以杆状病毒为载体的抗神经坏死病毒浸泡疫苗及其制备方法与流程

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种以杆状病毒为载体的抗神经坏死病毒浸泡疫苗及其制备方法。

背景技术

神经坏死病毒(nervousnecrosisvirus，nnv)主要侵染仔鱼、稚鱼和部分幼鱼，一旦爆发致死率接近100％。然而仔稚鱼由于体型小、摄食不均匀等特点，决定该阶段防治nnv所用疫苗不能运用注射和投喂的方式，因此急需一种能通过浸泡方式进行免疫的疫苗。

技术实现要素：

本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种能够有效对仔稚鱼进行防治神经坏死病毒的浸泡疫苗。

本发明的另一个目的是提供所述浸泡疫苗的制备方法。

为了实现以上目的，本发明提供了一种以杆状病毒为载体的抗神经坏死病毒浸泡疫苗，其中所述抗神经坏死病毒浸泡疫苗包括由神经坏死病毒衣壳蛋白(capsidprotein，cp)的外凸结构域(protrusiondomain，pdomain)展示在杆状病毒的外膜上而成的重组杆状病毒。

优选地，所述抗神经坏死病毒浸泡疫苗还包括添加剂，例如但不限于疫苗佐剂、防腐剂、稳定剂、用于调节疫苗ph和/或等渗性的物质、或其组合。

优选地，所述杆状病毒为苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(autographacalifornicamultiplenuclearpolyhedrosisvirus，acmnpv)。

优选地，所述抗神经坏死病毒浸泡疫苗适用于多种可感染神经坏死病毒的动物，特别是鱼类，更特别是海水鱼类，包括但不限于石斑鱼或卵形鲳鲹。

本发明还提供了所述抗神经坏死病毒浸泡疫苗的制备方法，其包括以下步骤：

(1)以神经坏死病毒基因组为模板，以rt-pcr方式扩增获得神经坏死病毒衣壳蛋白的外凸结构域pdomain基因编码序列，并带上ecori和hindiii酶切位点，克隆至质粒pfastbachta；

(2)扩增流感病毒神经氨酸酶的n端前40个氨基酸残基na40的基因编码序列和linker(ggggs)3的编码序列，通过ncoi和ecori酶切位点插入所述质粒pfactbachta，制得含有启动子pph、na40基因编码序列、linker(ggggs)3编码序列和pdomain基因编码序列的重组杆状病毒。

优选地，所述抗神经坏死病毒浸泡疫苗的制备方法还包括培养并生产重组杆状病毒。更优选地，用重组杆状病毒感染sf9细胞进行生产。

优选地，扩增神经坏死病毒衣壳蛋白的外凸结构域pdomain基因编码序列的引物如下：

f1：ggaattcacacctgaagagaccaccgctc；

r2：cccaagcttttagttttccgagtcaaccctg。

优选地，扩增流感病毒神经氨酸酶的n端前40个氨基酸残基na40的基因编码序列的引物如下：

f3：catgccatggatatgaatccaaatcaaaaaataataaccattg；

r4：ggaattcgctgccgccaccgccgcttcc。

本发明还提供了一种使鱼类对神经坏死病毒免疫的方法，其中用上述抗神经坏死病毒浸泡疫苗浸泡免疫仔稚鱼至少两次，进行浸泡免疫。优选地，浸泡免疫仔稚鱼的抗神经坏死病毒浸泡疫苗的终浓度为10⁴tcid50/ml。更具体地，以终浓度为10⁴tcid50/ml的上述抗神经坏死病毒浸泡疫苗浸泡免疫仔稚鱼2h，正常饲养48h后，以同样条件(终浓度为10⁴tcid50/ml)浸泡免疫第二次，即可有效预防正常情况下的神经坏死病毒感染(天然感染的神经坏死病毒一般在10³以下)。

优选地，所述鱼类可以是多种可感染神经坏死病毒的鱼，特别是海水鱼类，包括但不限于石斑鱼或卵形鲳鲹。

作为一种优选的实施方式，若养殖条件不佳，可在二次免疫后的48h后再以相同条件浸泡，加强免疫一次。

经rt-pcr检测基因表达情况，第一次免疫后鱼体的先天性免疫系统被激活(相关基因表达上调)，并且在第二次免疫后免疫系统更加活跃并足以抵抗天然条件下的神经坏死病毒感染。对两次免疫后仔稚鱼进行神经坏死病毒注射攻毒(10⁴tcid50/ml)，发现其免疫保护率高达85.4％。

此外，经过细胞感染(哺乳类和鱼类细胞)和鱼体安全性检测(长时间浸泡和腹腔注射)，证明本发明的抗神经坏死病毒浸泡疫苗不会对脊椎动物及细胞产生毒害作用影响。因此本发明的抗神经坏死病毒浸泡疫苗是一种新型、制备简单、使用方便、效果良好、安全性高的抗神经坏死病毒浸泡疫苗。

本发明将nnv的衣壳蛋白的外凸结构域展示在杆状病毒/苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒)的外膜上，已知杆状病毒对脊椎动物无害但能有效刺激免疫系统的，因此以其为载体，将nnv的优良免疫原展示在其外膜，将能有效的刺激鱼类的先天性免疫系统，达到防治nnv的目的。

经过跨膜区和启动子的筛选及优化，使用了流感病毒神经氨酸酶的跨膜区，能有效的将pdomain朝外，n端朝内地展示在外膜上；使用acmnpv的多角体启动子(polyhedrapromoter，pph)能高效表达pdomain，使重组病毒含pdomain量最高，且该启动子为杆状病毒原始的启动子，受调控情况也最清晰。该重组杆状病毒通过感染sf9细胞能生产达到10⁹tcid50/ml的病毒量，并且病毒经过简单纯化后无需灭活即可直接使用。

附图说明

图1是根据本发明的重组杆状病毒的绿色荧光蛋白表达结果。

图2是根据本发明的重组杆状病毒的westernblot检测结果。

图3是神经坏死病毒攻毒免疫后仔稚鱼的死亡曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步的详述，但本发明并不限于以下实施例。

如未特别指出，本发明所使用的试剂均为现有试剂，可通过商业渠道获得，实施例中涉及但未详细描述细节参数的操作亦是本领域技术人员所熟知的。

实施例1抗神经坏死病毒浸泡疫苗的制备

1、衣壳蛋白(capsidprotein，cp)的pdomain克隆

以神经坏死病毒(nnv)基因组为模板，以rt-pcr扩增获得cp基因(seqidno.1)的640-1017bp(seqno.2)(对应氨基酸为214-338aa)并带上ecori和hindiii酶切位点(f1：ggaattcacacctgaagagaccaccgctc(seqidno.5)；r2：cccaagcttttagttttccgagtcaaccctg(seqidno.6))，按说明书克隆至质粒pfastbachta。

2、跨膜区筛选

由于cp是c端展示在颗粒外面，n端在颗粒里面，因此，要想把衣壳蛋白的pdomain展示于细胞膜外就需要在其n端插入ii型跨膜蛋白的跨膜信号。

流感病毒神经氨酸酶(neuraminidase，na)属于ii跨膜蛋白(一次跨膜，n端在细胞膜内侧，c端在外侧)，tmhmm2.0预测influenzaavirus(a/sofia/418/2006(h1n1))(genbank:cy103786.1)的na跨膜区在7-29号氨基酸残基。

将na的n端前40个氨基酸残基(na40)的基因编码序列(seqidno.3)和linker(ggggs)3的编码序列(seqidno.4)用以下引物扩增(f3:catgccatggatatgaatccaaatcaaaaaataataaccattg(seqidno.7)；r4:ggaattcgctgccgccaccgccgcttcc(seqidno.8))，通过ncoi和ecori酶切位点插入质粒pfactbachta。

3、启动子筛选

选择白斑综合症病毒(wssv)的多个启动子(069/108/249，相应基因的对应启动子，这些启动子均已确认具有高表达量)及多角体启动子(pph，原质粒自带)进行表达筛选。wssv启动子用以下引物扩增，通过snabi和rsrii酶切位点连接到pfastbachta载体，置换载体上的pph启动子。然后把gfp序列通过ecori和hindiii位点连接到改造后的载体上。将质粒转染sf9细胞，通过观察gfp的表达情况评估各启动子在sf9细胞启动基因转录的能力。

f-069：5‘ggtacgtatgaaaatggctgtt3’(seqidno.9)

r-069：5‘ggcggtccgcttgagtggagagag3’(seqidno.10)，产物＝984bp

f-249：5‘ggtacgtactcgcccaccacc3’(seqidno.11)

r-249：5‘ggcggtccgggctgcgagaatggtttg3’(seqidno.12)，产物＝968bp

f-108：5‘ggtacgtagaaaatatcctcg3’(seqidno.13)

r-108：5‘ggcggtccgcttgatttcttggttg3’(seqidno.14)，产物＝927bp

根据荧光量，选定了249和pph启动子进行下一步，在选定启动子、na及pdomain均完成重组情况下，制备重组病毒bac-249-na-p和bac-ph-na-p，发现bac-249-na-p重组病毒并不能很好表达pdomain，而bac-ph-na-p则可以很好地把pdomain展示在细胞膜上(见图1)，因此将后者命名为bac-noda。如图1所示，bac-noda感染sf9细胞后pdomain定位在细胞膜。用p1重组病毒bac-noda感染新鲜sf9细胞，48h后用鼠抗nnv多抗及绿色荧光二抗进行免疫荧光检测，左上a为pdomain信号，明场(右上b)为可见光下细胞形态，左下c为细胞核染色(hoechst33258)，右下d为前三图叠加效果。可见细胞膜上有绿色荧光信号，证明pdomain能被表达到细胞膜上。

4、制备重组病毒bac-noda

将含有启动子pph、na40、linker(ggggs)3和pdomain的重组pfactbachta转化dh10b感受态细胞：将1μg重组质粒加入100μldh10bac感受态细胞，热激后加入900μllb培养基，37℃培养4小时，4,000g离心4分钟，吸掉900μl培养基上清，菌体用100μl培养基冲悬，涂布于含有50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、10μg/ml四环素、100μg/mlbluo-gal和40μg/mliptg的lb固体平板上，37℃培养48小时后，挑取白色菌斑，进行pcr分析和测序确定阳性克隆。

利用omega公司的试剂盒提取杆粒，但步骤略有修改：(1)按1：1000接种菌种于新鲜培养基(含有50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、10μg/ml四环素的lb培养基)，过夜培养16小时左右，离心收取菌体，加入200μlbuffert1/rnasea溶液重悬菌体。(2)加入200μlt2buffer，上下倒置5-10次，充分裂解菌体，室温静置5分钟。(3)加入200μl冰冷的t3buffer，上下倒置15-20次，冰上放置5分钟。(4)13,000g，4℃离心10分钟，转移上清到1.5ml离心管，加入0.1倍体积etr溶液(为omega公司的内毒素吸附缓冲液，见omega公司无内毒素试剂盒e.z.n.a.endo-freeplasmidminikiti和e.z.n.a.endo-freeplasmidminikiti说明书)，冰上孵育10分钟，42℃5分钟，13,000g，离心3分钟。(5)转移上清到2.0ml离心管，加入800μl冰冷异丙醇，冰上孵育10分钟，13,000g，4℃离心15分钟。白色沉淀用75％乙醇溶液漂洗两次，吸干残留液体，室温干燥10分钟，40μl无菌水溶解沉淀，4℃保存。

重组杆状病毒bac-noda的生产：(1)6孔板接种sf9细胞，密度约为70％作用。(2)第二天早上，用fugene转染试剂转染3μg杆粒。(3)转染72小时后收取上清，即为第一代病毒p1。

5、bac-noda验证

利用免疫荧光技术检测被感染细胞的细胞膜是否具有pdomain：(1)将p1重组病毒bac-noda(约10⁴tcid50/ml)感染新鲜培养的sf9细胞。(2)48h后去上清，以多聚甲醛固定细胞10min。(3)常规抗原封闭、一抗孵育(鼠抗nnv多克隆抗体)和绿色荧光二抗(donkeyanti-mouseigg(h+l)secondaryantibody,alexafluor488)抚育后，以hoechst33258对比染色细胞核，荧光显微镜观察，确定在细胞膜上有荧光信号(见图1)。

6、bac-noda大量生产并纯化

大量生产重组病毒bac-noda：将p1重组病毒bac-noda(约10²tcid50/ml)感染1×10¹⁰新鲜培养的sf9细胞。72h后收集上清，即为p2。若需更大量重组病毒，可以以p2感染新鲜sf9细胞培养p3病毒。

密度梯度离心纯化重组病毒：(1)1000g，4℃离心10min，取上清，重复一次，去掉细胞。(2)上清以40％浓度的蔗糖垫离心，100,000g，60min，沉淀用pbs(磷酸缓冲盐溶液)重悬。(3)将重悬液铺在25％-56％蔗糖密度梯度上离心，100,000g，90min，吸取宽的蓝白色条带。(4)病毒液加到pbs中稀释，100,000g，离心60min，沉淀用适量pbs重悬。-80度保存。(5)以常规梯度稀释法测定所纯化的重组病毒的滴度，要求10⁸tcid50/ml以上。(6)将纯化的病毒粒子进行westernblot检测(用商业化抗his单抗及鼠抗nnv多抗)，能检测到相应条带，证明粒子带上所设计的his-na-p蛋白序列(见图2)。

如图2所示，纯化的bac-noda具有his标签及pdomain。将纯化后的bac-noda进行westernblot，经抗his单抗及鼠抗nnv多抗检测，证明bac-noda带有杆状病毒自带的his标签及重组克隆的pdomain。his标签为重组蛋白的n端，pdomain为重组蛋白的c端，均能被检测到，而且含量高(相比vh，vh是带his标签的ognnvvlp，因此既有his也有cp，可以作为正对照。)。

实施例2浸泡免疫

1、浸泡免疫流程优化

分别稀释重组病毒bac-noda至终浓度为10³、10⁴、10⁵tcid50/ml，浸泡石斑鱼(体长3cm以下)或卵形鲳鲹(体长5cm以下)仔稚鱼1-2h，48h后同样条件浸泡第二次。用同样方式免疫另外3组仔稚鱼，再进行第三次浸泡免疫。将不同浓度免疫次数不同的6组仔稚鱼进行ognnvhn(斜带石斑鱼神经坏死病毒海南株)攻毒，得到两次免疫与三次免疫死亡率相近，虽然10⁵组存活率比10⁴组低，但差异不明显，因此总结得出经济有效的免疫流程为以10⁴tcid50/ml的bac-noda浸泡免疫两次，每次2h。此条件下，免疫保护率为85.4％(见图3)。

如图3所示，以10⁴tcid50/ml的bac-noda浸泡免疫石斑鱼仔稚鱼两次后，以10⁴tcid50/ml的ognnvhn注射攻毒，连续观察11天。每天收集死鱼并计算累积死亡率。比对负对照(bac-wt，即无插入序列的野生型杆状病毒)的死亡率，得到免疫保护率为85.4％。

2、免疫效果检测

以rt-qpcr的方式对上述两次免疫后石斑鱼仔稚鱼的8个器官进行15个基因的检测，定量结果说明先天性免疫相关基因表达上调多，而且是浸泡后短期的效果，综合推测为刺激先天性免疫和细胞免疫为主。

3、安全性检测

细胞入侵性能：将bac-noda以10⁴tcid50/ml的浓度浸泡鱼类细胞(sb、ssn-1、fhm、zf4和co)及哺乳类细胞(hela、293t和bhk)，发现其可部分进入细胞或附着于细胞表面。而且48h浸泡过程中，细胞生长并无异常。另外对浸泡48h后的细胞进行pcr或rt-pcr检测杆状病毒衣壳蛋白及pdomain的基因序列，对比1h样品发现这两个基因数量并无增加或增加只有1-2倍，未形成有效侵染复制。说明bac-noda对鱼类及哺乳类细胞安全性高。

高浓度时对鱼体的表现：用10⁷tcid50/ml的bac-noda浸泡石斑鱼仔稚鱼10天，死亡率为5％。用10⁷tcid50/ml的bac-noda腹腔注射石斑鱼仔稚鱼，观察-10天，死亡率为7％。可见高浓度bac-noda对仔稚鱼毒性很低。

序列表

<110>中山大学

<120>以杆状病毒为载体的抗神经坏死病毒浸泡疫苗及其制备方法

<160>14

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>549

<212>dna

<213>神经坏死病毒(nervousnecrosisvirus)

<400>1

atgaatccaaatcaaaaaataataaccattggatcaatcagtatagcaatcggaataatt60

agtctaatgttgcaaataggaaatattatttcaatatgggctagtcactcaatccaaact120

ggtggcggtggaagcggcggtggcggaagcggcggtggcggcagcgaattcacacctgaa180

gagaccaccgctcccatcatgacacaaggttccctgtacaacgattccctttccacaaat240

gacttcaagtccatcctcctaggatccacaccactggatattgcccctgatggagcagtc300

ttccagctggaccgtccgctgtccattgactacagccttggaactggagatgttgaccgt360

gctgtttattggcacctcaagaagtttgctggaaatgctggcacacctgcaggctggttt420

cgctggggcatctgggacaacttcaacaagacgttcacagatggcgttgcctactactct480

gatgagcagccccgtcaaatcctgctgcctgttggcactgtctgcaccagggttgactcg540

gaaaactaa549

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<213>神经坏死病毒(nervousnecrosisvirus)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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