本发明属于生物医药技术领域，特别涉及骨架整合核苷类似物药物的功能性核酸及其衍生物、它们的制备方法和应用。
背景技术：
化疗过程中，肿瘤细胞产生耐药性是当今癌症治疗领域面临的一个巨大挑战(nat.rev.cancer2013,13,714-726.)。
导致肿瘤细胞产生耐药性的原因很多，如抗凋亡能力增强、药物泵出速率增加等(nat.rev.cancer2012,12,494-501.)。例如，化疗时肿瘤细胞为了逃避化疗药物的伤害，会过量表达抗凋亡蛋白，从而抑制化疗药物的抗肿瘤活性。此外，肿瘤细胞也可以上调药物转运蛋白的表达，转运蛋白具有将化疗药物泵出细胞外的能力，因而转运蛋白上调会降低肿瘤细胞内的药物浓度，从而降低药效。
为了解决肿瘤耐药性问题，目前主要采用基因和化疗联合治疗的方法，首先利用基因治疗逆转耐药相关基因的表达，使得肿瘤细胞恢复对化疗药物的敏感性，从而促使化疗药物有效抑制肿瘤增殖(proc.natl.acad.sci.u.s.a.2010,107,10737-10742.)。
然而，基因药物和化疗药物直接联合使用时存在一定的问题，包括：两者的血液半衰期都较短，基因在体内不稳定且细胞内摄效率低，缺乏肿瘤靶向性，具有潜在的毒副作用等(nat.rev.genet.2014,15,541-555.)。
为了改善上述问题，近年来科研人员尝试将纳米药物输送系统用于基因药物和化疗药物的协同递送(nat.nanotechnol.2011,6,658-667.)，这是因为纳米递送系统具有半衰期长、体内稳定性好、细胞摄取速度快而且副作用小等优点(nat.biotechnol.2016,34,414-418.)。到目前为止，科研工作者已发展了许多种类的纳米递送载体，如胶束(j.am.chem.soc.2016,138,10834-10837.)、脂质体(proc.natl.acad.sci.u.s.a.2010,107,10737-10742.)、以及核酸组装体(j.am.chem.soc.2013,135,18644-18650.)等。
尽管这些基于纳米载体的基因药物和化疗药物协同递送系统都经过精心设计，但由于基因药物和化疗药物两者理化性质差异较大，这些纳米协同递送系统仍然面临诸多挑战，包括：
(1)基因药物和化疗药物的亲疏水性往往差异较大，因此难以设计一个理想的纳米载体同时高效包载两种物质；
(2)基因药物和化疗药物在载体中的包载量和比例难以精准控制；
(3)基因药物和化疗药物的释放时间顺序难以精确调控。
上述困难会限制基因-化疗联合治疗在耐药肿瘤治疗中的应用。
技术实现要素：
本发明的第一目的是提供骨架整合核苷类似物药物的功能性核酸，实现基因药物和化学药物的联合输送，以解决现有联合输送技术中存在的问题，包括：(1)基因药物和化疗药物的亲疏水性往往差异较大，因此难以设计一个理想的纳米载体同时高效包载两种物质；(2)基因药物和化疗药物在载体中的包载量和比例难以精准控制；(3)基因药物和化疗药物的释放时间顺序难以精确调控。
本发明的第二目的是提供上述的骨架整合核苷类似物药物的功能性核酸的制备方法。
本发明的第三目的是提供一种基于上述骨架整合核苷类似物药物的功能性核酸的衍生物，实现骨架整合核苷类似物药物的功能性核酸在细胞内的高效递送。
本发明的第四目的是提供一种基于上述骨架整合核苷类似物药物的功能性核酸衍生物的制备方法，实现骨架整合核苷类似物药物的功能性核酸在细胞内的高效递送。
本发明的第五目的是提供一种骨架整合核苷类似物药物的功能性核酸及其衍生物在制备基于基因疗法、化学疗法联合治疗疾病的核酸类药物和化疗药物中的用途。
本发明的技术方案如下：
一种骨架整合核苷类似物药物的功能性核酸，其中，所述核苷类似物药物经过化学修饰后，通过替换功能性核酸中的天然核苷酸，被整合进入所述功能性核酸的骨架结构。
优选地，所述的核苷类似物药物化学修饰方法为核苷类似物药物经过亚磷酰胺修饰或者三磷酸修饰。
优选地，所述的核苷类似物药物经过化学修饰后，通过固相合成技术或者体外酶转录技术或者pcr扩增技术整合进入功能性核酸骨架。
优选地，通过调整被药物取代的天然核苷酸的数目实现基因与药物的比例精准可调，解决了基因药物和化疗药物在载体中的包载量和比例难以精准控制的问题。
优选地，所述的骨架整合核苷类似物药物的功能性核酸中的所述功能性核酸选自反义寡核苷酸(antisensedna)、小干扰rna(sirna)、信使rna(mrna)、微小rna(microrna)、长链非编码rna(lncrna)、小发夹rna(shrna)、用于基因编辑向导rna(sgrna等)、环状rna(circrna)中的一种，但不局限于这几种功能性核酸。
优选地，所述的骨架整合核苷类似物药物的功能性核酸，其中的核苷类似物药物选自下列药物中的一种:
嘌呤类似物，可以是巯嘌呤(mercaptopurine)、硫鸟嘌呤(tioguanine)、硫唑嘌呤(azathioprine)或8-氮杂鸟嘌呤(8-azaguanin)；
鸟苷类似物，可以是奈拉滨(nelarabine)或呋咯地辛(forodesine)；
胞苷类似物，可以是阿糖胞苷(cytarabine)、环胞苷(ancitabine)、吉西他滨(gemcitabine)、依诺他宾(enocitabine)、氮杂胞苷(5-azacytidine)或脱氧氮杂胞苷(decitabine)；
腺苷类似物，可以是氟达拉滨(fludarabine)、克拉屈滨(cladribine)、氯法拉滨(clofarabine)或阿卡地辛(acadesine)；
尿苷类似物，可以是氟尿嘧啶(fluorouracil)、卡莫氟(carmofur)、替加氟(tegafur)、脱氧氟尿苷(5'-deoxy-5-fluorouridine)、卡培他滨(capecitabine)或氟尿苷(floxuridine)。
但本发明的技术方案不局限于上述这几种核苷类似物药物。
本发明还提供一种上述的骨架整合核苷类似物药物的功能性核酸的制备方法，包括以下方法中的一种：
利用核苷类似物药物的亚磷酰胺单体，通过固相合成方法制备骨架整合核苷类似物药物的功能性核酸；或
利用核苷类似物药物的三磷酸单体，通过体外酶转录方法或者pcr扩增技术制备骨架整合核苷类似物药物的功能性核酸。在优选实施例中，具体制备过程选自如下的一种：
将要合成的功能性核酸的序列输入固相合成仪中，在普通cpg或者氨基修饰的cpg表面制备骨架整合核苷类似物药物的功能性核酸；或
将rna聚合酶、模板dna、rna核苷三磷酸单体、核苷类似物药物的三磷酸单体、反应缓冲液的混合溶液在37℃反应，制备骨架整合核苷类似物药物的功能性核酸；
将dna聚合酶、模板dna、dna引物、dna核苷三磷酸单体、核苷类似物药物的三磷酸单体、反应缓冲液的混合溶液在37℃反应，制备骨架整合核苷类似物药物的功能性核酸。
本发明提供的一种上述骨架整合核苷类似物药物的功能性核酸的衍生物，其由所述骨架整合核苷类似物药物的功能性核酸，使用聚合物或疏水性分子修饰得到，或者与，转染试剂通过自组装得到，或者使被聚合物或疏水性分子修饰后的产物与转染试剂通过自组装得到。
在一些实施方式中，所述聚合物选自聚己内酯、聚乙二醇、聚乳酸-羟基乙酸共聚物中的一种或几种。但不局限于上述几种聚合物。
在一些实施方式中，所述疏水性分子选自如下的一种或几种：
磷脂分子，例如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、二磷脂酰甘油、鞘磷脂、鞘糖脂等；
烷烃类分子，例如戊烷、十二烷、十八烷等；
固醇类分子，例如胆固醇、皮质醇、醛固酮、睾丸酮、雌二醇以及维生素d等。但不局限于仅使用上述几种疏水性分子对骨架整合核苷类似物药物的功能性核酸进行修饰。
在一些实施方式中，所述转染试剂选自聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、壳聚糖、lipofectaminetm转染试剂、lipofectaminetm2000转染试剂、lipofectaminetm3000转染试剂、lipofectaminetmrnaimax转染试剂、金纳米粒子、四氧化三铁纳米粒子、二氧化硅纳米粒子中的一种或几种。但不局限于上述几种阳离子聚合物、阳离子脂质体、无机纳米粒子以及其他可用于功能性核酸负载和转染的转染试剂。
本发明提供的上述骨架整合核苷类似物药物的功能性核酸的衍生物的制备方法，主要包括：
使用聚合物修饰，得到骨架整合核苷类似物药物的功能性核酸的衍生物；其中聚合物选自例如聚己内酯、聚乙二醇、聚乳酸-羟基乙酸共聚物其的一种，但本发明不局限于仅使用上述几种聚合物；或
使用疏水性分子修饰，得到骨架整合核苷类似物药物的功能性核酸的衍生物，其中所述疏水性分子选自：磷脂分子，例如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、二磷脂酰甘油、鞘磷脂、鞘糖脂中的一种；或者烷烃类分子，例如戊烷、十二烷、十八烷等中的一种；或者固醇类分子，例如胆固醇、皮质醇、醛固酮、睾丸酮、雌二醇以及维生素d中的一种，但本发明不局限于仅使用上述几种疏水性分子对所述骨架整合核苷类似物药物的功能性核酸进行修饰；或
将所述骨架整合核苷类似物药物的功能性核酸或者使用聚合物或疏水性分子修饰后的产物与转染试剂通过自组装过程生成纳米材料，其中转染试剂包括聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、壳聚糖、lipofectaminetm转染试剂、lipofectaminetm2000转染试剂、lipofectaminetm3000转染试剂、lipofectaminetmrnaimax转染试剂、金纳米粒子、四氧化三铁纳米粒子、二氧化硅纳米粒子等其中的一种。但不局限于上述几种阳离子聚合物、阳离子脂质体、无机纳米粒子以及其他可用于功能性核酸负载和转染的转染试剂。
在优选实施方式中，上述的骨架整合核苷类似物药物的功能性核酸的衍生物的制备方法中，使用聚合物修饰的方法包括以下步骤：
提供以开环聚合的方式合成的末端带有叠氮基团的可降解高分子，然后使该可降解高分子与二苯基环辛炔修饰的骨架整合核苷类似物药物的功能性核酸进行无铜催化点击(click)反应，得到可降解高分子-骨架整合核苷类似物药物的功能性核酸的缀合物，即为骨架整合核苷类似物药物的功能性核酸的衍生物中的一种。
本发明还提供一种上述的骨架整合核苷类似物药物的功能性核酸的衍生物的水溶液的制备方法，包括以下步骤：
将可降解高分子-骨架整合核苷类似物药物的功能性核酸的缀合物溶解在二甲基亚砜(dmso)中，再将该溶液置于超纯水中透析24小时，制得可降解高分子-骨架整合核苷类似物药物的功能性核酸的缀合物的水溶液，即为骨架整合核苷类似物药物的功能性核酸的衍生物的水溶液。
本发明还公开了上述骨架整合核苷类似物药物的功能性核酸及其衍生物在制备基于基因疗法、化学疗法联合治疗疾病的核酸类药物和化疗药物中的用途。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
第一、本发明的骨架整合核苷类似物药物的功能性核酸及其衍生物，可以实现基因与药物的比例精准可调，具体可以通过调整被药物取代的天然核苷酸数目实现；
第二、本发明的骨架整合核苷类似物药物的功能性核酸及其衍生物，可以实现基因和药物程序性依次发挥作用，能最大程度增加协同治疗的效果；
第三、本发明成功的设计了一个载体能够同时高效包载基因药物和化疗药物两种物质。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
图1为本发明实施例1中骨架整合氟尿苷的bcl-2反义核苷酸(f-bcl-2aso)对荷瘤裸鼠中的耐药肝脏原位移植瘤的治疗过程中肿瘤尺寸的变化；
图2为本发明实施例1中骨架整合氟尿苷的bcl-2反义核苷酸(f-bcl-2aso)对荷瘤裸鼠中的耐药肝脏原位移植瘤的治疗后荷瘤肝脏照片；
图3为本发明实施例1中骨架整合氟尿苷的bcl-2反义核苷酸(f-bcl-2aso)对荷瘤裸鼠中的耐药肝脏原位移植瘤的治疗后，下调耐药肿瘤中耐药相关蛋白表达量的情况；
图4为本发明实施例2中骨架整合氟尿苷的bcl-2/xl反义核苷酸(f-bcl-2/xlaso)下调耐药细胞bel-7402中耐药相关蛋白的表达量的情况；
图5为本发明实施例3中骨架整合氟尿苷的bcl-2反义核苷酸构筑的球形核酸sna(f-bcl-2aso)的合成路线；
图6为本发明实施例3中二苯基环辛炔(dbco)修饰的骨架整合氟尿苷的bcl-2反义核苷酸(f-bcl-2aso-dbco)的20％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图7为本发明实施例3中聚合物1(n3-peg-b-pcl28)的合成路线；
图8为本发明实施例3中聚合物1(n3-peg-b-pcl28)的核磁共振氢谱图；
图9为本发明实施例3中聚合物1(n3-peg-b-pcl28)与dbco修饰的骨架整合氟尿苷的bcl-2反义核苷酸(f-bcl-2aso-dbco)点击反应缀合的合成路线图；
图10为本发明实施例3中骨架整合氟尿苷的bcl-2反义核苷酸构筑的球形核酸sna(f-bcl-2aso)的1％非变性琼脂糖凝胶电泳图；
图11为本发明实施例3中骨架整合氟尿苷的bcl-2反义核苷酸构筑的球形核酸sna(f-bcl-2aso)的动态光散射图；
图12为本发明实施例3中骨架整合氟尿苷的bcl-2反义核苷酸构筑的球形核酸sna(f-bcl-2aso)的透射电镜图；
图13为本发明实施例3中骨架整合氟尿苷的bcl-2反义核苷酸构筑的球形核酸sna(f-bcl-2aso)对荷瘤裸鼠中的耐药肝脏原位移植瘤的治疗过程中肿瘤尺寸的变化；
图14为本发明实施例3中骨架整合氟尿苷的bcl-2反义核苷酸构筑的球形核酸sna(f-bcl-2aso)对荷瘤裸鼠中的耐药肝脏原位移植瘤的治疗后荷瘤肝脏照片；
图15为本发明实施例3中骨架整合氟尿苷的bcl-2反义核苷酸构筑的球形核酸sna(f-bcl-2aso)对荷瘤裸鼠中的耐药肝脏原位移植瘤的治疗后，下调耐药肿瘤中耐药相关蛋白表达量的情况；
图16为本发明实施例4中dbco修饰的骨架整合氟尿苷的bcl-2/xl反义核苷酸(f-bcl-2/xlaso-dbco)的20％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图17为本发明实施例4中骨架整合氟尿苷的bcl-2/xl反义核苷酸构筑的球形核酸sna(f-bcl-2/xlaso)的1％非变性琼脂糖凝胶电泳图；
图18为本发明实施例4中骨架整合氟尿苷的bcl-2/xl反义核苷酸构筑的球形核酸sna(f-bcl-2/xlaso)下调耐药细胞bel-7402中耐药相关蛋白的表达量的情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应该理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的保护范围。在实际应用中本领域技术人员根据本发明做出的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1骨架整合氟尿苷的bcl-2反义核苷酸(f-bcl-2aso)
1.1骨架整合氟尿苷的bcl-2反义核苷酸(f-bcl-2aso)的合成
在dna固相合成时，本实施例中将反义核苷酸中的核苷酸t全部替换为抗肿瘤药物氟尿苷(f)。具体地，
将氟尿苷药物的亚磷酰胺单体、dna亚磷酰胺单体置于dna固相合成仪对应位置，反应柱中加入普通微孔玻璃小球(cpg)，输入5’-cagcgfgcgccafccffcccafccfccfcc-3’序列信息，加入催化、盖帽、氧化以及脱保护试剂，合成含氟尿苷序列后，经氨解、氮吹、制备色谱分离纯化、脱保护、浓缩即可得f-bcl-2aso序列。
此外，按照相同的方法，在固相合成仪中输入5’-aafacfccgaacgfgfcacgfccfccfcac-3’的序列，即可以合成出骨架整合氟尿苷的乱序核酸(f-scramble)作为对照。
1.2骨架整合氟尿苷的bcl-2反义核苷酸(f-bcl-2aso)对荷瘤裸鼠中的耐药肝脏原位移植瘤的治疗效果
本实施例中通过荷瘤裸鼠的耐药肝脏原位移植瘤模型评估骨架整合氟尿苷的bcl-2反义核苷酸(f-bcl-2aso)的体内抑制耐药肿瘤增殖效果。
具体地，通过尾静脉注射pbs和等当量氟尿苷、f-bcl-2aso、f-scramble(其中注射氟尿苷的当量浓度为5mg/kgbw)，用磁共振成像和西门子inveonresearchworkplace软件分析，通过三维有序子集最大期望值法(3d-osem)，手动圈出每层肿瘤部位后，重构图像并计算肿瘤尺寸，治疗结束后解剖取出荷瘤肝脏并拍照记录耐药肝脏原位移植瘤直观大小。
结果如图1所示，各治疗组耐药肝脏移植瘤的起始尺寸相当，治疗到第七天和十五天时f-bcl-2aso治疗组的肿瘤尺寸小于其余对照组的肿瘤尺寸。
图2为治疗结束后解剖裸鼠取出的荷瘤肝脏照片，图中偏白色部位为耐药肝脏移植瘤，由图2可见治疗结束后f-bcl-2aso治疗组的肿瘤尺寸最小，其余组别肿瘤尺寸只是略小于pbs对照组，也就是说f-bcl-2aso是上述药物中疗效最好的。
1.3骨架整合氟尿苷的bcl-2反义核苷酸(f-bcl-2aso)通过基因调控逆转肿瘤耐药
为了验证骨架整合氟尿苷的bcl-2反义核苷酸(f-bcl-2aso)能否通过基因调控逆转肿瘤耐药，本实施例中在治疗结束后，将肿瘤组织取出，迅速提取总蛋白，采用蛋白质印迹分析测定皮下耐药肿瘤中耐药蛋白表达量。
测定结果如图3所示，f-bcl-2aso治疗组的bcl-2蛋白条带比其他组别弱，这说明它能下调荷瘤裸鼠肿瘤内耐药蛋白的表达，因此f-bcl-2aso能在动物体内表现出基因治疗效果，能有效逆转耐药肿瘤的耐药性。
实施例2骨架整合氟尿苷的bcl-2/xl反义核苷酸(f-bcl-2/xlaso)
2.1骨架整合氟尿苷的bcl-2/xl反义核苷酸(f-bcl-2/xlaso)的合成
在dna固相合成时，本实施例中将反义核苷酸中的核苷酸t全部替换为抗肿瘤药物氟尿苷(f)。
具体地，将氟尿苷药物的亚磷酰胺单体、dna亚磷酰胺单体置于dna固相合成仪对应位置，反应柱中加入对应的普通微孔玻璃小球(cpg)，输入5’-aaggcafcccagccfccgffccfccfccfa-3’序列信息，加入催化、盖帽、氧化以及脱保护试剂，合成含氟尿苷序列后，经氨解、氮吹、制备色谱分离纯化、脱保护、浓缩即可得f-bcl-2/xlaso序列。
2.2骨架整合氟尿苷的bcl-2/xl反义核苷酸(f-bcl-2/xlaso)通过基因调控逆转肿瘤耐药
骨架整合氟尿苷的bcl-2/xl反义核苷酸(f-bcl-2/xlaso)与耐药bel-7402细胞共孵育10h，随后更换为正常培养基培养48小时；而f-scramble和f用作对照组，遵循同样的条件与细胞孵育，其中f的当量浓度为10μm，未做任何处理的耐药细胞作为阴性对照组。
在提取总蛋白后，经蛋白质印迹分析测定细胞中目标蛋白bcl-2的蛋白表达量。结果如图4所示，f-bcl-2/xlaso与耐药细胞bel-7402一同孵育后，可下调耐药相关bcl-2和bcl-xl蛋白的表达量，然而f-scramble和f处理组中bcl-2蛋白表达量与空白对照组比较无明显差异。因此，骨架整合氟尿苷的bcl-2/xl反义核苷酸(f-bcl-2/xlaso)具有一定的逆转耐药肿瘤的耐药性。
实施例3骨架整合氟尿苷的bcl-2反义核苷酸构筑的球形核酸sna(f-bcl-2aso)
3.1dbco修饰的骨架整合氟尿苷的bcl-2反义核苷酸(f-bcl-2aso-dbco)的合成
在通过固相合成方法制备骨架整合氟尿苷的bcl-2反义核苷酸时，使用氨基修饰的微孔玻璃小球(nh2-cpg)，制备得到氨基修饰的骨架整合氟尿苷的bcl-2反义核苷酸(f-bcl-2aso-nh2)。
将上述反义核苷酸序列在含30％磷酸盐缓冲液的dmso混合溶液中，加入200当量的dbco-nhsester，室温反应24h即可得到dbco修饰的骨架整合氟尿苷的bcl-2反义核苷酸(f-bcl-2aso-dbco)(图5)。
上述粗产物采用乙酸乙酯多次萃取、乙醇沉淀、离心等步骤纯化。
最后，将f-bcl-2aso-dbco复溶，用凝胶电泳表征dna的修饰情况，如图6所示，图中可见，产物在电泳后呈现为单一条带，与f-bcl-2aso-nh2相比，产物在凝胶电泳中移动速度较慢，证明f-bcl-2aso-dbco的成功制备。
3.2聚合物1的合成
用辛酸亚锡作催化剂、分子量2000的叠氮聚乙二醇羟基(n3-peg-oh)作引发剂引发ε-己内酯的开环聚合反应即可制备嵌段聚合物n3-peg-b-pcl(图7)。具体制备过程如下所述：首先将n3-peg-oh1.0000g(0.5mmol)和无水ε-己内酯1.7121g(15mmol)溶于无水甲苯中。接着通过注射器加入催化量的辛酸亚锡于120℃氮气氛围中反应24h。结束反应后，旋蒸抽干溶剂，剩余混合物复溶于二氯甲烷中，通过冰乙醚沉淀，过滤和真空干燥即可得到白色粉末状产物聚合物1，通过核磁共振氢谱表征，其分子式为n3-peg-b-pcl28。
聚合物1的1hnmr谱图如图8所示，测试溶剂为cdcl3，各质子峰的归属如下：δ(ppm):4.22(t,2h,-och2ch2oc(o)ch2ch2ch2ch2ch2o-),4.05(t,56h,-c(o)ch2ch2ch2ch2ch2o-),3.64(s,174h,-och2ch2o-),2.30(t,56h,-c(o)ch2ch2ch2ch2ch2o-),1.64(m,112h,-c(o)ch2ch2ch2ch2ch2o-),1.37(m,56h,-c(o)ch2ch2ch2ch2ch2o-)。
3.3骨架整合氟尿苷的bcl-2反义核苷酸构筑的球形核酸sna(f-bcl-2aso)的合成
聚合物1(n3-peg-b-pcl28)与dbco修饰的骨架整合氟尿苷的bcl-2反义核苷酸(f-bcl-2aso-dbco)通过经典的点击反应缀合，如图9所示。
合成过程如下：首先，将n3-peg-b-pcl28(200nmol)溶于1.2ml的dmso溶液中，f-bcl-2aso-dbco(400nmol)溶于30.0μl水中，两溶液混合均匀后于58℃振荡反应48h。
反应结束后，将反应液置于截留分子量为10kda的透析袋中透析，除去dmso，透析过程中n3-peg-b-pcl28与f-bcl-2aso-dbco缀合物会逐步组装形成球形核酸结构sna(f-bcl-2aso)(图5)。
未参与点击反应的过量上述反义核苷酸用截留分子量为100kda的超滤管超滤去除。
纯化后的sna(f-bcl-2aso)用琼脂糖凝胶电泳表征其结构的形成，琼脂糖凝胶浓度为1％，电泳电压为90v，电泳结束后用凝胶成像系统成像。表征结果如图10所示，sna(f-bcl-2aso)条带位于对照组f-bcl-2aso-dbco条带的上方，证明骨架整合氟尿苷的bcl-2反义核苷酸构筑的球形核酸sna(f-bcl-2aso)的成功制备。
此外，按照相同的方法，可以合成出骨架整合氟尿苷的乱序核酸构筑的球形核酸sna(f-scramble)作为对照。
骨架整合氟尿苷的bcl-2反义核苷酸构筑的球形核酸sna(f-bcl-2aso)的水合粒径通过动态光散射实验表征，测试结果如图11所示，可见sna(f-bcl-2aso)的水合粒径为17.5nm。此外，图12所示的透射电镜实验结果证实，sna(f-bcl-2aso)的形貌为球形。
3.4骨架整合氟尿苷的bcl-2反义核苷酸构筑的球形核酸sna(f-bcl-2aso)对荷瘤裸鼠中的耐药肝脏原位移植瘤的治疗效果
本实施例中通过荷瘤裸鼠的耐药肝脏原位移植瘤模型评估sna(f-bcl-2aso)的体内抑制耐药肿瘤增殖效果。
在本实施例中通过尾静脉注射pbs和等当量氟尿苷、sna(f-bcl-2aso)、sna(f-scramble)以及反义核苷酸构筑的球形核酸与氟尿苷的混合物sna(bcl-2aso)/f(其中注射氟尿苷的当量浓度为5mg/kgbw)，用磁共振成像和西门子inveonresearchworkplace软件分析，通过三维有序子集最大期望值法(3d-osem)，手动圈出每层肿瘤部位后，重构图像并计算肿瘤尺寸，治疗结束后解剖取出荷瘤肝脏并拍照记录耐药肝脏原位移植瘤直观大小。
结果如图13所示，各治疗组耐药肝脏移植瘤的起始尺寸相当，治疗到第七天和十五天时sna(f-bcl-2aso)治疗组的肿瘤尺寸小于pbs对照组的肿瘤尺寸，存在显著差异。
图14为治疗结束后解剖裸鼠取出的荷瘤肝脏照片，图中偏白色部位为耐药肝脏移植瘤，由图13及图14可见治疗结束后sna(f-bcl-2aso)治疗组的肿瘤尺寸最小，其余组别肿瘤尺寸只是略小于pbs对照组，也就是说sna(f-bcl-2aso)是上述药物中疗效最好的。
3.5骨架整合氟尿苷的bcl-2反义核苷酸构筑的球形核酸sna(f-bcl-2aso)通过基因调控逆转肿瘤耐药
为了验证骨架整合氟尿苷的bcl-2反义核苷酸构筑的球形核酸sna(f-bcl-2aso)能否通过基因调控逆转肿瘤耐药，治疗结束后，将肿瘤组织取出，迅速提取总蛋白，采用蛋白质印迹分析测定皮下耐药肿瘤中耐药蛋白表达量。
结果如图15所示，sna(f-bcl-2aso)治疗组的bcl-2蛋白条带均比其他组别弱，这说明sna(f-bcl-2aso)治疗组能下调荷瘤裸鼠的肿瘤内耐药蛋白的表达，因此sna(f-bcl-2aso)能在动物体内表现出优异的基因治疗效果，能有效逆转耐药肿瘤的耐药性。
实施例4骨架整合氟尿苷的bcl-2/xl反义核苷酸构筑的球形核酸sna(f-bcl-2/xlaso)
4.1dbco修饰的骨架整合氟尿苷的bcl-2/xl反义核苷酸的合成
在通过固相合成方法制备骨架整合氟尿苷的bcl-2/xl反义核苷酸时，使用氨基修饰的微孔玻璃小球(nh2-cpg)，制备得到氨基修饰的骨架整合氟尿苷的bcl-2/xl反义核苷酸(f-bcl-2/xlaso-nh2)。
将上述反义核苷酸序列在含30％磷酸盐缓冲液的dmso混合溶液中，加入200当量的dbco-nhsester，室温反应24h即可得到dbco修饰的骨架整合氟尿苷的bcl-2/xl反义核苷酸(f-bcl-2/xlaso-dbco)。
粗产物采用乙酸乙酯多次萃取、乙醇沉淀、离心等步骤纯化。
最后，将f-bcl-2/xlaso-dbco复溶，用凝胶电泳表征dna的修饰情况，如图16所示。图16中可见，产物在电泳后呈现为单一条带，与f-bcl-2/xlaso-nh2相比，产物在凝胶电泳中移动速度较慢，证明f-bcl-2/xlaso-dbco的成功制备。
4.2骨架整合氟尿苷的bcl-2/xl反义核苷酸构筑的球形核酸sna(f-bcl-2/xlaso)的合成
使用实施例3中的聚合物1(n3-peg-b-pcl28)与dbco修饰的骨架整合氟尿苷的bcl-2/xl反义核苷酸(f-bcl-2/xlaso-dbco)通过经典的点击反应缀合。
合成过程如下：首先，将n3-peg-b-pcl28(200nmol)溶于1.2ml的dmso溶液中，f-bcl-2/xlaso-dbco(400nmol)溶于30.0μl水中，两溶液混合均匀后于58℃振荡反应48h。
反应结束后，将反应液置于截留分子量为10kda的透析袋中透析，除去dmso，透析过程中n3-peg-b-pcl28与f-bcl-2/xlaso-dbco缀合物会逐步组装形成球形核酸结构sna(f-bcl-2/xlaso)。
未参与点击反应的过量上述反义核苷酸用截留分子量为100kda的超滤管超滤去除。
纯化后的sna(f-bcl-2/xlaso)用琼脂糖凝胶电泳表征其结构的形成，琼脂糖凝胶浓度为1％，电泳电压为90v，电泳结束后用凝胶成像系统成像。如图17所示，sna(f-bcl-2/xlaso)条带位于对照组f-bcl-2/xlaso-dbco条带的上方，证明骨架整合氟尿苷的bcl-2/xl反义核苷酸构筑的球形核酸sna(f-bcl-2/xlaso)的成功制备。
4.3骨架整合氟尿苷的bcl-2/xl反义核苷酸构筑的球形核酸sna(f-bcl-2/xlaso)通过基因调控逆转肿瘤耐药
骨架整合氟尿苷的bcl-2/xl反义核苷酸构筑的球形核酸sna(f-bcl-2/xlaso)与耐药bel-7402细胞共孵育10h，随后更换为正常培养基培养48小时；而sna(f-scramble)和f用作对照组，遵循同样的条件与细胞孵育，其中f的当量浓度为10μm，未做任何处理的耐药细胞作为阴性对照组。
在提取总蛋白后，经蛋白质印迹分析测定细胞中目标蛋白bcl-2和bcl-2/xl的蛋白表达量。结果如图18所示，图18中可见，sna(f-bcl-2/xlaso)与耐药细胞bel-7402一同孵育后，可显著下调耐药相关bcl-2和bcl-xl蛋白的表达量，然而sna(f-scramble)和f处理组中bcl-2蛋白表达量与空白对照组比较无明显差异。因此，骨架整合氟尿苷的bcl-2/xl反义核苷酸构筑的球形核酸sna(f-bcl-2/xlaso)能够很好的逆转耐药肿瘤的耐药性。
与现有技术相比，本发明的骨架整合核苷类似物药物的功能性核酸及其衍生物可以高效进入细胞，并利用骨架整合核苷类似物药物的功能性核酸发挥基因调控功能；随后，骨架整合核苷类似物药物的功能性核酸可以被核酸酶降解并释放核苷类似物药物的活性成分，因此起到化学治疗的作用。因此，骨架整合核苷类似物药物的功能性核酸及其衍生物可以简单高效地实现基因治疗、化学治疗的联合治疗，并避免了复杂的合成步骤。
实施例5骨架整合氟尿苷的plk1小干扰rna(f-siplk1)
5.1骨架整合氟尿苷的plk1小干扰rna(f-siplk1)的合成
在体外酶转录时，本实施例中将sirna中的核苷酸u全部替换为抗肿瘤药物氟尿苷(f)。具体地，
将t7rna聚合酶y639f加入到合成rna的转录反应液中，转录反应液包含模板dna(1μg)、atp(5mm)、ctp(5mm)、gtp(5mm)、5-fdutp(5mm)、dtt(10mm)以及反应缓冲液，接着在37℃孵育6h。反应结束后，通过变性聚丙烯酰胺凝胶切胶纯化、回收产物，并用冰乙醇在-20℃下沉淀目标rna链段。经离心、复溶rna后将其存储在-80℃冰箱中备用。
实施例6骨架整合吉西他滨的bcl-2反义核苷酸(ge-bcl-2aso)
6.1骨架整合吉西他滨的bcl-2反义核苷酸(ge-bcl-2aso)的合成
在dna固相合成时，本实施例中将反义核苷酸中的核苷酸t全部替换为抗肿瘤药物吉西他滨(ge)。具体地，
将吉西他滨药物的亚磷酰胺单体、dna亚磷酰胺单体置于dna固相合成仪对应位置，反应柱中加入普通微孔玻璃小球(cpg)，输入5’-geaggegtggeggegeatgegettgegegeatgegetgegetgege-3’序列信息，加入催化、盖帽、氧化以及脱保护试剂，合成含氟尿苷序列后，经氨解、氮吹、制备色谱分离纯化、脱保护、浓缩即可得ge-bcl-2aso序列。
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