本发明涉及生物制品制备
技术领域：
，具体地涉及一种鸭瘟活疫苗及其制备方法。
背景技术：
鸭瘟（duckplague，dp），是由鸭瘟病毒（duckplaguevirus，dpv）引起的鸭、鹅及多种雁目禽类的一种急性败血性传染病。dpv传播迅速，流行广泛，发病率和死亡率非常高，给养鸭业造成巨大的经济损失，是危害养鸭业的最为严重的传染病之一。免疫接种鸭瘟病毒疫苗是防制鸭瘟的有效措施之一，生产鸭瘟病毒疫苗需要培养大量的鸭瘟病毒液。我国目前繁殖鸭瘟病毒所用的细胞为鸡胚成纤维原代细胞（cef）。虽然国家已规定所使用的鸡胚必须来源于spf鸡群，但是由于检测的滞后性及饲养环境的复杂性，使得生产鸭瘟用cef细胞存在外源病毒污染的安全隐患；另外，生产时要用大量鸡胚，劳动强度大，同时也加大了cef细胞被污染的可能性。目前已有报道表明鸡肝癌细胞系可作为鸭瘟病毒的宿主细胞，但是鸡肝癌细胞极不易培养，增加了鸭瘟病毒培养的生产成本。df-1细胞是一种可传代的鸡成纤维细胞系，来源于ell鸡胚胎，该细胞在形态上呈纤维状。df-1细胞系是一种稳定的、无肿瘤基因、自发无限增殖的细胞系。目前已有研究表明传染性法式囊病毒、鸡马立克氏病毒、新城疫病毒均能在df-1细胞上生长良好，但是没有df-1细胞系培养鸭瘟病毒方法的报道。现有技术中鸭瘟活疫苗的保存方法是-15℃以下保存24个月，该疫苗从生产、检验到出厂，再从经销商到用户至少需经2个月的时间，此间一旦储存温度超过-15℃这个“冷链”，就会造成疫苗中活病毒含量下降，影响疫苗的使用效果，甚至造成免疫失败。同时这种保存条件在一定程度上增加了保存成本，不利用运输和储存。若能提供一种保存条件温和的鸭瘟活疫苗，则有利于降低疫苗的保存成本，减少因保存条件改变所带来的疫苗品质的下降。技术实现要素：针对现有技术的不足，本发明的目的是在于提供一种无外源病毒污染、操作简便、成本低、保存条件温和的鸭瘟活疫苗及其制备方法。本发明提供的鸭瘟活疫苗中的鸭瘟病毒是以鸡胚成纤维细胞系df-1为宿主培养得到的。所述鸭瘟活疫苗通过以下步骤制备得到：（1）超剂量鸭瘟病毒液接种df-1细胞；（2）接毒后5-10日收获含病毒的细胞液，反复冻融后按照步骤（1）再次接种df-1细胞，如此盲传多代，至接种鸭瘟病毒后120小时内cpe达75%以上时收获病毒液；（3）收获的病毒液冻融后按照与df-1细胞液0.5%-5%的体积比接种于df-1细胞，培养，收获鸭瘟病毒液，鸭瘟病毒液中病毒含量不低于107.0tcid50/ml；（4）病毒液中加入耐热保护剂，冻干制得鸭瘟病毒活疫苗。步骤（1）所述超剂量为不低于106.5tcid50/ml的病毒液按照与df-1细胞液体积比的3%-12%接种量。步骤（1）所述df-1细胞液中添加9-11日龄的spf鸡胚尿囊液。步骤（1）所述df-1细胞液中添加体积比3%-8%的9-11日龄的spf鸡胚尿囊液。步骤（3）所述df-1细胞液中不添加鸡胚尿囊液。本发明的鸭瘟活疫苗每羽份疫苗中病毒含量不低于103.5tcid50。本发明的鸭瘟活疫苗含有耐热保护剂，该耐热保护剂含有以下配比的组分：明胶1%~4%，蔗糖5%~15%或海藻糖1%~5%，山梨醇1%~4%或甘露醇1%~3%，胰蛋白胨1%~4%或脱脂奶2%~6%，l-谷氨酸钠0.005%~0.1%或精氨酸0.5%~3%，溶剂为pbs溶液；所述%为各组分质量与耐热保护剂总体积的质量体积比。优选地，所述耐热保护剂含有以下配比的组分：明胶2%~4%，蔗糖9%~12%或海藻糖2.5%~5%，山梨醇2.5%~4%或甘露醇2%~3%，胰蛋白胨2%~4%或脱脂奶2%~5%，l-谷氨酸钠0.008%~0.03%或精氨酸1.5%~3%，溶剂为0.01-0.02m的pbs溶液。更优选地，本发明的耐热保护剂包括以下配比的组分：明胶2%，蔗糖10%，山梨醇4%，胰蛋白胨3%，l-谷氨酸钠0.01%；或明胶4%，蔗糖10%，山梨醇4%，胰蛋白胨3%，l-谷氨酸钠0.01%；或明胶2%，蔗糖10%，山梨醇4%，胰蛋白胨3%，l-谷氨酸钠0.01%；或，明胶2%，海藻糖5%，山梨醇3%，脱脂奶5%，精氨酸1.5%；或，明胶2%，蔗糖10%，甘露醇3%，脱脂奶2%，l-谷氨酸钠0.1%；或，明胶4%，海藻糖1%，甘露醇2%，脱脂奶4%，精氨酸3%；以上配比溶剂均为0.01m的pbs溶液。（1）制备a液按配方称取明胶、蔗糖（或过滤除菌的海藻糖）和胰蛋白胨（或脱脂奶），加入pbs溶液中至完全溶解，灭菌；（2）制备b液按配方称取山梨醇（或甘露醇）和l-谷氨酸钠（精氨酸），加入pbs溶液中至完全溶解，除菌；（3）将a液和b液按体积比1:1混合，制得耐热保护剂。本发明还提供了一种鸭瘟活疫苗的制备方法，所述鸭瘟活疫苗中的鸭瘟病毒是以鸡胚成纤维细胞系df-1为宿主培养得到的；每羽份疫苗中病毒含量不低于103.5tcid50；所述鸭瘟活疫苗通过以下步骤制备得到：（1）超剂量鸭瘟病毒液接种df-1细胞；（2）接毒后5-10日收获含病毒的细胞液，反复冻融后按照步骤（1）再次接种df-1细胞，如此盲传多代，至接种鸭瘟病毒后120小时内cpe达75%以上时收获病毒液；（3）收获的病毒液冻融后按照与df-1细胞液0.5%-5%的体积比接种于df-1细胞，培养，收获鸭瘟病毒液，鸭瘟病毒液中病毒含量不低于107.0tcid50；（4）按照与病毒液体积比1:1~1:5加入耐热保护剂。本发明的鸭瘟活疫苗的上述制备方法中，步骤（1）所述超剂量为不低于106.5tcid50/ml的病毒液按照与df-1细胞液体积比的3%-12%接种量。优选地，步骤（1）所述超剂量为106.5-107.5tcid50/ml的病毒液按照与df-1细胞液体积比的3%-12%接种量。更优选地，步骤（1）所述超剂量为107.5tcid50/ml的病毒液按照与df-1细胞液体积比的3-8%接种量。在本发明一个较佳实施例中，采用107.5tcid50/ml的病毒液按照与df-1细胞液体积比的5%接种量。本领域技术人员应当理解，无论采用上述列举的任一病毒含量或体积比，只要鸭瘟病毒的接种量足够大均适用于本发明的技术方案。其中，步骤（1）所述df-1细胞液中添加9-11日龄的spf鸡胚尿囊液。其中，步骤（1）所述df-1细胞液中添加体积比3%-8%的9-11日龄的spf鸡胚尿囊液。步骤（2）中，优选地，接毒后6-9日收获细胞液。优选地，反复冻融后按照步骤（1）再次接种df-1细胞，如此盲传多代，至接种后120小时内cpe达75%以上时收获病毒液；更优选地，至接种后72小时内cpe达75%以上时收获病毒液。步骤（3）所述df-1细胞液中不添加鸡胚尿囊液。本发明实施例所用的df-1细胞培养液含90%～92％体积百分比的dmem/f12液、抗生素和8%～10％体积百分比的牛血清，细胞培养液的ph值为7.0～7.2。所述的抗生素为100iu/ml青霉素和100iu/ml链霉素的组合。本发明实施例所用df-1细胞维持液含95%～98％体积百分比的dmem/f12液、抗生素和2%～5％体积百分比的牛血清，细胞维持液的ph值为7.2～7.4。所述的抗生素为100iu/ml青霉素和100iu/ml链霉素的组合。本发明不限于上述列举的细胞培养液和细胞维持液的配方，本领域技术人员可以采用本领域公知公用的其他能够培养df-1的方法来培养df-1细胞系按照本发明的培养方法，均能够实现本发明预期的技术效果。细胞传代时经edta-胰酶消化传代，用细胞培养液继续培养，形成传代细胞单层。本发明的有益效果在于：第一、本发明为鸭瘟病毒繁殖寻找到了一种新的宿主，用df-1细胞培养鸭瘟病毒，避免了现有技术中采用cef细胞培养病毒容易存在外源病毒污染的安全隐患，提高了鸭瘟疫苗的安全性。第二、本发明提供的鸭瘟病毒培养方法，能使鸭瘟病毒在df-1细胞系上生长良好，病毒含量达107.4~108.0tcid50/ml，病毒产量高于cef原代细胞，较cef细胞培养的病毒含量提高0.25-0.75个滴度。第三、由于df-1细胞是一种可传代的鸡成纤维细胞系，具有随用随取、省时省力的特点，因此在鸭瘟病毒液生产过程中，避免了现有技术中由于需要使用cef细胞而受到spf鸡胚供应和孵化日龄的限制，极大地简化了生产工艺和生产成本。第四、本发明的耐热保护剂制备简单，成本低，耐热保护效果好。常规鸭瘟活疫苗保存条件为-20℃保存24个月，而本发明的耐热保护剂可使鸭瘟活疫苗在2-8℃保存24个月，病毒含量和效价不降低，从而降低了疫苗的保存要求，有利于鸭瘟活疫苗的储存和运输，降低了生产成本，经济效益显著。具体实施方式为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。本文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。以下实施例中，df-1细胞购自舜冉（上海）生物科技有限公司。鸭瘟病毒为鸡胚化弱毒株av1222株，购自中国兽医药品监察所。除有特别说明，本发明中用到的各种试剂、原料均为可以从市场上购买的商品或者可以通过公知的方法制得的产品。实施例1鸭瘟病毒液的制备df-1细胞按照常规方法培养至单层后，设立接毒组和空白对照组。实验组是按体积比5%（即300ul）接种dpvf65代毒（cef细胞传代致弱的鸭瘟病毒液dpvf65代毒，病毒含量为107.5tcid50/ml），同时按细胞液体积6ml添加5%（即300ul）9~10日龄的spf鸡胚尿囊液，置37℃、5%co2条件下吸附60min，期间每隔15min轻轻摇动细胞瓶，吸附结束后补加维持液，同时设立cef细胞接种df-1细胞对照作为空白对照组，接种比例和添加尿囊液的量与鸭瘟病毒相同。每日观察细胞病变情况，若培养7日后仍不出现细胞病变则将接毒组的细胞瓶和空白对照组的细胞瓶置-20℃条件下冻融1次后按上述方法继续接种df-1细胞，连续盲传，每代培养7日后收获。接毒组dpvf66~f69代（即df-1细胞培养的第1-4代）均无明显细胞病变；dpvf70代培养6日后细胞出现明显病变，即细胞变圆，有颗粒状缺失，细胞拉网。随着代次增加，病变出现时间提早，病变越明显、越多，病变细胞开始脱落。dpvf72接种后48小时出现细胞病变，72小时cpe达75%以上。空白对照组始终未出现细胞病变。dpvf75代毒开始，接毒量调整至1%，同时不再添加9~10日龄的spf鸡胚尿囊液。接毒后病变时间推迟，96小时出现明显病变，120小时cpe达75%以上，随着代次增加，病变时间提早，dpvf77接种后48小时出现明显病变，72小时cpe达75%以上。空白对照组的操作与实验组相同，不同点在于空白对照组接种的是cef细胞。dpvf80~f100按体积比1%接种后48小时左右，细胞出现圆缩，有颗粒状缺失，病变细胞开始脱落，贴壁细胞出现拉网，胞浆内出现空泡，接种后72小时cpe达75%以上。实施例2病毒含量的测定将实施例1中收获的dpvf80~f100不同代次病毒液用无血清m199作10倍系列稀释，取4个适宜稀释度，分别接种已长成良好单层的cef细胞96孔微量细胞培养板，每个稀释度接种6孔，每孔0.1ml，同时设正常细胞对照。置37℃、含5%co2培养箱中吸附1小时后，每孔补加含4%血清的m199维持液0.1ml，观察120～144小时，记录细胞病变（cpe）孔数。按reed-muench法计算tcid50,结果表明dpvf80~f100代病毒含量稳定，病毒含量达107.4~108.0tcid50/ml。表1病毒含量检测结果实施例3df-1细胞生产的dpvf80、f86、f95代毒特异性鉴定将实施例1中收获的f80、f86、f95代病毒液用无血清m199稀释至含100tcid50/0.1ml，与等量抗鸭瘟病毒特异性血清混合后，37℃中和1小时，接种6个已长成cef单层的细胞孔（48孔细胞板），每孔0.2ml，同时设病毒对照和正常细胞对照各6孔。置37℃、含5%co2培养箱培养并观察120-144小时，结果中和组和正常细胞对照组均无细胞病变，病毒对照组细胞均出现细胞病变。本实施例中所用的抗鸭瘟病毒特异性血清的制备方法为：（1）抗鸭瘟病毒特异性血清的制备方法取9周龄spf鸡40只，每只肌肉注射实施例1收获的鸭瘟病毒f80代病毒液0.5ml（病毒含量为107.6tcid50/ml）；14天后每只肌肉注射鸭瘟病毒f80代病毒液0.2ml和鸭瘟病毒f80代毒株的灭活疫苗1.0ml（灭活前病毒含量为107.6tcid50/ml）；然后再用鸭瘟病毒f80代毒株灭活疫苗加强免疫2次，每只1.0ml。4次免疫后28天采集血清，检测中和抗体效价。当抗体水平达到峰值时大量采血，分离血清。（2）抗鸭瘟病毒特异性血清标准【性状】淡黄色澄清液体。【无菌检验】按现行《中国兽药典》附录3306进行检验，应无菌生长。【支原体检验】按现行《中国兽药典》附录3308进行检验，应无支原体污染。【特异性鉴定】鸡新城疫、禽流感、禽腺病毒（有血凝性）均为hi抗体阴性；鸡传染性支气管炎病毒、禽网状内皮组织增生症病毒、禽白血病病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、鸡传染性贫血病毒、禽呼肠孤病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、禽脑脊髓炎病毒均为elisa抗体阴性；鸡痘病毒、鸡马立克氏病病毒、禽腺病毒（ⅰ群）；鸭肝炎、鸭坦布苏病毒病中和抗体阴性。【中和效价测定】与鸭瘟病毒的中和抗体效价应不低于1:64。【贮藏与有效期】-70℃以下保存，保存期暂定为24个月。实施例4dpvf80、f86、f95代毒外源病毒检测（1）pcr方法检测鸭坦布苏病毒dtmuv、鸭肝炎ⅰ型病毒dhv-1和鸭肝炎ⅲ型病毒dhv-3取dpvf80、f86、f95不同代次病毒液用试剂盒提取rna，用反转录试剂盒反转录成cdna后进行pcr检测。引物序列见表2。表2pcr反应体系：dna模板10µl，10×pcrbuffer5µl，2.5mmol/ldntp2µl，上游引物1µl，下游引物1µl，extaq酶1µl，ddh2o30µl。pcr反应程序：（a）鸭坦布苏病毒（dtmuv）pcr反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性40秒，56℃退火40秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；72℃延伸10分钟。（b）鸭肝炎ⅰ型病毒（dhv-1型）pcr反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，50℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，35个循环；72℃延伸10分钟。（c）鸭肝炎ⅲ型病毒（dhv-3型）pcr反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，30个循环；72℃延伸5分钟。pcr检测结果：实施例1制得的f80、f86、f95代毒（也即df-1细胞上传代的第15、21、30代毒）三个代次的病毒液经pcr检测鸭坦布苏病毒、鸭肝炎ⅰ型病毒和鸭肝炎ⅲ型病毒抗原均为阴性，未扩增到表2中的三条目的条带，说明实施例1方法制得的鸭瘟病毒液未受到常见3种鸭外源病毒的污染。（2）鸡检查法取dpvf80、f86、f95不同代次病毒液用灭菌生理盐水稀释至每毫升含103.5tcid50，每个代次病毒液肌肉注射10周龄spf鸡20只，1ml/只。14日后，每只点眼、滴鼻接种0.1ml（含104.5tcid50）、肌肉注射1ml（含105.5tcid50）。观察21日后，按上述方法和剂量重复接种1次。第2次接种后21日采血，分离血清。在56日内，不应有疫苗引起的局部或全身症状或呼吸道症状或死亡。如果有死鸡，应进行病理学检查，以证明是否由鸭瘟病毒所致。对分离的血清用hi检验方法测定鸡新城疫病毒、腺病毒（有血凝性）、h5亚型禽流感病毒、h9亚型禽流感病毒抗体；用elisa方法测定鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、禽白血病病毒、禽网状内皮增生症病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、鸡传染性贫血病毒、禽呼肠孤病毒和禽脑脊髓炎病毒的抗体；用agp方法进行鸡马立克氏病病毒的抗体检测；用中和试验测鸭坦布苏病毒、鸭肝炎病毒抗体。结果：3个代次的病毒液分别两次接种雏鸡后，56日采血，进行血清抗体检测，抗体检测均为阴性。在56日内，均未引起局部或全身症状或呼吸道症状或死亡，详见表3。表3外源病毒检测方法与结果注：“—”表示阴性。实施例5dpvf80、f86、f95代毒在cef细胞和df-1细胞上增殖的病毒含量的比较和将实施例1中在df-1细胞上驯化的dpvf80、f86、f95代毒和不经df-1细胞驯化的dpvf65代毒（即实施例1的初始接毒毒种）分别按体积比1%接种已长成良好单层的df-1细胞和cef细胞，37℃吸附60分钟后加入细胞维持液继续置37℃、5%co2培养，每日观察细胞病变，当细胞病变达75%左右时收获病毒液（cpe达75%为终判标准），收获的病毒液置-20℃冻融1次后取样用cef细胞进行病毒含量的测定，按上述方法将dpvf80、f86、f95代毒及dpvf65代毒分别在cef细胞和df-1细胞上连续繁殖3代（每代做5个重复试验，取其平均数，见表4），每代取样用cef细胞进行病毒含量的测定。表4不同代次毒分别的cef细胞和df-1细胞上tcid50测定结果表4结果表明在df-1细胞上驯化的dpvf80、f86、f95代毒在cef细胞和df-1细胞均增殖良好，在df-1细胞上增殖的病毒含量略高于cef细胞，约0.25~0.75个滴度；在df-1细胞上驯化的dpvf80、f86、f95代毒与不经df-1细胞驯化的dpvf65代毒在cef细胞上的增殖的病毒含量与收获时间无明显差异；不经本发明提供的df-1细胞驯化方法的dpvf65代毒能在cef细胞增殖，但是不能在df-1细胞增殖。对比试验1、关于接毒量1.1参照实施例1的方法，设置多个接毒量对比组，其他步骤和参数均同实施例1，仅每次盲传的接毒量按照下面不同组的设置进行，连续盲传，记录开始出现cpe的盲传代，结果见表5。表5不同接毒量组经多次盲传后细胞病变情况表5结果表明，当种毒病毒含量不低于106.5tcid50/ml，接种量体积比在3%~12%范围内，连续盲传5~10代后，均能在df-1细胞上产生cpe；若种毒病毒含量为107.0tcid50/ml，接毒比例为0.5%时，则盲传15代后，仍不出现cpe；若种毒病毒含量为106.0tcid50/ml，接毒比例为10%时，盲传15代后也不出现cpe。1.2取已长成良好单层的df-1细胞，将实施例1中在df-1细胞上驯化的dpvf80分别按体积比0.1%、0.3%、0.5%、1%、2%、5%、10%共7个不同的接毒量，接种df-1细胞，37℃吸附1小时，加维持液后置37℃继续培养，接毒后每日观察，当cpe达到75%以上时收获病毒液，收获的毒液置-20℃以下保存，将收获的细胞毒液，冻融1次后测定病毒含量。结果见表6。表6不同接毒量收获毒液的病毒含量测定（tcid50/ml）组别收毒时间病毒含量（tcid50/ml）0.1%150h106.150.3%124h106.750.5%92h107.51%70h107.62%65h107.365%50h107.010%36h106.5表6结果表明，0.1%、0.3%、0.5%、1%、2%、5%、10%不同的接毒量所收获的鸭瘟病毒液病毒含量不同，分别为106.15、106.75、107.5、107.6、107.36、107.0、106.5tcid50/ml，收获时间也不一样，分别为150、124、92、70、65、50、36小时；根据实际生产情况、降低料耗和生产成本方面考虑，将鸭瘟病毒液生产时的病毒接种量与df-1细胞液的体积比确定为0.5%~2%。2、关于添加鸡胚尿囊液2.1将实施例1中在df-1细胞上驯化的dpvf71代毒按体积比5%接种df-1细胞，同时按体积比设（1）-（8）分别为：无添加组、添加1%、2%、3%、5%、6%、8%、10%比例的鸡胚尿囊液的对比试验，细胞病毒达75%以上时收获病毒液。其他步骤和参数均与实施例1相同，不同点在于是否添加鸡胚尿囊液和添加的比例。结果见表7。表7添加不同比例鸡胚尿囊液对收毒时间的影响组别收毒时间病毒含量（tcid50/ml）0%10d105.51%9d105.752%8d106.03%7d106.54%150h106.755%140h107.256%120h107.08%72h107.010%72h107.0表7结果表明dpvf71代毒按体积比5%接种df-1细胞，按体积比分别添加3%~8%鸡胚尿囊液，收毒时间在72h~7d，病毒含量在106.5~7.25tcid50/ml。尿囊液的添加量低于3%，收毒时间更长，且病毒含量比较低，尿囊液的添加量高于10%，收毒时间与病毒含量则无明显改进。2.2将实施例1中在df-1细胞上驯化的dpvf74代毒按体积比1%接种df-1细胞，同时设（1）-（8）组，分别为无添加组、添加1%、2%、3%、5%、6%、8%、10%比例的鸡胚尿囊液的对比试验，细胞病毒达75%以上时收获病毒液。其他步骤和参数均与实施例1相同，不同点在于是否添加鸡胚尿囊液和添加的比例。结果见表8。表8添加不同比例鸡胚尿囊液对收毒时间的影响组别收毒时间病毒含量（tcid50/ml）0%120h107.361%108h107.42%100h107.43%96h107.54%90h107.45%80h107.256%72h107.48%72h107.2510%72h107.4表8结果表明，dpvf74代毒按体积比1%接种df-1细胞，按体积比以不同量添加鸡胚尿囊液，随着添加比例的增加，收获时间在72~120小时之间，均在可接受范围，且病毒含量无明显变化，为了尽可能降低外源病毒污染的可能，此时可考虑不再添加鸡胚尿囊液。3、关于收毒时间参照实施例1的方法，dpvf65代毒（即实施例1的初始接毒毒种）接毒后分不同时间收毒，其他步骤和参数均同实施例1，仅每次盲传的收毒时间按照下面不同组的设置进行，连续盲传，记录开始出现cpe的盲传代次、不同收获时间的接毒组和正常细胞对照组细胞病变情况，结果见表9。表9盲传时不同收毒时间对病毒驯化的影响组别收毒时间开始出现cpe的盲传代次接毒组cpe情况正常细胞组情况1接毒后2天15代无cpe细胞正常2接毒后3天15代无cpe细胞正常3接毒后4天15代无cpe细胞正常4接毒后5天10代有cpe细胞正常5接毒后6天8代有cpe细胞正常6接毒后7天6代有cpe细胞正常7接毒后8天5代有cpe细胞正常8接毒后9天5代有cpe细胞正常9接毒后10天5代有cpe细胞正常10接毒后11天1代/细胞出现异常表9结果表明dpvf65代毒接种df-1细胞培养5~10天后收获，连续盲传，盲传5~10代后接毒组细胞开始出现cpe；接毒后2~4天收获连续盲传15代接毒组仍无cpe出现，接毒后11天收获不合适，此时正常细胞已不能维持正常状态。因此，选择在dpvf65代毒接种df-1细胞培养6-9天后收获病毒液，再连续盲传。实施例6关于耐热保护剂配方不同、用量不同的对比试验本发明中，涉及耐热保护剂配方的%为各组分质量与耐热保护剂总体积的质量体积比。磷酸盐缓冲液（0.01mol/lpbs，ph值7.2~7.4）配方为以下：氯化钠8.0g氯化钾0.2g十二水合磷酸氢二钠2.9g磷酸二氢钾0.2g注射用水加至1000ml用盐酸将ph值调至7.2~7.4。1、配方1及其在制备鸭瘟疫苗中的应用耐热保护剂含有以下配比的组分：明胶2%，蔗糖10%，山梨醇4%，胰蛋白胨3%，l-谷氨酸钠0.01%。上述耐热保护剂的制备方法及应用，包括以下步骤：（1）制备a液按配方称取明胶、蔗糖和胰蛋白胨，加入0.01m的pbs溶液中至完全溶解，再于121℃灭菌30min；（2）制备b液按配方称取山梨醇和l-谷氨酸钠，加入0.01m的pbs溶液中至完全溶解，过滤除菌；（3）将a液和b液按体积比1:1混合，制得耐热保护剂。（4）将上述制备好的耐热保护剂与鸭瘟病毒液按体积比1:1混合得冻干液，然后进行冻干处理制得鸭瘟活疫苗。其中，冻干工艺包括：在1.5h内将板层温度降到-38℃并维持3~6h，3h将板层温度由-38℃升至-6℃并维持12~15h，再升温至0℃，维持5~8h，再升温至10℃，维持3~6h，再升温至30℃，维持4~6h。2、配方2及其在制备鸭瘟疫苗中的应用耐热保护剂含有以下配比的组分：明胶4%，蔗糖5%，山梨醇2%，胰蛋白胨1%，l-谷氨酸钠0.1%。（1）制备a液按配方称取明胶、蔗糖和胰蛋白胨，加入0.01m的pbs溶液中至完全溶解，再于121℃灭菌30min；（2）制备b液按配方称取山梨醇和l-谷氨酸钠，加入0.01m的pbs溶液中至完全溶解，过滤除菌；（3）将a液和b液按体积比1:1混合，制得耐热保护剂。（4）将上述制备好的耐热保护剂与鸭瘟病毒液按体积比1:1混合得冻干液，然后进行冻干处理制得鸭瘟活疫苗。其中，冻干工艺参见配方1的冻干工艺。3、配方3及其在制备鸭瘟疫苗中的应用耐热保护剂包括以下配比的组分：明胶1%，蔗糖15%，山梨醇4%，胰蛋白胨4%，l-谷氨酸钠0.005%。上述鸭瘟活疫苗耐热保护剂的制备方法和应用，包括以下步骤：（1）制备a液按配方称取明胶、蔗糖和胰蛋白胨，加入0.01m的pbs溶液中至完全溶解，再于121℃灭菌30min；（2）制备b液按配方称取山梨醇和l-谷氨酸钠，加入0.01m的pbs溶液中至完全溶解，过滤除菌；（3）将a液和b液按体积比1:1混合，制得耐热保护剂。（4）将上述制备好的耐热保护剂与鸭瘟病毒液按体积比1:1混合得冻干液，然后进行冻干处理制得鸭瘟活疫苗。其中，冻干工艺参见配方1的冻干工艺。4、配方4及其在制备鸭瘟疫苗中的应用一种鸭瘟活疫苗耐热保护剂的组分：聚乙烯吡咯烷酮（pvp-k30）3%，蔗糖10%，山梨醇3%，胰蛋白胨1%，l-谷氨酸钠0.01%。上述鸭瘟活疫苗耐热保护剂的制备方法和应用，包括以下步骤：（1）制备a液按配方称取蔗糖和胰蛋白胨，加入0.01m的pbs溶液中至完全溶解，再于121℃灭菌30min；（2）制备b液按配方称取聚乙烯吡咯烷酮（pvp-k30）、山梨醇和l-谷氨酸钠，加入0.01m的pbs溶液中至完全溶解，过滤除菌；（3）将a液和b液按体积比1:1混合，制得耐热保护剂。（4）将上述制备好的耐热保护剂与鸭瘟病毒液按体积比1:1混合得冻干液，然后进行冻干处理制得鸭瘟活疫苗。其中，冻干工艺参见配方1的冻干工艺。5、配方5及其在制备鸭瘟疫苗中的应用耐热保护剂包括：明胶2%，海藻糖5%，山梨醇3%，脱脂奶5%，精氨酸盐酸盐1.5%。上述鸭瘟活疫苗耐热保护剂的制备方法，包括以下步骤：（1）制备a液按配方称取明胶和脱脂奶，加入0.01m的pbs溶液中至完全溶解，再于121℃灭菌30min；（2）制备b液按配方称取海藻糖、山梨醇和精氨酸盐酸盐，加入0.01m的pbs溶液中至完全溶解，过滤除菌；（3）将a液和b液按体积比1:1混合，制得耐热保护剂。（4）将上述制备好的耐热保护剂与鸭瘟病毒液按体积比1:1混合得冻干液，然后进行冻干处理制得鸭瘟活疫苗。其中，冻干工艺参见配方1的冻干工艺。6、配方6及其在制备鸭瘟疫苗中的应用一种鸭瘟活疫苗耐热保护剂含有以下配比的组分：明胶2%，蔗糖12%，甘露醇3%，脱脂奶2%，l-谷氨酸钠0.1%。上述鸭瘟活疫苗耐热保护剂的制备方法，包括以下步骤：（1）制备a液按配方称取明胶、蔗糖和脱脂奶，加入0.01m的pbs溶液中至完全溶解，再于121℃灭菌30min；（2）制备b液按配方称取甘露醇和l-谷氨酸钠，加入0.01m的pbs溶液中至完全溶解，过滤除菌；（3）将a液和b液按体积比1:1混合，制得耐热保护剂。（4）将上述制备好的耐热保护剂与鸭瘟病毒液按体积比1:1混合得冻干液，然后进行冻干处理制得鸭瘟活疫苗。其中，冻干工艺参见配方1的冻干工艺。7、配方7及其在制备鸭瘟疫苗中的应用一种鸭瘟活疫苗耐热保护剂含有以下配比的组分：明胶4%，海藻糖1%，甘露醇2%，脱脂奶4%，精氨酸盐酸盐3%。上述鸭瘟活疫苗耐热保护剂的制备方法，包括以下步骤：（1）制备a液按配方称取明胶和脱脂奶，加入0.01m的pbs溶液中至完全溶解，再于121℃灭菌30min；（2）制备b液按配方称取海藻糖、甘露醇和精氨酸盐酸盐，加入0.01m的pbs溶液中至完全溶解，过滤除菌；（3）将a液和b液按体积比1:1混合，制得耐热保护剂。（4）将上述制备好的耐热保护剂与鸭瘟病毒液按体积比1:1混合得冻干液，然后进行冻干处理制得鸭瘟活疫苗。其中，冻干工艺参见配方1的冻干工艺。8、配方8及其在制备鸭瘟疫苗中的应用一种鸭瘟活疫苗耐热保护剂含有以下组分：明胶5%，海藻糖1%，甘露醇2%，胰蛋白胨1%，精氨酸盐酸盐5%。上述鸭瘟活疫苗耐热保护剂的制备方法，包括以下步骤：（1）制备a液按配方称取明胶和胰蛋白胨，加入0.01m的pbs溶液中至完全溶解，再于121℃灭菌30min；（2）制备b液按配方称取海藻糖、甘露醇和精氨酸盐酸盐，加入0.01m的pbs溶液中至完全溶解，过滤除菌；（3）将a液和b液按体积比1:1混合，制得耐热保护剂。（4）将上述制备好的耐热保护剂与鸭瘟病毒液按体积比1:1混合得冻干液，然后进行冻干处理制得鸭瘟活疫苗。其中，冻干工艺包括：参加配方1的冻干工艺。将实施例6制备的8组耐热保护剂鸭瘟活疫苗和使用常规保护剂（常规保护剂1：6%蔗糖和12%脱脂奶；常规保护剂2：2%的明胶和10%的蔗糖）采用常规冻干工艺制得的鸭瘟活疫苗，比较其物理参数以及在37℃条件下和2~8℃条件下放置不同时间后病毒含量情况，单位为lgtcid50/羽份。结果分别见表10和表11。表10不同耐热保护剂在37℃条件下对疫苗的保护结果由表10可知，鸭瘟病毒用常规保护剂和耐热保护剂进行冻干，其冻干损失都是非常小（0.25个滴度内），但是耐热后病毒含量损失差异非常明显。2个常规保护剂37℃耐热10d病毒含量降低1.0~1.25个滴度；耐热保护剂配方4和配方8在保护的范围外对鸭瘟病毒的保护效果不是很好，37℃耐热10d病毒含量降低1.0个滴度，37℃耐热30d病毒含量降低至0；配方1-3，配方5-7耐热保护剂37℃耐热10d病毒含量损失很小，降低0.25~0.50个滴度，37℃耐热30d病毒含量损失很小，降低0.75~1.0个滴度。表11不同耐热保护剂在2~8℃对鸭瘟活疫苗的保护结果由表11可知，鸭瘟病毒用常规保护剂和耐热保护剂进行冻干，其冻干损失都非常小（0.25个滴度内）。2~8℃保存12个月，配方4、配方8和2个常规保护剂配方冻干的鸭瘟病毒病毒含量均降低0.4~0.5个滴度，配方1-3、配方5-7的病毒含量损失非常小（0~0.25个滴度内）；2~8℃保存24个月，配方4、配方8和2个常规保护剂配方冻干的鸭瘟病毒病毒含量均降低1.0个滴度，配方1-3、配方5-7的病毒含量损失非常小（0.25~0.5个滴度内）。实施例7关于保护剂与病毒液不同比例配比的对比试验将收获的病毒液（107.5tcid50/ml）分别稀释至107.0tcid50/ml、106.75tcid50/ml、106.5tcid50/ml、106.0tcid50/ml，在这5个不同浓度的病毒液中分别按1%体积比加入抗生素，然后分别与实施例6配制好的耐热保护剂配方1和常规保护剂1根据病毒含量高低依次按体积比1:1、1:2、1:3、1:4、1:5加入耐热保护剂配方1或常规保护剂1，混合均匀后定量分装，经冷冻真空干燥后压盖贴签，制备的鸭瘟活疫苗置37℃保存。比较其物理参数以及在37℃条件下放置不同时间后病毒含量情况，单位为lgtcid50/ml。结果见表12。表12不同保护剂与不同含量病毒液不同比例配比在37℃条件下对疫苗的保护结果由表12可知，耐热保护剂配方1与常规保护剂1与不同含量病毒液以不同比例配比冻干后在37℃条件下耐热不同时间的结果显示：根据病毒含量不同，耐热保护剂配方1与病毒液的体积比1:1~1:5在37℃耐热10d对鸭瘟病毒的病毒含量损失都非常小，降低0.25~0.35个滴度，37℃耐热30天，降低0.87~1.1个滴度；而常规保护剂1与不同病毒液的体积比1:1~1:5在37℃耐热10d对鸭瘟病毒的病毒含量损失比较大，降低1.0~1.25个滴度，37℃耐热30d，降低3个滴度以上。实施例8鸭瘟活疫苗的制备与检验将实施例1制得的f80鸭瘟病毒液按细胞维持液的体积比1%接种df-1单层细胞，37℃培养，当病变达75％以上时，收获的细胞病毒液作为生产用毒种。制苗用细胞的传代与培养：df-1按常规方法培养至细胞满单层后，弃去生长液，用灭菌pbs清洗细胞表面1次，经胰酶-edta消化液消化传代，加入细胞生长液继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒。制苗用病毒液的制备：选用生长良好的df-1细胞，弃去细胞培养液，按1%接毒量接种生产用毒种，置37～38℃培养。接毒后当病变达75％以上收获病毒液，-15℃下冻融1次后保存备用。配苗、分装与冻干：在收获的病毒液中按1%体积比加入抗生素，然后与实施例6配制好的耐热保护剂配方1按体积比1:1混合均匀后定量分装。经冷冻真空干燥后压盖贴签，制备的鸭瘟活疫苗置2~8℃保存。按上述方法制备3批（批号为201701、201702、201703）鸭瘟活疫苗，分别取样进行成品检验。1、性状检验肉眼观察观察3批疫苗，外观均为海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。2、无菌检验、支原体检验、剩余水分测定和真空度测定按现行《中国兽药典》附录进行检验，201701、201702、201703批均无细菌、霉菌和支原体污染，剩余水分和真空度测定均合格。具体结果见表13。表133批产品的检验结果3、外源病毒检验3.1pcr方法检测鸭坦布苏病毒、鸭肝炎ⅰ型病毒和鸭肝炎ⅲ型病毒参照实施例4的pcr方法，结果显示3批实验室产品经pcr检测鸭坦布苏病毒、鸭肝炎ⅰ型病毒和鸭肝炎ⅲ型病毒抗原均为阴性。3.2鸡检查法由于制备的鸭瘟阳性血清不能完全中和10羽份（不低于104.5tcid50）的疫苗，故采用鸡检验法进行：将疫苗用灭菌生理盐水稀释至1羽份/ml，每批疫苗肌肉注射9周龄spf鸡20只，1羽份/只，14日后，每只点眼、滴鼻接种0.1ml（含疫苗10羽份）、肌肉注射1ml（含疫苗100羽份）。观察21日后，按上述方法和剂量重复接种1次。第2次接种后21日采血，分离血清，进行有关病原的血清抗体检验。在56日内，不应有疫苗引起的局部或全身症状或呼吸道症状或死亡。如果有死鸡，应进行病理学检查，以证明是否由鸭瘟病毒所致。对分离的血清用hi检验方法测定鸡新城疫病毒、腺病毒（有血凝性）、h5亚型禽流感病毒、h9亚型禽流感病毒抗体；用elisa方法测定鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、禽白血病病毒、禽网状内皮增生症病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、禽呼肠孤病毒和禽脑脊髓炎病毒的抗体；用agp方法进行鸡马立克氏病病毒的抗体检测。结果显示3批疫苗（201701、201702、201703）两次接种雏鸡后，56天采血，进行血清抗体检测，抗体检测均为阴性。在56日内，201701、201702、201703批疫苗均未引起局部或全身症状或呼吸道症状或死亡，具体结果见表14。表14外源病毒检测方法与结果注：“—”表示阴性。4、鉴别检验3批疫苗（201701、201702、201703）分别用无血清m199稀释至100tcid50/0.1ml，与抗鸭瘟病毒特异性阳性血清等量混合，37℃中和1小时，接种6个已长成cef单层的细胞孔（48孔细胞板），每孔0.2ml，同时设病毒对照和正常细胞对照各6孔。置37℃、含5%co2培养箱培养并观察120-144小时。结果中和组和细胞对照组均无cpe，不中和病毒对照组均出现典型的cpe变化。5、安全检验按瓶签注明羽份，将疫苗用灭菌生理盐水稀释至10羽份/ml，接种2月龄健康易感鸭，10只/组，肌肉注射，1ml/只，另取10只条件相同的易感鸭，每只肌肉注射1ml灭菌生理盐水作为对照，隔离饲养。接种后观察14日，记录鸭的健康情况，并在第14日剖杀观察病理变化。结果表明3批实验室产品接种2月龄健康易感鸭在14日观察期内，精神状态、饮食和粪便均正常，所有鸭均健活。第14日剖检观察各组织器官均无肉眼可见病变。结果见表15。表153批实验室产品的安全性检验结果6、效力检验6.1病毒含量测定按瓶签注明羽份，将疫苗用无血清m199稀释至每0.1ml含1羽份，再继续作10倍系列稀释，取10-2、10-3、10-4、10-54个适宜稀释度，分别接种已长成良好单层的cef细胞96孔微量细胞培养板，每个稀释度接种6孔，每孔0.1ml，同时设正常细胞对照6孔。置37℃、含5%co2培养箱中吸附1小时后，每孔补加含4%血清的m199维持液0.1ml，培养并观察120～144小时。根据cpe产生情况，按reed-muench法计算tcid50。6.2用鸭检验取2月龄健康易感鸭10只，按瓶签注明羽份，每只肌肉注射接种疫苗1/50羽份，另设10只不免疫作对照，在同样条件下隔离饲养。14日后，每只鸭肌肉注射检验用强毒(cvccav1221)1.0ml（含1000mld），攻毒后观察14日，记录试验鸭的发病死亡结果。6.3耐老化试验3批疫苗每批每次抽取4瓶，置37℃温箱中放置7日、10日、30日后按6.1项进行病毒含量的测定。效力检验结果：3批实验室产品每羽份的病毒含量分别为104.0tcid50、104.0tcid50、104.25tcid50；3批实验室疫苗样品在37℃温箱中放置7日、10日后，疫苗每羽份的病毒含量均在103.5tcid50以上；在37℃温箱中放置30日后，疫苗每羽份的病毒含量均在103.0tcid50以上；以1/50羽份免疫2月龄易感鸭后14日攻毒，未免疫对照鸭全部死亡，3个免疫组鸭全部健活，保护率均为100%。结果详见表16、表17。表163批实验室产品的病毒含量测定及免疫鸭的攻毒保护结果批号病毒含量死亡率保护率201701104.0tcid50/羽份0%（0/10）100%（10/10）201702104.0tcid50/羽份0%（0/10）100%（10/10）201703104.25tcid50/羽份0%（0/10）100%（10/10）对照组／100%（10/10）/表173批实验室产品37℃耐老化后的病毒含量测定（tcid50/羽份）批号耐热前37℃耐热7d37℃耐热10d37℃耐热30d201701104.0103.75103.6103.25201702104.0103.75103.6103.25201703104.25103.75103.75103.4实施例9本发明的鸭瘟活疫苗与现有同类产品安全性和效力比较试验材料：用df-1细胞生产的鸭瘟活疫苗（f80株），批号为201701，对照疫苗为市售鸡胚成纤维细胞（cef）制备的鸭瘟活疫苗（av1222株），批号为2017001。1、安全性检验将201701批鸭瘟活疫苗（f80株）和2017001批鸭瘟活疫苗（av1222株），分别肌肉注射60~70日龄易感鸭10只，每只1ml（含10羽份），同时设对照鸭10只。隔离饲养，观察14日，结果见表18。表18201701批和2017001批鸭瘟活疫苗的安全性比较结果组别精神、饮食、粪便存活情况剖检结果201701批均正常10/10健活10/10肠道、胸腺、肝脏及其它脏器等均无病理变化2017001批均正常10/10健活10/10肠道、胸腺、肝脏及其它脏器等均无病理变化对照组均正常10/10健活10/10肠道、胸腺、肝脏及其它脏器等均无病理变化2、效力检验将201701批鸭瘟活疫苗（f80株）和2017001批鸭瘟活疫苗（av1222株），分别肌肉注射60~70日龄易感鸭10只，每只1ml（含1/50羽份），同时设注射稀释液对照鸭10只。隔离饲养，免疫14日后，用鸭瘟强毒av1221株攻毒，肌肉注射，1ml/只（含1000mld）。攻毒后观察14日，结果未免疫对照鸭在攻毒后第4天出现精神沉郁、厌食等症状，并开始出现死亡，至第7天全部死亡。2个免疫组鸭全部健活，保护率均为100%，详见表19。表19201701批和2017001批鸭瘟活疫苗免疫效力比较试验结果以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案做出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。序列表<110>广东永顺生物制药股份有限公司<120>一种鸭瘟活疫苗及其制备方法<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ggatgcgtcgtacgtgct18<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2cgtcgttcccagattcca18<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3ggggagaccaaacgacaa18<210>4<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4cacccatcaccattctataagc22<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5gccaatacaaggggagtcgc20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6cgaaatgggcgatggttgcg。序列表<110>广东永顺生物制药股份有限公司<120>一种鸭瘟活疫苗及其制备方法<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ggatgcgtcgtacgtgct18<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2cgtcgttcccagattcca18<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3ggggagaccaaacgacaa18<210>4<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4cacccatcaccattctataagc22<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5gccaatacaaggggagtcgc20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6cgaaatgggcgatggttgcg20当前第1页12