病毒性疾病发生发展的作用机制也是人们当前感兴趣的研究热点。研究表明硒参与许多病毒感染的发生和发展过程，宿主细胞内的硒含量会影响许多入侵病毒的突变、复制和毒力。硒的缺失会引起一些rna病毒(如柯萨奇病毒b3、aids、甲型流感病毒、非典型性肺炎冠状病毒和埃博拉病毒)基因组突变的积累，导致与病毒毒力相关的基因结构发生变化。纳米颗粒拥有小尺寸效应、表面效应和宏观量子隧道效应等优良特性，由于其特殊的物理化学性质，作为药物的转运载体时，可将药物包裹在内部，减少药物进入体内后发生降解、水解及氧化还原反应，增强药物的稳定性。
近年来，随着纳米技术的发展、多学科的交叉渗透和新型纳米制剂的发现，纳米硒的研制及其在生物医学领域中的应用引起了研发人员的关注。大量文献报道修饰或未经修饰的纳米硒可负载抗肿瘤药物，促进药物进入细胞并增强药物的生物活性，达到更强的抗肿瘤效果。
目前关于纳米硒负载利巴韦林在抑制h1n1流感病毒感染中的应用未见报道。
技术实现要素：
本发明的目的之一是提供一种可以抑制h1n1流感病毒感染的纳米硒负载利巴韦林。
本发明的目的之二是提供上述纳米硒负载利巴韦林的制备方法。
本发明的目的之三是提供上述纳米硒负载利巴韦林的应用。
本发明的目的之一通过下述技术方案实现：一种纳米硒负载利巴韦林，维生素c、亚硒酸钠和利巴韦林按质量比为0.5-1.5:0.5-1.5:0.5-0.8制备而成。
本发明的目的之二通过下述技术方案实现：一种如上所述的纳米硒负载利巴韦林的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：将维生素c溶液与亚硒酸钠溶液于透析袋中混合，搅拌，置于水中进行透析，得纯化后纳米硒溶液；
步骤2：将所述的纳米硒溶液中，加入利巴韦林溶液，搅拌，离心弃上清，将沉淀冷冻干燥，即得。
其中，所述步骤1中维生素c溶液的浓度为400μg/ml；亚硒酸钠溶液的浓度为400μg/ml。所述步骤2中利巴韦林溶液的浓度为200μg/ml。
其中，所述维生素c溶液、亚硒酸钠溶液和利巴韦林溶液的体积比为1:40:1。
其中，所述步骤1的搅拌速度为200-300rpm，搅拌时间为0.5-1h。所述步骤2的搅拌速度为200-300rpm，搅拌时间为0.5-1.5h。所述步骤2的离心速度为8000-12000rpm，离心时间为15-30min。
其中，所述步骤1中维生素c溶液和亚硒酸钠溶的混合方式为：将维生素c溶液逐滴加入到亚硒酸钠溶液中；混合时的温度为23℃-27℃。
本发明的目的之三通过下述技术方案实现：一种如上所述的纳米硒负载利巴韦林应用于制备抑制h1n1流感病毒感染的药物。
本发明相对于现有技术，具有以下优点：
本发明通过在h1n1流感病毒感染mdck细胞后，于细胞培养液中加入前述的纳米硒负载利巴韦林体系，发现加入该发明的纳米体系的mdck细胞较未加入者具有更高的细胞存活率，且培养液中h1n1流感病毒滴度较未加入者降低，此结果证实纳米硒运载利巴韦林体系在细胞水平上证实可以体外抑制h11n流感病毒感染。
因为粒径比较小，纳米硒负载利巴韦林体系可以避开免疫系统到达最小的毛细血管，并且延长在血流中的停留时间；其次，纳米硒负载利巴韦林体经过修饰，提高利巴韦林克服生物体的屏障，高效达到靶点；其三，纳米硒提高了利巴韦林的溶解度和生物相容性，可以避开网状内皮系统的清除，具有更长的半衰期。
附图说明
图1为senps和se@rbv的透射电镜图；
图2为se@rbv体系的元素组成分析图；
图3为senps和se@rbv的粒径分布图；
图4为senps和se@rbv的电位分布图；
图5为se@rbv对mdck细胞存活率检测图；
图6为se@rbv处理后病毒滴度的改变图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何在本发明权利要求保护范围内所做的有限次修改，仍在本发明的权利要求保护范围内。
实施例1
(1)纳米硒体系制备及表征
将0.1ml400μg/ml维生素c溶液逐滴加入到4ml400μg/ml亚硒酸钠溶液中，磁力搅拌2小时，搅拌速度为200rpm；置于水中进行透析，得纯化后纳米硒溶液。取上述纳米硒溶液，加入200μg/ml的利巴韦林溶液1ml，磁力搅拌1h，搅拌速度为200rpm；反应后的溶液10000rpm离心30分钟，弃上清液，将沉淀冷冻干燥，即得纳米硒运载利巴韦林载药体系。
将纳米硒-利巴韦林用pbs缓冲液重悬后通过透射电镜观察形貌特征，通过粒度仪检测粒度、电位。结果详见图1-4：图中：senps表示纳米硒，se@rbv表示纳米硒负载的利巴韦林；
图1中a和b分别是senps和se@rbv的透射电镜图，从图中可以看出senps容易出现团聚，se@rbv比senps分散均匀。
图2是se@rbv体系的元素组成分析，从结果看出硒是主要元素，占了91.5％，而炭、氮和氧分别占7.2％、0.2％和1.1％，由此看出se@rbv具有较高纯度。
图3是senps和se@rbv的粒径分布，从图中可以看出senps平均粒径为100nm，se@rbv平均粒径为65nm，比senps粒径小，更容易进入细胞。
图4是senps和se@rbv的电位分布，从图中可以看出，senps的电位为-25mv，se@rbv的电位为-10mv，即se@rbv具有较好的稳定性。
(2)纳米硒运载利巴韦林对mdck细胞毒性测定
细胞存活率用mtt法进行测定。用0.25％胰酶消化mdck细胞，以4×104个/ml接种于96孔板中，每孔100μl。置37℃、5％co2培养箱培养24h后，加入h1n1病毒培养12h后，加入纳米硒溶液、利巴韦林溶液、纳米硒负载的利巴韦林各100μl，继续培养24h。加入5mg/mlmtt20μl/孔，37℃孵育5h后吸弃培养板孔中的液体，加入二甲基亚砜150μl/孔，振荡10min，紫色结晶物充分溶解后，测定各孔od570值。以对照组od570为100％，计算药物处理组细胞存活率。细胞存活率(％)＝(od570实验组/od570对照组)×100％。
结果详见图5，图中：control表示mtt法测正常细胞对照组，mock表示病毒感染后未作处理组，senps表示病毒感染细胞+senps组，rbv表示病毒感染细胞+利巴韦林组，se@rbv表示病毒感染细胞+se@利巴韦林组。
结果显示，mock的细胞存活率为48.4％，senps、rbv和se@rbv的细胞存活率分别为51.5％、73.8％和80.4％，即经se@rbv处理后细胞存活率显著提高。
(3)病毒毒力测定
mdck细胞以4×104个/ml接种于96孔板中，每孔100μl。置37℃、5％co2培养箱培养24h后，加入h1n1病毒培养12h后，加入纳米硒溶液、利巴韦林溶液、纳米硒负载的利巴韦林溶液各100μl，继续培养24h。收集含病毒的培养上清，用0.22μm滤膜过滤后，用dmem梯度稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-66个浓度，将病毒液按每孔100μl加入到细胞密度为1×104cells/ml的96孔板中，设置未作处理的正常mdck细胞对照组，将96孔板放置细胞培养箱中培养2h，弃上清用pbs洗3次，每孔加200μldmem细胞培养液，继续培养。在显微镜下观察细胞状态，运用reed-muench法计算病毒tcid50，即通过以下公式计算lgtcid50，从而得出tcid50的值，实验重复三次：
lgtcid50＝距离比×相邻稀释度对数之差+＞50％病变率的稀释度对数的绝对值
结果详见图6，图中：mock表示病毒感染后未作处理组，senps表示病毒感染细胞+senps组，rbv表示病毒感染细胞+利巴韦林组，se@rbv表示病毒感染细胞+se@利巴韦林组。
结果显示，mock、senps、rbv和se@rbv的上清病毒滴度分别为4.3、4.4、3.7和3.1，即经se@rbv处理后病毒滴度降低。
以上结果表明：经rbv修饰的纳米硒能有效运载sirna进入细胞并发挥高效的干扰作用，进而对抗病毒感染引起的细胞凋亡。该成果表明我们制备的纳米硒有望成为新型药物载体，协助药物更高效地发挥生物作用。