本发明属于化学合成及生物医药领域，具体一种还原及ph双重响应性的纳米胶束及其制备方法与应用。
背景技术
纳米胶束可以通过增溶作用提高疏水性抗癌药物在水溶液中的稳定性，能同时载成像染料和药物，实现观察治疗效能的实时监控。载药纳米胶束可以通过被动靶向作用到达肿瘤部位，因而降低了疏水抗癌药物在正常组织中的毒副作用，提高了药物治疗癌症的效果。纳米胶束的这些优异特性为癌症化疗提供了更有效的给药方法。
两亲性聚合物通过自组装形成的聚集体如纳米粒子、纳米胶束、聚合物囊泡等药物载体虽然可延长药物载体在体内的循环时间，增加药物载体在肿瘤部位的蓄积，但往往不能有效地将包载的药物释放出来，从而降低了药效。根据肿瘤细胞的细胞内环境，开发具有环境响应性(如ph、温度、氧化还原等)的纳米药物载体，可以有效的提高药物的释放速率，减少药物在体内的毒副作用，提高了抗癌药的治疗效果。生物医用材料的生物相容性和生物可降解性能是临床应用中需要考虑的重要因素，聚氨酯材料的生物相容性好，理化性质稳定,在生物医学已有广泛的应用，如心脏瓣膜、人造血管、人造导管等。
由于聚恶唑啉在酸性环境下具有溶胀的特性，使这种以聚恶唑啉作为亲水段的两亲聚氨酯组装的胶束具有ph响应性。这种特性使得聚氨酯载药胶束在细胞的内涵体/溶酶体的酸性环境下(ph5.0-5.5)可以迅速溶胀并释放药物。现有的单响应聚合物载药胶束在24h内往往仅能释放70％左右的抗癌药(yao,etal.rscadv.2016,6:9082-9089)，药物载体缓慢和不完全释放药物导致肿瘤部位药物浓度过低，抗肿瘤作用下降，甚至引起这种药物的耐药性。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种还原及ph双重响应性的纳米胶束及其制备方法与应用，以解决两亲性共聚物通过自组装形成药物载体不能有效地将药物释放出来，导致药效低的问题。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种还原及ph双重响应性的纳米胶束，具有亲水壳和疏水内核，其是由两亲性聚氨酯通过自组装形成。两亲性聚氨酯的疏水链段为含有还原敏感的二硫键的聚氨酯，亲水链段为具有ph响应性的聚恶唑啉。
进一步的，两亲性聚氨酯是聚恶唑啉-聚氨酯-聚恶唑啉，所述亲水壳为聚恶唑啉，聚恶唑啉分子量为1500-10000da，所述疏水内核为聚氨酯，聚氨酯的分子量为2000-50000da。
上述两亲性聚氨酯的制备方法，于惰性气氛中，末端为羟基的聚酯二醇与二异氰酸酯在有机溶剂中反应合成聚氨酯预聚体，之后在室温条件下用聚恶唑啉封端得到最终产物。
进一步的，所述聚酯二醇为聚己内酯、聚碳酸酯或聚乳酸；所述二异氰酸酯为胱胺二异氰酸酯cdi、l-赖氨酸乙酯二异氰酸酯ldi或六亚甲基二异氰酸酯hdi。
进一步的，还包括所述聚恶唑啉的制备：于惰性气氛中，对甲苯磺酸甲酯开环聚合2-乙基-2-恶唑啉得到所述聚恶唑啉。
上述一种还原及ph双重响应性的纳米胶束的制备方法：将所述两亲性聚氨酯先溶在有机溶剂中，在室温搅拌条件下滴入二次水，通过自组装形成以聚恶唑啉为亲水壳，聚氨酯为疏水内核的纳米胶束。
上述一种还原及ph双重响应性的纳米胶束作为药物载体的应用。
进一步的，纳米胶束作为药物载体的应用时的降解环境为细胞内的还原环境和/或酸性环境。
进一步的，还原环境为含巯基的分子存在的环境。
进一步的，所述含巯基的分子为谷胱甘肽。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1.本发明的两亲性聚氨酯主链含有还原敏感的二硫键，可以通过对两亲性聚氨酯自组装得到稳定的还原响应性纳米胶束，其具有较小的临界胶束浓度，在细胞外和血液中不易解离，保证了纳米胶束包封的药物稳定，克服了药物在体内易被泄漏、运载效率低、循环时间短等不足的问题；
2.本发明的两亲性聚氨酯的亲水段为聚恶唑啉，其具有ph响应性，可在细胞内内涵体/溶酶体的酸性环境下快速释放。
3.本发明的一种还原及ph双重响应性的纳米胶束进入肿瘤细胞后，在细胞还原性条件和内涵体/溶酶体的酸性环境的双重作用下快速降解，药物被快速释放出来，解决了药物载体的药物释放缓慢，容易产生抗药性的问题，提高了疗效。
具体实施方式：
实施例1：聚己内酯二醇的合成(mn＝1000da)
聚己内酯二醇(pcl)是以己内酯(ε-cl)为起始原料与二硫代乙二醇(hes)在辛酸亚锡(sn(oct)2)的催化下开环聚合得到。
具体操作如下：
氮气保护下，在手套箱中向有搅拌子的密闭反应瓶中依次加入42.1ml甲苯，hes(0.102g,0.6590mmol)，sn(oct.)2(0.081g,0.1997mmol)，ε-cl(7.22g,63.27mmol)，然后将反应器密封好移出手套箱，置于100℃的油浴中持续聚合反应24h。反应结束后，将反应液浓缩后沉淀于冰乙醚中，过滤，真空干燥24h，即得到产物pcl-ss-pcl。产率：85.1％。
实施例2：聚合物petoz-oh的合成(mn＝5000da)
封端亲水段聚合物聚恶唑啉petoz-oh的制备，所述聚恶唑啉为聚合物，其合成是在氮气保护下，对甲苯磺酸甲酯开环聚合2-乙基-2-恶唑啉。具体操作如下：
在干燥的乙腈中加入对甲苯磺酸甲酯(0.34g,1.834mmol)和2-乙基-2-恶唑啉(10g,100.9mmol)，把混合物加热至100℃并搅拌反应24h。反应结束后冷却至室温，加入0.1mlkoh(1n)室温搅拌4h，用冰乙醚沉降分离。将聚合物peoz-oh用去离子水透析(mwco:3500g/mol)纯化两天，期间更换透析介质，最终经冷冻干燥得到产物petoz-oh。产率：87.6％。
实施例3：聚合物petoz-pu(ss)-petoz的合成
该两亲性聚氨酯的制备方法是：首先在65℃下用聚己内酯二醇与二异氰酸酯反应合成聚氨酯预聚体，之后在室温条件下用末端羟基聚恶唑啉封端得到最终产物。
具体操作如下：
在氮气保护下，将1g即1mmol的聚己内酯二醇用甲苯共沸带水后溶于10ml无水dmf，之后加入cdi(1.05mmol，0.214g)，65℃条件下搅拌反应24h后，取聚恶唑啉(0.1mmol，0.5g)溶于5ml无水dmf中，冰水浴条件下滴入上述溶液中，于室温下反应48h。反应结束后，浓缩沉降于甲醇/冰乙醚中，真空干燥得到petoz-pu(ss)-petoz；所述的甲醇/冰乙醚为v/v，1:10。产率：54.1％。
实施例4：聚恶唑啉-聚氨酯(ss)-聚恶唑啉(petoz-pu(ss)-petoz)纳米胶束的制备
聚合物petoz-pu(ss)-petoz的纳米胶束通过透析方法制备。具体过程是：将2mg聚合物溶于1ml二甲亚砜，在25℃搅拌条件下，向其中滴加1.5ml去离子水。得到的溶液搅拌1小时后，装入透析袋中(spectra/por,mwco:3500)，用去离子水透析24小时。
实施例5：对照组聚恶唑啉-聚氨酯-聚恶唑啉(petoz-pu-petoz)纳米胶束的制备
聚合物petoz-pu-petoz纳米胶束通过透析方法制备。具体过程是：将2mg聚合物petoz-pu-petoz溶在1ml二甲亚砜中，在25℃搅拌条件下，向其中滴加1.5ml去离子水。得到的溶液搅拌1小时后，装入预先准备好的透析袋中(spectra/por,mwco:3500)，用去离子水透析24小时。
按照实施例4和例5制备两亲性聚氨酯胶束，并测试所形成的纳米胶束的尺寸和分布，结果如表1所示：
表1不同疏水链段的两亲性聚氨酯纳米胶束
实施例6：双重响应性聚恶唑啉-聚氨酯(ss)-聚恶唑啉纳米胶束的还原降解
本实施例中，以dtt溶液(10mm)模拟细胞内gsh存在的情形。具体为，氮气保护下，将称好的dtt加到2.0mlpetoz-pu(ss)-petoz聚合物纳米胶束(0.001毫克/毫升)的玻璃样品池中，使最终dtt的浓度是10mm。以不加入dtt的胶束作为对照。然后两个玻璃样品池用橡胶塞封住，摇匀，置于37℃恒温摇床(200rpm)中，在选定时间、37℃下通过dls来测胶束粒径的变化。dls结果显示，胶束在4h后粒径由110nm增大到280nm，8h后达到761nm。而胶束本身在24h后粒径基本不变，说明此聚氨酯胶束有良好的还原响应性，在10mmdtt存在的还原条件下，二硫键断裂，胶束溶胀，粒径不断增大。
实施例7：包裹模型小分子抗癌药物阿霉素
petoz-pu-petoz和petoz-pu(ss)-petoz胶束对抗癌药物的包封都是通过透析法实现的。以petoz-pu(ss)-petoz为例，取2.4mg的该聚合物溶解在1ml二甲亚砜中，将设计好的载药量所需的阿霉素加入其中，超声0.5h后，在室温搅拌条件下，向二甲亚砜溶液中缓慢滴加1.5ml二次水，滴加完毕后再超声1h。然后将混合溶液移至透析袋(mwco：3500)中，透析24h后取出。
dox在聚合物纳米胶束中的包封率的确定：取一定量的载药纳米胶束，先通过冷冻干燥法除水，然后加入0.5ml二甲亚砜溶解胶束，再超声1小时，取该溶液20μl加入到3ml二甲亚砜中，通过荧光测试，结合阿霉素的标准曲线计算包封率。
包封率＝(纳米胶束中阿霉素的质量/投入的阿霉素的质量)×100％
按照实施例7制备两种聚合物不同的载药量的纳米胶束，并测试所得纳米胶束的尺寸、分布以及包封率等，结果如表2所示：
表2两种聚合物不同载药量的载药胶束
实施例8：载有阿霉素的载药胶束的触发释放
本实施例中，以醋酸钠缓冲溶液模拟细胞内的内涵体/溶酶体酸性环境(ph5.0～5.5)。把载有dox的petoz-pu(ss)-petoz载药胶束分成两份，装入相应的透析袋中，前者被浸入40ml含有10mmdtt的醋酸钠缓冲溶液(20mm,ph5.0)，后者被浸入40ml的pb(20mm)中，置于37℃恒温摇床(200rpm)中。隔一定时间取设定体积的透析袋外的透析液用来测定其荧光强度，并补充相应体积的新鲜液体。持续实验24小时。
结果表明：载有dox的双重响应性的纳米胶束在10mmdtt、37℃下醋酸钠缓冲溶液中，petoz-pu(ss)-petozz载药胶束能够快速地释放出dox，且释放量高达95％。在没有dtt存在的pb(20mm，ph7.4)条件下，petoz-pu(ss)-petoz聚合物载药胶束24h内仅仅释放出25％的dox。实验结果表明，含有二硫键的petoz-pu(ss)-petoz载药胶束，对细胞内环境有响应性，可以在体内环境中更快地释放药物，提高疗效。