一种鸡传染性法氏囊病亚单位疫苗及其制备方法与流程

本发明涉及基因工程亚单位疫苗领域，尤其是涉及一种鸡传染性法氏囊病亚单位疫苗，具体的是涉及一种鸡白介素-2和鸡α干扰素共表达产物提高鸡法氏囊vp2亚单位疫苗。

背景技术

基因工程亚单位疫苗是现代基因工程技术的成果结晶，凭借其无可比拟的高安全性、稳定性和低生产成本，使其成为现代疫苗制备领域的宠儿，但是由于其抗原的免疫原性差这一先天不足导致其不可能完全取缔传统疫苗。因此，如何提升基因工程亚单位疫苗抗原的免疫原性或者提升其免疫效力成为近年来的研究焦点。利用具有免疫调节和免疫效应功能的细胞因子作为免疫增强剂，用于提升基因工程亚单位疫苗的免疫效力，已经被越来越多的研究所证实。

α干扰素(interferon-α，ifn-α)具有广谱的抗病毒、抗肿瘤和免疫激活功能活性，增强机体细胞免疫应答水平；白细胞介素-2(interleukin-2，il-2)可以促进t、b淋巴细胞的分化与增殖，提高机体的细胞和体液免疫应答水平，将ifn-α和il-2联合应用可发挥协同抗病毒活性。程俊贞等已研究证实联合重组表达的ifn-α和il-2对新城疫病毒灭活疫苗具有显著的免疫增强作用。

鸡传染法氏囊vp2亚单位疫苗制备技术业已成熟，但是其免疫效力远低于传统疫苗，严重制约了vp2亚单位疫苗的应用和推广。利用单一的ifn-α和il-2作为免疫增强剂，或将其基因与vp2蛋白基因串联表达共同制备成抗原，以期提升vp2亚单位疫苗的免疫效力已被报道，但是其实际的临床效果不甚理想。本发明在上述研究的基础上，创造性的利用ifn-α和il-2共表达技术获得真核表达产物，与原核表达的vp2蛋白混合制备成抗原，进一步制备成抗体，在临床中取得了显著的免疫效力提升效果。

技术实现要素：

本发明的技术目的在于提供一种高免疫效力的鸡传染法氏囊vp2亚单位疫苗，以解决现有技术中因vp2亚单位疫苗免疫效力低、难以临床使用和推广的问题。

本发明的另一技术目的在于克服传统疫苗存在免疫空白期、一次免疫难以解决法氏囊病度持续感染、病程中因病毒变异导致的免疫失败等问题。

本发明的技术目的还在于提供一种鸡传染性法氏囊病亚单位疫苗的制备方法。

为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

一种鸡传染性法氏囊病亚单位疫苗，由鸡ifn-α和鸡il-2基因的真核共表达产物、鸡传染性法氏囊病毒vp2基因的原核表达产物和铝胶佐剂组成。

更进一步的，鸡ifn-α和鸡il-2基因上分别连接有hbm信号肽基因，分别命名为hbm-chifnα和hbm-chil2；

更进一步的，鸡ifn-α和鸡il-2基因的表达载体是pfastbacdual载体；

更进一步的，与载体连接的hbm-chifnα和hbm-chil2基因分别由pfastbacdual载体的ph和p10启动子控制。

更进一步的，真核表达系统是bac-to-bac杆状病毒表达系统。

一种鸡传染性法氏囊病亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)将鸡ifn-α和鸡il-2真核共表达产物与vp2原核表达产物混合均匀制备成抗原；

2)将抗原与铝胶佐剂混合均匀制备成亚单位疫苗。

更进一步的，抗原中鸡ifn-α和鸡il-2真核共表达产物的终浓度为500-800ng/ml。

更进一步的，抗原中鸡ifn-α和鸡il-2真核共表达产物的终浓度为500ng/ml。

更进一步的，抗原中vp2原核表达产物的终浓度为400ng-800ng/ml。

更进一步的，抗原与铝胶佐剂的比例为3:1-5:1(v/v)。

采用上述方案，本发明的有益效果是：

1)现有技术中，将ifn-α和il-2作为基因工程亚单位疫苗的免疫增强剂，主要利用的是其具有免疫增强作用这一生物学活性，因此要求重组得到的ifn-α和il-2蛋白必须具有正确的空间折叠结构，而原核表达产物常以无生物学活性的包涵体形式存在，及时通过复杂而昂贵的重组蛋白复性工艺，其复性效率也不会超过20％，难以满足工业生产的需要；单独真核表达的ifn-α和il-2虽然在一定程度上解决了重组蛋白的复性问题，但是其协同效应不显著且工艺繁琐。而本发明利用bac-to-bac杆状病毒表达系统，使鸡ifn-α和鸡il-2基因共同表达，在相同的表达条件下，在表达过程中二者形成竞争抑制关系，其表达产物不但能克服原核表达产物的生物学活性问题，还能促进在应用过程中二者的协同增效作用。

2)现有技术中，分别将ifn-α和il-2基因与vp2基因串联表达制备成抗原，其主要作用是强化vp2蛋白的免疫原性，及时是串联基因的真核表达产物作为抗原，受vp2蛋白的影响导致ifn-α和il-2不能行使正常的生物学功能，其制备的基因工程亚单位疫苗仍然存在保护空白期便是最好的证明。而本发明中，真核表达产物鸡ifn-α、鸡il-2和原核表达产物vp2蛋白各自独立存在，各司其职，且真核表达产物能填补vp2蛋白亚单位疫苗的保护空白期，并活化增强体液免疫和细胞免疫能力，促使vp2蛋白亚单位疫苗更快的产生抗体和提升抗体水平。

附图说明

图1是用各种基因工程亚单位疫苗免疫鸡后，鸡体内血清抗体水平的变化。

具体实施方式

以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本文使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。

实施例1重组蛋白表达

1)vp2原核蛋白表达

利用genbank中的鸡法氏囊病毒vp2基因，设计了特异性游引物，扩增出目的片段；将此片段克隆至pmd18-t载体上，获得重组克隆载体pmd18-t-vp2；将经酶切、测序鉴定后序列正确的重组克隆载体上的vp2基因亚克隆至原核表达载体pet-28a上，得到的重组表达载体pet-28a-vp2；将重组表达载体转化至大肠杆菌表达宿主(bl21)，表达产物经纯化检测后即得vp2蛋白。

2)chifnα、chil2真核蛋白表达

参照“vp2原核蛋白表达”表达的方法，分别获得pfastbacdual-ifnα和pfastbacdual-chil重组表达载体；在获得重组表达在体中，将ifnα基因置于ph启动子控制下，将il2置于p10启动子控制下；根据invitrogen公司的bac-to-bac杆状病毒表达系统说明书提供的方法将重组质粒进行转染、鉴定，诱导表达后对重组蛋白进行纯化，分别得到chifnα和chil2蛋白。

3)pfastbacdaul-hbm-chil-2&chifn-α真核共表达

根据常规生物技术手段制备信号肽(hbm)表达基因；将hbm分别和“chifnα、chil2真核蛋白表达”中的chifnα、chil-2连接，命名为hbm-chifnα、hbm-chil-2；hbm-chifn-α基因胶纯化后进行酶切，连接到经同样酶切条件的pfastbacdual载体质粒上，置于p10启动子控制下；同样方法将hbm-chil-2基因连接到已连有hbm-chifn-α的载体上，置于ph启动子控制下，构建成共表达转移载体pfastbacdaul-hbm-chil-2&chifn-α；根据invitrogen公司的bac-to-bac杆状病毒表达系统说明书提供的方法将(pfastbacdaul-hbm-chifn-α&chil-2)进行转染、鉴定，诱导表达后对重组蛋白进行纯化，得到pfastbacdaul-hbm-chifn-α&chil-2共表达蛋白。

4)pfastbacdaul-hbm-chifn-α&chil-2真核共表达

参照“pfastbacdaul-hbm-chil-2&chifn-α真核共表达”的方法，构建共表达转移载体pfastbacdaul-hbm-chifn-α&chil-2，在体中将hbm-chifn-α基因置于ph启动子控制下，将hbm-chil-2基因置于p10启动子控制下，根据invitrogen公司的bac-to-bac杆状病毒表达系统说明书提供的方法将(pfastbacdaul-hbm-chifn-α&chil-2)进行转染、鉴定，诱导表达后对重组蛋白进行纯化，得到pfastbacdaul-hbm-chifn-α&chil-2共表达蛋白。

实施例2基因工程亚单位疫苗的制备

1)vp2蛋白亚单位疫苗的制备

将vp2蛋白用生理盐水稀释至蛋白含量为0.5mg/ml，然后铝胶佐剂和稀释后的蛋白按1:4(体积比)混合均匀，制备成vp2亚单位疫苗待用。

2)chifnα-vp2蛋白亚单位疫苗的制备

将vp2蛋白用生理盐水稀释至蛋白含量为0.5mg/ml，加入终含量为500ng/ml的chifnα蛋白，搅拌混合均匀后，铝胶佐剂和上述混合蛋白按1:4(v/v)混合制成鸡chifnα-vp2亚单位疫苗待用。

3)chil2-vp2蛋白亚单位疫苗的制备

将vp2蛋白用生理盐水稀释至蛋白含量为0.5mg/ml，加入终含量为500ng/ml的chil2蛋白，搅拌混合均匀后，铝胶佐剂和上述混合蛋白按1:4(v/v)混合制成鸡chil2-vp2亚单位疫苗待用。

4)chifnα-chil2-vp2蛋白亚单位疫苗的制备

将vp2蛋白用生理盐水稀释至蛋白含量为0.5mg/ml，分别加入终含量为250ng/ml的chifnα和chil2蛋白，搅拌混合均匀后，铝胶佐剂和上述混合蛋白按1:4(v/v)混合制成chifnα-chil2-vp2亚单位疫苗待用。

5)pfastbacdaul-hbm-chil-2&chifn-α蛋白亚单位疫苗的制备

将vp2蛋白用生理盐水稀释至蛋白含量为0.5mg/ml，加入终含量为500ng/ml的pfastbacdaul-hbm-chil-2&chifn-α蛋白，搅拌均匀后，铝胶佐剂和上述混合蛋白按1:4(v/v)混合制成鸡pfastbacdaul-hbm-chil-2&chifn-α亚单位疫苗待用。

6)pfastbacdaul-hbm-chifn-α&chil-2蛋白亚单位疫苗的制备

将vp2蛋白用生理盐水稀释至蛋白含量为0.5mg/ml，加入终含量为500ng/ml的pfastbacdaul-hbm-chifn-α&chil-2蛋白，搅拌均匀后，铝胶佐剂和上述混合蛋白按1:4(v/v)混合制成鸡pfastbacdaul-hbm-chifn-α&chil-2亚单位疫苗待用。

实施例3免疫后血清抗体水平检测

取14日龄spf鸡随机分成7组，第一组10只，其余组20只，分别进行下述免疫程序。

第一组：设为空白对照组，每只肌肉注射生理盐水0.15ml；

第二组：vp2蛋白亚单位疫苗组，每只肌肉注射vp2蛋白亚单位疫苗0.15ml；

第三组：chifnα-vp2蛋白亚单位疫苗组，每只肌肉注射chifnα-vp2蛋白亚单位疫苗0.15ml；

第四组：chil2-vp2蛋白亚单位疫苗组，每只肌肉注射chil2-vp2蛋白亚单位疫苗0.15ml；

第五组：chifnα-chil2-vp2蛋白亚单位疫苗组，每只肌肉注射chifnα-chil2-vp2蛋白亚单位疫苗0.15ml；

第六组：pfastbacdaul-hbm-chil-2&chifn-α蛋白亚单位疫苗组，每只肌肉注射pfastbacdaul-hbm-chil-2&chifn-α蛋白亚单位疫苗0.15ml；

第七组：pfastbacdaul-hbm-chifn-α&chil-2蛋白亚单位疫苗组，每只肌肉注射pfastbacdaul-hbm-chifn-α&chil-2蛋白亚单位疫苗0.15ml。

从图中可以发现，chifnα、chil2蛋白对vp2蛋白亚单位疫苗均具有免疫促进作用，且chil2的促进效果要好于chifnα；单独表达的chifnα、chil2共同作用于vp2蛋白亚单位疫苗是，二者之间的协同增效不显著，与单独使用chil2的免疫增强功能几乎一致；pfastbacdaul-hbm-chifn-α&chil-2蛋白能显著刺激vp2亚单位疫苗的抗体水平，pfastbacdaul-hbm-chil-2&chifn-α则表现平淡。

实施例4攻毒保护实验

取14日龄spf鸡随机分成8组，第一组和第八组每组10只，其余组每组20只，免疫、攻毒后连续观察10天，统计每天的发病(出现羽毛松乱，缩颈呆立，不愿动，不饮不食，畏寒发抖，肛门周围的羽毛污染严重视为发病)和死亡情况，结果见表1。

第一组：设为病毒对照组，每只肌肉注射生理盐水0.15ml；

第二组：vp2蛋白亚单位疫苗组，每只肌肉注射vp2蛋白亚单位疫苗0.15ml；

第三组：chifnα-vp2蛋白亚单位疫苗组，每只肌肉注射chifnα-vp2蛋白亚单位疫苗0.15ml；

第四组：chil2-vp2蛋白亚单位疫苗组，每只肌肉注射chil2-vp2蛋白亚单位疫苗0.15ml；

第五组：chifnα-chil2-vp2蛋白亚单位疫苗组，每只肌肉注射chifnα-chil2-vp2蛋白亚单位疫苗0.15ml；

第六组：pfastbacdaul-hbm-chil-2&chifn-α蛋白亚单位疫苗组，每只肌肉注射pfastbacdaul-hbm-chil-2&chifn-α蛋白亚单位疫苗0.15ml；

第七组：pfastbacdaul-hbm-chifn-α&chil-2蛋白亚单位疫苗组，每只肌肉注射pfastbacdaul-hbm-chifn-α&chil-2蛋白亚单位疫苗0.15ml。

第八组：设为空白对照组，不免疫和攻毒处理，单独饲养。

分组当天进行注射免疫，免疫后第七天进行鸡传染性法氏囊病度攻毒。

表1：

攻毒保护试验结果表明，chifnα、chil2具有的抗病、增强免疫活性能缩短vp2基因工程亚单位疫苗的保护空白期，两者单独表达后共同作用于vp2基因工程亚单位疫苗，协同增效作用不显著，但其共表达的pfastbacdaul-hbm-chifn-α&chil-2蛋白能显著提升vp2基因工程亚单位疫苗的保护效力，共表达的chifnα、chil2蛋白，协同增效明显。

实施例5pfastbacdaul-hbm-chifn-α&chil-2蛋白亚单位疫苗的制备方法

制备方法1：

将vp2蛋白用生理盐水稀释至蛋白含量为0.4mg/ml，加入终含量为800ng/ml的pfastbacdaul-hbm-chifn-α&chil-2蛋白，搅拌均匀后，铝胶佐剂和上述混合蛋白按1:5(v/v)混合制成鸡pfastbacdaul-hbm-chifn-α&chil-2亚单位疫苗。

制备方法2：

将vp2蛋白用生理盐水稀释至蛋白含量为0.8mg/ml，加入终含量为500ng/ml的pfastbacdaul-hbm-chifn-α&chil-2蛋白，搅拌均匀后，铝胶佐剂和上述混合蛋白按1:3(v/v)混合制成鸡pfastbacdaul-hbm-chifn-α&chil-2亚单位疫苗。

以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术中的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术特征的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些润饰和改进也应属于本发明的专利保护范围。