一种用于肿瘤联合治疗的光敏型细胞膜仿生的靶向纳米药物及其制备的制作方法

本发明属于纳米医药技术领域，特别涉及一种用于肿瘤联合治疗的光敏型细胞膜仿生的靶向纳米药物及其制备方法。

背景技术

红细胞(rbcs)是血液中数量最多且寿命最长的细胞，具有极高的生物相容性，在体内循环时间长达120d，并且能够完全降解。rbcs具有许多独特的特性，如循环范围广、通过网状内皮系统可以自动清除老化和受损的rbcs、半衰周期长、具有最优的表面积和体积比，使其成为许多天然或合成有效载荷的体内递送候选者。红细胞膜载体在过去十多年得到了广泛的关注，作为血液中最常用的活性试剂载体，通常被称为“红细胞载体”或“rbcs载体”，这些红细胞膜载体继承了原代细胞良好的生物相容性，其表面保留了的大量膜蛋白是其体内长循环的重要因素。早在1973年，garretm等(g.m.ihler,h.glewr,w.schnuref.proc.natl.acad.sci.usa,1973,70,2663.)开创性的提出在血红细胞溶血的状态下能够将β-葡糖苷酶和β-半乳糖苷酶快速包封在红细胞中。这种溶血诱导的酶吸收并未造成细胞数量的减少，而细胞膜包覆酶以后只是引起红细胞体积的略微增大。piao等(j.g.piao,l.wang,f.gao.acsnano,2014,8,10414.)研究者成功制备了能够克服纳米金体内循环时间短的红细胞膜仿生纳米粒子(rbc-auncs)，通过挤压的方式得到红细胞膜并替换传统的聚乙二醇作为金纳米笼的包裹物，动物实验结果表明rbc-auncs增强了纳米粒子在肿瘤部位的摄取，光热疗(ppt)后实现了45天内小鼠100％的存活率，红细胞膜包覆金纳米笼后既保留了金纳米笼的光学特性，也发挥了红细胞膜的体内长循环优势。中国公开文本cn106943378a公开了一种红细胞膜包封聚酯类载三氧化二砷(ato)纳米粒及其制备方法，所述纳米粒以红细胞膜为外壳，聚酯类材料为核心；所述聚酯类材料负载有三氧化二砷。制备的纳米粒子粒径均匀，稳定性好，不会引起红细胞溶血和凝集。该递药系统解决了三氧化二砷静脉注射后，血药浓度快速升高的问题。

红细胞膜作为运输工具，能够为药物载体提供长循环的特性，但是药物载体是否具有高载药量、肿瘤微环境响应性以及生物相容性，也是药物载体设计需要考虑的重点要素之一。白蛋白，是血浆里最丰富的蛋白质。其在维持血浆渗透压和转运内源性物质方面发挥了重要的作用。许多疏水性的分子，如脂溶性的维生素、激素等都是靠蛋白质的携带来实现血液循环。白蛋白表面丰富的功能基团，如氨基、羧基和巯基，使得白蛋白能够通过共价键作用、静电作用以及疏水性作用与多种药物复合。其中最为成功的载药典范就是，研究者将抗癌首选药物紫杉醇与人血清蛋白通过疏水作用结合，制备出“白蛋白结合型紫杉醇”，该药物已被临床应用于治疗多种类型的癌症患者，并且已经被美国食品药物管理局认可。

肿瘤治疗目前已经发展到包括化疗、放射性治疗、光热疗以及磁热疗等多种领域。其中化疗应用广泛、效果立竿见影，而光热疗则具有低侵蚀性、无反复等优势。但是，单一治疗往往存在治疗周期长、容易引起肿瘤耐药的特性。因此，选择化疗/光动力治疗联合用药的治疗方式，构建一种安全并且能携载多种不同作用机制的药物载体，达到双管齐下的治疗目的，势必能进一步提高肿瘤治疗的效果。

二价铂类化合物是目前应用最为广泛的抗肿瘤药物，自上世纪六十年代rosenberg等发现了顺铂类配合物对细胞繁殖的抑制作用，它就成为了一种临床常见的抗肿瘤药物，广泛应用于头颈癌、肺癌、淋巴瘤等疾病的治疗。二价铂类化合物目前已成为手术、放疗后系统清除肿瘤细胞的一种常规手段，甚至被誉为“抗肿瘤药领域的青霉素”。二价铂类化合物主要通过靶向dna复制而抑制肿瘤细胞增值并引发程序性凋亡。

吲哚青绿(icg)是在1955年由柯达研究实验室研发的一种两亲性染料。作为小分子有机近红外染料，其广泛应用于肿瘤的诊断和治疗。光热疗作为一种很有前景的肿瘤治疗方法，作用机理是肿瘤内的光敏剂富集于病灶后，在匹配吸收波长的激光作用下产生细胞毒素单线态氧(singletoxygen,¹o2)，杀伤肿瘤细胞、破坏肿瘤的血管系统并使机体对肿瘤产生一定免疫反应。光热疗对组织的损伤程度与手术、化疗、放疗等常规治疗手段相比损伤性更小。但由于吲哚菁绿半衰期短，易与体内脂蛋白发生特异性结合，溶液中容易发生聚集以及光稳定性不好，导致荧光自猝灭，限制了其在医学领域的应用。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种用于肿瘤联合治疗的光敏型细胞膜仿生的靶向纳米药物。

本发明另一目的在于提供上述用于肿瘤联合治疗的光敏型细胞膜仿生的靶向纳米药物的制备方法。

本发明的目的通过下述方案实现：

一种用于肿瘤联合治疗的细胞膜仿生的光敏型靶向纳米药物，其包括人o型血红细胞膜、白蛋白、(1,2-二氨基环己烷)二氯化铂、吲哚菁绿(icg)和精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸五肽(rgd)，其中人o型血红细胞膜作为运载平台、白蛋白作为药物载体、(1,2-二氨基环己烷)二氯化铂作为化疗药物、吲哚菁绿(icg)作为光敏试剂、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸五肽(rgd)为靶向分子。

所述的白蛋白优选为牛血清白蛋白(bsa)或者人血清白蛋白(fbs)，均可购自于sigma公司；

一种上述的用于肿瘤联合治疗的细胞膜仿生的靶向纳米药物的制备方法，主要包括以下步骤：

(1)羧基修饰的白蛋白的制备：在室温下，将白蛋白溶解于缓冲溶液中，然后加入丁二酸酐的1，4-二氧六环溶液，对白蛋白进行表面修饰反应，反应结束后将所得反应液过滤，然后对滤液进行离心超滤，取超滤管中的液体冻干即得羧基修饰的白蛋白；

(2)白蛋白-吲哚菁绿纳米粒子的制备：向步骤(1)中得到的羧基修饰的白蛋白中加入二硫苏糖醇(dtt)、吲哚菁绿(icg)和水，无氧条件下发生反应，反应结束后对所得反应液进行离心超滤，取超滤管中的液体即为白蛋白-吲哚菁绿纳米粒子；

(3)白蛋白负载的dachpt/吲哚菁绿纳米粒子的制备：向步骤(2)中得到的白蛋白-吲哚菁绿纳米粒子中加入(1,2-二氨基环己烷)二氯化铂(dachpt)水溶液进行反应，反应结束后对所得反应液进行离心超滤，取超滤管中的液体即得白蛋白负载的dachpt/吲哚菁绿纳米粒子，命名为bpti；

(4)人o型血红细胞膜的制备：取人o型血全血，离心去掉上清和白细胞层，然后对下层细胞进行低渗处理以除去细胞内基质，再在聚碳酸酯多孔膜挤压机中挤压，即得红细胞膜囊泡；

(5)靶向配体的制备：将精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸五肽(rgd)溶解于含有三(2-羧乙基)膦(tcep)的pbs溶液中，再加入马来酰亚胺-聚乙二醇-磷脂(dspe-peg-mal)的pbs溶液，室温下搅拌反应，反应结束后将所得反应液离心超滤，取超滤管中的液体冻干即得修饰红细胞膜的靶向配体(rgd-peg-dspe)；

(6)靶向配体修饰的红细胞膜的制备：将修饰红细胞膜的靶向配体rgd-peg-dspe与步骤(4)中的红细胞膜囊泡在室温下混合，800rpm涡旋20-120s，再在0-25℃下静置10-50min，即得靶向配体修饰的红细胞膜；

(7)细胞膜仿生的靶向纳米药物的制备：将步骤(3)制备得到的白蛋白负载的dachpt/吲哚菁绿纳米粒子与步骤(6)中得到的靶向配体修饰的红细胞膜在pbs中混合均匀，然后在200nm的聚碳酸酯多孔膜挤压机中挤压进行包覆，再于透析袋中透析24h进行纯化，即得到光敏型红细胞膜仿生的靶向纳米粒子，并命名为bpti@rbc-r。

步骤(1)中所述的缓冲溶液指ph值为6-9的pbs缓冲液；步骤(1)中所述的丁二酸酐的1，4-二氧六环溶液的浓度为2-5mg/ml；步骤(1)中所述的白蛋白和丁二酸酐的用量满足白蛋白和丁二酸酐的质量比为1:2-2:1；

步骤(1)中所述的反应是指在室温下反应1-4h；

步骤(1)中所述的超滤离心中超滤膜的截留分子量为3500～20000kda；离心速度为2000～5000rpm，离心时间为5～30min；

步骤(2)中所述的修饰后的白蛋白和吲哚菁绿的质量比为5-20：1-6；步骤(2)中所述的二硫苏糖醇(dtt)的用量满足每1mg的吲哚菁绿对应加入4-20mg的dtt；步骤(2)中所述的水的用量满足每1mg的吲哚菁绿对应加入1-10ml的水；

步骤(2)中所述的反应是指在无氧条件下，37℃反应1-2h；

步骤(2)中所述的离心超滤中超滤膜的截留分子量为3500～20000kda；离心速度为2000～5000rpm，离心时间为5～30min；

步骤(3)中所述的(1,2-二氨基环己烷)二氯化铂(dachpt)水溶液是指质量浓度为0.5-1mg/ml的(1,2-二氨基环己烷)二氯化铂(dachpt)水溶液；

步骤(3)中所述的白蛋白-吲哚菁绿纳米粒子和(1,2-二氨基环己烷)二氯化铂水溶液的用量满足白蛋白-吲哚菁绿纳米粒子与溶质(1,2-二氨基环己烷)二氯化铂(dachpt)的质量比为2-10:1；

步骤(3)中所述的反应是指在25℃反应48-150h；

步骤(3)中所述的离心超滤中超滤膜的截留分子量为3500～20000kda；离心速度为2000～5000rpm，离心时间为5～30min；

步骤(4)中所述的人o型血红细胞膜的制备具体包括以下步骤：取人o型血全血，4℃、2500rpm离心5min，移除上层液体，下层加入生理盐水，吹打，4℃、2500rpm离心5min，移除上清，重复向下层加入生理盐水、吹打、离心、移除上清的步骤两次，收集离心管下层细胞膜；对收集的下层细胞膜进行低渗处理，首先将细胞膜悬浮在1/4×pbs中，并在冰上放置20min，800rcf下离心5min，移去上层，底层的细胞膜用1×pbs清洗2次，然后在53khz、100w条件下进行超声处理5-10min，再依次在400nm、200nm的聚碳酸酯多孔膜挤压机中挤压，即制备得到红细胞膜囊泡；

步骤(5)中所述的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸五肽(rgd)、三(2-羧乙基)膦(tcep)和马来酰亚胺-聚乙二醇-磷脂(dspe-peg-mal)的摩尔比为4-7:0.2-0.8:1-3；步骤(5)中所述的含有三(2-羧乙基)膦(tcep)的pbs溶液的浓度为0.5-1mg/ml；步骤(5)中所述的马来酰亚胺-聚乙二醇-磷脂(dspe-peg-mal)的pbs溶液的浓度为30-50mg/ml；

步骤(5)中所述的搅拌反应是指在室温下，200-500rmp速度下反应1-5h。

步骤(5)中所述的超滤离心中超滤膜的截留分子量为3500～20000kda；离心速度为2000～5000rpm，离心时间为5～30min；

步骤(6)中所述的修饰红细胞膜的靶向配体rgd-peg-dspe与红细胞膜囊泡的质量比为0.005:1；

步骤(7)中所述的白蛋白负载的dachpt/吲哚菁绿纳米粒子与靶向配体修饰的红细胞膜的质量比为1-5:1-5；步骤(7)中所述的pbs的用量满足每1-5mg的白蛋白负载的dachpt/吲哚菁绿纳米粒子对应使用5ml的pbs；步骤(7)中所述的透析袋的截留分子量为7000-10000da；

本发明中所述的室温指18-28℃。

本发明的机理为：

本发明提出利用人o型血红细胞膜作为运载平台、白蛋白作为药物载体、dachpt作为化疗药物、icg作为光敏试剂、rgd为靶向分子，制备一种具有仿生特性、高载药量、特异性靶向肿瘤细胞的联合抗癌增敏的仿生药物运输体系，这种新型仿生载药体系不仅能够实现对药物的高效负载，还能够有效延长体内循环时间，实现在肿瘤病灶部位精准、持续给药，该药物的仿生效应能够高效应对肿瘤给药的缺陷，并形成运载给药、靶向治疗协同工作机制。实现了肿瘤化疗与光热治疗多机制联合治疗肿瘤的目的，将为肿瘤治疗提供新的思路和平台。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：

红细胞作为一种天然的生物体，其具有长达120天的体内长循环时间，极好的生物相容性以及低免疫原性。我们将红细胞经过离心，洗涤，低渗等处理制备了空心的红细胞膜，这种改性的红细胞膜作为药物运载平台，保留了红细胞表面的大量蛋白，具有高的生物相容性、低免疫原性、长循环的传统优势，同时还兼具了尺寸小、包载率高的特性。

白蛋白作为药物载体的研究已经非常广泛和普遍，本发明提出对白蛋白进行功能化，然后将dachpt作为化疗药物，icg作为光敏试剂负载在功能化白蛋白上，制备了化学药物与光热治疗于一体的联合治疗功效的蛋白纳米载药内核，再将红细胞膜对白蛋白载药内核进行包裹，有效改善了白蛋白载药内核体内循环时间短、药物泄漏以及多药耐药的问题。

靶向试剂修饰的红细胞膜使得红细胞膜载药体系具备了特异性靶向肿瘤的目的，有效控制抗肿瘤药物在组织和细胞内的分布，具有高效精准给药和定点释放的功效。

附图说明

图1为bpti@rbc-r的制备过程示意图，其中(a)bipt的制备过程；(b)bipt@rbc-r的制备过程。

图2为实施例1中纳米粒子的透射电镜图片。其中，a为bsa负载的dachpt/吲哚菁绿纳米粒子(bpti)的透射电镜图；b为光敏型红细胞膜仿生的靶向纳米药物bpti@rbc-r的透射电镜图；c为光敏型红细胞膜仿生的靶向纳米药物bpti@rbc-r经808nm激光光照后的透射电镜图，图片标尺均为500nm。

图3为实施例1中不同药物浓度下巨噬细胞中bpti、bpti@rbc以及bpti@rbc-r的内吞量。

图4为实施例1中不同药物浓度下不同操作条件下的细胞存活率图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中所用试剂如无特殊说明均可从市场常规购得。实施例中的人o型血购自于医院血库供血或者病人自己提供的血液。

实施例1

(1)蛋白药物载体的制备：在25℃下，先将50mg牛血清白蛋白(bsa，购自于sigma公司)溶解于ph＝9的磷酸盐缓冲溶液中，然后逐滴加入10毫升含有45mg丁二酸酐的1，4‐二氧六环对牛血清白蛋白进行表面修饰，使其表面能够尽可能多的接枝羧基，室温下反应2h，反应结束后将所得反应液过滤，所得滤液4℃置于超滤离心管中离心超滤，超滤膜的截留分子量为10000kda，离心的速度为4000rpm，离心时间为20min；取超滤管中的液体冻干即得羧基修饰的白蛋白。

(2)取步骤(1)制备的冻干的羧基修饰的白蛋白15mg，加入28mg的dtt和6mg吲哚菁绿(购买于日本东京化成)，再加入20毫升纯水，37℃无氧条件下反应1h，反应结束后4℃置于超滤离心管中离心超滤，超滤膜的截留分子量为10000kda，离心的速度为4000rpm，离心时间为20min；取超滤管中的液体即得到牛血清白蛋白‐吲哚菁绿纳米粒子(bsa-icg)。

(3)将步骤(2)得到的牛血清白蛋白‐吲哚菁绿纳米粒子与0.8mg/ml的(1,2‐二氨基环己烷)二氯化铂(dachpt)(购买于sigma公司)水溶液按牛血清白蛋白‐吲哚菁绿纳米粒子和(1,2‐二氨基环己烷)二氯化铂(dachpt)的质量比为5:1进行混合并于25℃反应5天，然后对所得反应液进行离心超滤，超滤膜的截留分子量为10000kda，离心的速度为4000rpm，离心时间为20min，取超滤管中的液体即得bsa负载的dachpt/吲哚菁绿纳米粒子，简称bpti；

(4)人o型血红细胞膜的制备：取人o型血全血5ml，4℃、2500rpm离心5min，移除上层液体；下层加入5ml生理盐水，反复吹打，4℃、2500rpm离心5min，移除上清，重复用生理盐水洗涤下层细胞、吹打、离心的操作两次，收集下层细胞膜。接下来将收集的细胞膜进行低渗处理，首先将细胞膜悬浮在1/4×pbs中，并在冰上放置20min，800rcf下离心5min。移去上层，底层的细胞膜用1×pbs清洗2次然后将清洗后的细胞膜在53khz100w条件下进行超声处理8min，依次在400nm、200nm的聚碳酸酯多孔膜挤压机(avanti微型挤出器)中挤压，即成功制备出红细胞膜囊泡；

(5)靶向配体修饰的红细胞膜的制备：将20mg的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸五肽(rgd)(购买于耀强生物技术有限公司)溶解于0.5ml含有0.5mg三(2-羧乙基)膦(tcep)的pbs溶液中。然后，将2ml含有80mg的马来酰亚胺-聚乙二醇-磷脂(dspe-peg-mal，分子量为5000)的pbs溶液加入上述混合溶液中室温搅拌4h。将所得反应液于4℃置于超滤离心管中离心超滤，超滤膜的截留分子量为10000kda，离心的速度为4000rpm，离心时间为20min，收集超滤管中的产品冻干即得修饰红细胞膜的靶向配体；

(6)将5mg的修饰红细胞膜的靶向配体与1g步骤(4)制备的红细胞膜囊泡在室温下混合，800rpm涡旋80s，再在15℃下静置30min，即得靶向配体修饰的红细胞膜。

(7)光敏型细胞膜仿生的靶向纳米药物的制备：将5mg步骤(3)制备的bsa负载的dachpt/吲哚菁绿纳米粒子与5mg步骤(6)制备的靶向配体修饰的红细胞膜在5ml的pbs中混合，然后在200nm的聚碳酸酯多孔膜挤压机中挤压进行包覆，后于透析袋(7000da)中透析24h进行纯化，即制备得到红细胞膜仿生的靶向bsa双载药物体系，并最终命名为bpti@rbc-r。

(8)光敏型细胞膜仿生的纳米药物的制备：将5mg步骤(3)制备的bsa负载的dachpt/吲哚菁绿纳米粒子与5mg步骤(4)制备的红细胞膜囊泡在5ml的pbs中混合，然后在200nm的聚碳酸酯多孔膜挤压机中挤压进行包覆，后于透析袋中透析24h进行纯化，最终成功制备出光敏型红细胞膜仿生的纳米药物，并最终命名为bpti@rbc。

bpti@rbc-r的制备过程示意图如图1所示，其中(a)为bipt的制备过程；(b)为bipt@rbc-r的制备过程。

实施例1中制备的纳米粒子的透射电镜图片如图2所示，其中a为bsa负载的dachpt/吲哚菁绿纳米粒子bpti的透射电镜图；b为光敏型红细胞膜仿生的靶向纳米药物bpti@rbc-r的透射电镜图；c为光敏型红细胞膜仿生的靶向纳米药物bpti@rbc-r经808nm激光光照5min后的破膜的透射电镜图片，图片标尺均为500nm。图2中的(a)图为bsa负载的dachpt/吲哚菁绿纳米粒子bpti，即为未包膜的bsa双载体，粒径为70nm左右，图2中的(b)图为光敏型红细胞膜仿生的靶向纳米药物的透射电镜图，即纳米红细胞膜包裹的bsa双载药体系，其粒径为167nm左右，说明成功制备了粒径200nm左右的光敏型红细胞膜仿生靶向纳米药物。图2中的c为光照之后的光敏型红细胞膜仿生的靶向纳米药物的透射电镜图，其中的红细胞膜经光照后细胞膜发生破裂，说明本发明的纳米红细胞包裹的bsa双载药体系在在匹配吸收波长的激光作用下有助于释放包覆的dachpt药物和光敏剂icg。

将不同浓度(溶剂为水)的bsa负载的dachpt/吲哚菁绿纳米粒子(bpti)、红细胞膜仿生的bsa双载药物体系(bpti@rbc)以及红细胞膜仿生的靶向bsa双载药物体系(bpti@rbc-r)分别加入到培养有巨噬细胞rw264.7(美国atcc细胞库)的孔板内(1万细胞/孔)，6小时后，将巨噬细胞rw264.7裂解，然后测试孔板内的荧光强度，即得到巨噬细胞中bpti、bpti@rbc以及bpti@rbc-r的内吞量。结果如图3所示，从图3可得出包裹有红细胞膜的bpti@rbc和bpti@rbc-r在巨噬细胞中的内吞量要远小于没有红细胞膜的bpti。纳米粒子作用于体内后通常会被巨噬细胞视为外来物质而被清除掉，但是我们的纳米粒子包裹红细胞膜后能够有效缓解巨噬细胞的清除，其中包膜组别都有明显的逃逸吞噬的能力，这说明红细胞膜包覆后纳米粒子具有优异的免疫逃逸功能。

另外，还进行了细胞毒性试验。将不同浓度(溶剂为水)的bsa负载的dachpt/吲哚菁绿纳米粒子(bpti)、光敏型红细胞膜仿生的纳米药物(bpti@rbc)以及光敏型红细胞膜仿生的靶向纳米药物(bpti@rbc-r)分别加入到培养有b16f10细胞(美国atcc细胞库)的孔板(1万细胞/孔)中，光照条件下处理(1w/cm²，808nm)，同时设置不同浓度的光敏型红细胞膜仿生的纳米药物(bpti@rbc)以及光敏型红细胞膜仿生的靶向纳米粒子药物(bpti@rbc-r)分别加入到培养有b16f10细胞(美国atcc细胞库)的孔板(1万细胞/孔)中避光处理的对比试验，24小时后，将孔板内的液体吸出，加入10微升细胞毒性测试试剂(cck8)进行毒性测试，即得到图4。

从图4中可以看出，无光照条件下，bpti@rbc-r组的细胞存活率要低于bpti@rbc组的细胞存活率，说明靶向试剂修饰的红细胞膜使得红细胞膜载药体系具备了特异性靶向肿瘤的目的，有效控制抗肿瘤药物在组织和细胞内的分布，具有高效精准给药和定点释放的功效。

从图4中还可以看出，光照条件下bpti@rbc-r组的细胞存活率最低，说明化学药物与光热治疗联合作用的细胞毒性明显提高，同时靶向包膜双载体bpti@rbc-r具有更有效的杀灭肿瘤细胞的能力。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。