本发明涉及水产养殖病害防治领域，具体涉及一种沙塘鱧嗜水气单胞菌病疫苗及其制备方法。
背景技术
沙塘鳢属(odontobutis)又称沙乌鳢、蒲鱼、土布鱼、沙鳢、虎头鱼等，隶属于鲈形目(perciformes)鰕虎鱼亚目(gobioidei)塘鳢科(eleotridae)，主要分布于长江中下游、钱塘江、闽江等水系；该鱼因味道鲜美、营养丰富、肉质细腻又少刺而广受人们喜爱。
近年来，随着市场需求的不断增长，沙塘鱧的人工养殖规模不断扩大，并且已经在多个省市的养殖区开展了混养和套养；然而养殖规模的增大远不及市场需求的增长，在生产该鱼苗种过程中，生产单位不注重该鱼种质资源管理，导致养殖成鱼发生生长速度变慢、病害增加等种质退化现象。沙塘鱧种质的退化以及养殖水质的恶化导致了沙塘鱧抗病力的下降，尤其是细菌性疾病的大量爆发，2016年4～6月在江苏南京和扬中沙塘鱧养殖基地持续爆发嗜水气单胞菌感染，造成沙塘鱧烂鳃症，死亡率高达80％，给养殖户造成了极大的经济损失。
沙塘鱧为典型的肉食性鱼类，主要摄食虾和小型底层鱼类，兼食水生昆虫的幼虫和螺等底栖动物，偶尔也残食同类，因而抗生素无法进行投喂，如在水体中大量使用杀菌剂，也会造成环境污染及生态平衡失调等不良后果，影响水产养殖业的发展，因此，只有疫苗免疫途径进行预防，才能够减少养殖户经济损失，而这种疫苗目前仍为空白。
技术实现要素：
本发明的目的是提供了一种沙塘鱧嗜水气单胞菌病疫苗。
本发明的另一目的是提供该沙塘鱧嗜水气单胞菌病疫苗的制备方法。
本发明的技术方案如下：
一种沙塘鱧嗜水气单胞菌病疫苗，包含嗜水气单胞菌液经灭活、离心后的上清液、青霉素、链霉素以及10％甘油；其中各组分用量为每毫升所述的上清液中加入青霉素800单位，链霉素800单位及10％甘油0.1ml。
其中，所述的嗜水气单胞菌液优选通过以下方法制备得到：从明显患有嗜水气单胞菌病症状的沙塘鱧肝脏、肠道中分离出病原菌嗜水气单胞菌并进行纯培养，接种于lb液体培养基进行扩大培养；将扩大培养后的病原菌原液倒入水族箱中，对水族箱中饲养的沙塘鱧进行回感；。取回感发病沙塘鱧肝脏及肠道，加入生理盐水，匀浆，制成10％浓度的组织悬液得病料悬液；将病料悬液接种于琼脂培养基，纯培养后挑取单个菌落接种于lb液体培养基于恒温震荡培养箱中扩大培养，培养温度为28℃，转速为180r/min，振荡培养48h，制成嗜水气单胞菌液，调整浓度为5x108cfu/ml。
所述的沙塘鱧嗜水气单胞菌病疫苗还包含弗氏佐剂。
本发明所述的沙塘鱧嗜水气单胞菌病疫苗的制备方法，包含以下步骤：
(1)病原菌提取：从明显患有嗜水气单胞菌病症状的沙塘鱧肝脏、肠道中分离出病原菌嗜水气单胞菌并进行纯培养，接种于lb液体培养基进行扩大培养；
(2)回感：将扩大培养后的病原菌原液倒入水族箱中，用灭菌枪头将沙塘鱧体表皮肤划伤后，放入水族箱中，保证划伤部位接触到病原菌，观察沙塘鱧发病状况，如沙塘鱧表现出嗜水气单胞菌感染的症状，说明病原菌具有毒力性；
(3)制备病料悬液：取(2)中发病沙塘鱧肝脏及肠道，称重，每10克组织中加入生理盐水100毫升，用匀浆器进行匀浆，制成10％浓度的组织悬液得病料悬液；
(4)菌液制备：将步骤(3)病料悬液用接种环接种于琼脂培养基，进行培养，24h后挑取单个菌落进行纯培养，然后挑取单个菌落接种于lb液体培养基于恒温震荡培养箱中扩大培养，培养温度为28℃，转速为180r/min，振荡培养48h，制成嗜水气单胞菌液，调整浓度为5x108cfu/ml；
(5)灭活：将扩大培养后的嗜水气单胞菌菌液，每100ml加入0.8％福尔马林溶液1ml，充分摇匀，放入60℃恒温培养箱中灭活，每小时振荡一次，每次10min，共灭活4h,将灭活后的悬液置于高速离心机中，转速为5000r/min，离心30min，分离出灭活上清液；
(6)合成：向灭活上清液中添加青霉素和链霉素，剂量为每毫升上清液中加入青霉素800单位，链霉素800单位，并摇匀，摇匀后加入10％甘油0.1ml。
所述的沙塘鱧嗜水气单胞菌病疫苗的制备方法优选还包括对步骤(6)制备的疫苗进行无菌性检验、安全性检验、免疫保护率检验、疫苗有效期检验的步骤。
本发明疫苗的使用方法为注射免疫，分为背部肌肉注射和腹腔注射，背部肌肉注射要求与弗氏佐剂按照1:1配比进行注射，腹腔注射为直接注射。
有益效果：
本发明制备的沙塘鱧嗜水气单胞菌疫苗，具有成本低廉，使用方法简单，效果较好，能够有效提高沙塘鱧免疫力，对沙塘鱧保护率达到85％以上，且无任何副作用，不污染环境，减少因嗜水气单胞菌感染造成的经济损失，提高养殖户养殖收入。
疫苗配方中加入10％甘油保护剂，有助于疫苗稳定保存。
背部肌肉注射时，采用与弗氏佐剂1:1配比注射，更好地发挥疫苗的免疫作用。
具体实施方式
实施例1
(1)病原菌提取：从明显患有嗜水气单胞菌病症状的沙塘鱧肝脏、肠道中分离出病原菌嗜水气单胞菌并进行纯培养3次，接种于lb液体培养基进行扩大培养，并计数；
(2)回感：将扩大培养后的病原菌原液倒入水族箱中，用灭菌枪头将沙塘鱧体表皮肤划伤后，放入水族箱中，保证划伤部位接触到病原菌，观察沙塘鱧发病状况，如沙塘鱧表现出嗜水气单胞菌感染的症状，说明病原菌具有毒力性。
(3)制备病料悬液：取(2)中发病沙塘鱧肝脏及肠道，称重，每10克组织中加入生理盐水100毫升，用匀浆器进行匀浆，制成10％浓度的组织悬液，将组织悬液置于-20℃低温冰箱中保存。
(4)菌液制备：将步骤(3)病料悬液用接种环接种于琼脂培养基，进行培养，24h后挑取单个菌落进行纯培养，共纯培养3次，后挑取单个菌落接种于lb液体培养基于恒温震荡培养箱中扩大培养，培养温度为28℃，转速为180r/min，振荡培养48h，制成嗜水气单胞菌液，调整浓度为5x108cfu/ml。
(5)灭活：将扩大培养后的嗜水气单胞菌菌液，每100ml加入0.8％福尔马林溶液1ml，充分摇匀，放入60℃恒温培养箱中灭活，每小时振荡一次，每次10min，共灭活4h,将灭活后的悬液置于高速离心机中，转速为5000r/min，离心30min，分离出灭活上清液；
(6)合成：向灭活上清液中添加一定量的青霉素和链霉素，剂量为每毫升上清液中加入青霉素800单位，链霉素800单位，并摇匀，摇匀后加入10％甘油0.1ml；
(7)无菌性检验：对步骤(6)中合成的疫苗，用接种环划线接种于普通培养基，28℃培养48h，观察是否有菌落形成，如培养基上无任何菌落生长，说明疫苗无菌性检验合格。
(8)安全性检验：取健康且体表无伤痕沙塘鱧亲本140尾，分为7组，每组20尾，1-3组分别采用腹腔注射疫苗0.2ml，0.3ml，0.4ml；4-6组分别采用背部肌肉注射疫苗0.2ml，0.3ml，0.4ml；第7组为对照组，连续培养15天，观察沙塘鱧状况及死亡情况，如无感染及死亡现象，说明疫苗安全性合格，如表1所示。
表1疫苗安全性检验
(9)免疫保护率检验：取健康且体表无伤痕沙塘鱧亲本150尾，分为a、b、c组，每组50尾，a组每尾腹腔注射疫苗0.3ml，b组每尾背部肌肉注射疫苗0.3ml，c组为对照组，不注射，观察7d后，发现三组均无发病及死亡现象，进行攻读试验，取发病鱼病料悬液用生理盐水进行十倍比稀释后进行腹腔注射，注射量为每尾0.5ml，进行正常饲养，观察14d后，结果a组死亡7条，存活43条，死亡率为14％，免疫保护率为86％；b组死亡6条，存活44条，死亡率为12％，免疫保护率为88％；c组为对照组，全部发病且死亡，死亡率100％，如表2所示。
表2沙塘鱧接种嗜水气单胞菌疫苗免疫保护率实验
(10)疫苗有效期检验：将疫苗保存于4℃冰箱中，每月按照(9)所述方法，进行实验，如疫苗保护率达到85％以上视为仍在有效期内，结果显示疫苗可于4℃冰箱中可保存16个月。
实施例2
某沙塘鱧养殖厂，共有沙塘鱧养殖水槽6个，2016年春夏季养殖水槽曾爆发过嗜水气单胞菌病，2016年9月，放苗前对苗种进行疫苗注射，其中4个养殖水槽分别采用背部肌肉注射及腹腔注射疫苗的方式，且背部肌肉注射时采用与弗氏佐剂1:1配合注射，每尾注射疫苗0.3ml，其余2个养殖水槽不注射，所有水槽均进行正常沙塘鱧养殖，且在养殖过程中，发现2017年5-6月份注射过疫苗的养殖水槽，沙塘鱧采食正常，精神活跃；但未注射过疫苗的养殖水槽，出现嗜水气单胞菌感染的典型症状，且发病后迅速死亡，2018年3月起捕，进行计数统计，发现注射过疫苗的养殖水槽，成活率为82％-88％，；未注射疫苗的养殖水槽，成活率为22％及29％，如表3所示。
表3大面积沙塘鱧免疫后养殖
结论：使用沙塘鱧嗜水气单胞菌疫苗，方法简单，安全无副作用，对养殖沙塘鱧具有免疫保护作用，能显著提高沙塘鱧养殖成活率，对嗜水气单胞菌病的发生具有良好的预防效果。