裂果薯皂苷在制备治疗肝纤维化药物中的药效学应用的制作方法

本发明属于制药领域，本发明涉及中药裂果薯皂苷提取物的用途,具体地说是以裂果薯总皂苷提取物、甾体皂苷类化合物为原料在制备抗肝纤维药物中的应用。

背景技术：

肝纤维化(hepaticfibrosis)是继发于各种形式慢性肝损伤之后组织修复过程中的代偿反应，也是所有慢性肝病发展为肝硬化的必经的病理过程，肝纤维化病因诸多,包括病毒性、自身免疫性、药物或毒物、胆汁淤积以及代谢性疾病等，其终末阶段将发展为肝硬化、门脉高压、肝衰竭及肝细胞癌。因此阻断肝纤维化的发生和发展,对防治肝硬化和肝癌具有重要意义。

肝纤维化的实质是肝内细胞外基质(exlxacellularmatrix，ecm)合成大于降解导致ecm过度沉积，致使肝脏的正常结构和功能受到破坏。现已明确.肝星型细胞(hepaticstellatecell.hsc)的活化是肝纤维化发生过程中非常核心的部分，活化的肝星状细胞是纤维化肝脏ecm成分的主要细胞来源，活化了的hsc形成了ecm，从而导致肝纤维化。在肝脏受到损伤时，hsc增殖活化并转变为肌成纤维细胞样细胞。肝纤维化的形成机制目前尚不清楚,研究表明hsc的增殖活化是肝纤维化形成的关键,抑制hsc的增殖活化成为防治肝纤维化的重点。探讨抑制hsc增殖活化和诱导其凋亡机制及寻求有效的抗肝纤维化的药物至关重要，hsc的活化被认为是肝纤维化的中心环节，故能直接抑制hsc异常增殖活化的药物对降低肝纤维化、提高生存质量,降低肝病死亡率都具有十分重要的意义。

许多研究已证实肝纤维化是可逆性病变,若及时彻底治疗干预致病因素,肝损伤停止发展,则肝纤维化多可逆转。近年来国内外学者针对肝纤维化提出一系列治疗药物和方法，但是因种种原因尚未找到十分理想的药物,众多学者仍在进行有益的探索。近年,国内外大量研究表明天然药物和中药在治疗肝纤维化方面显示出了可靠疗效和较少不良反应的特点，因此利用现代科研技术方法从天然药物和中药中开发抗肝纤维化的新药具有重要意义。

裂果薯属百合目，蒟蒻薯科植物的根状茎，拉丁名为schizocapsaplantagineahance，裂果薯味苦，性寒，具有消肿止痛，收敛止血，清热解毒等功效。至今,对裂果薯公开报道的研究主要集中在其化学成分的分离、鉴定方面,其药效学研究很少,利用裂果薯皂苷抗肝纤维化的研究则未见报道。

技术实现要素：

本发明目的：是提供中药裂果薯总皂苷提取物、甾体皂苷类化合物在制备抗肝纤维化药物中的应用，所述疾病为肝纤维化。

技术方案：

裂果薯皂苷在制备治疗肝纤维化药物中的应用。

本发明是基于发明人的实验研究而完成的。研究分两大部分：

一、裂果薯皂苷的制备

本发明一方面涉及一种裂果薯甾体皂苷化合物，所述的裂果薯甾体皂苷化合物选自：

①裂果薯总皂苷

②裂果薯皂苷ⅰ(taccaosideⅰ)

(25s)-spirost-5-en-3β-yl-o-α-l-rhamnopyranosyl-(1→2)-o-[o-β-d-glucopyranosyl-(1→4)-α-l-rhamnopyranosyl-(1→3)]-β-d-glucopyranoside、

③裂果薯皂苷ⅱ(taccaosideⅱ)

(yamogenin3-0-[α-l-rhamnopyranosyl-(1→3)]-[α-l-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-d-glucopyranoside)

所述的裂果薯皂苷化合物为裂果薯总皂苷、裂果薯皂苷ⅰ(taccaosideⅰ)和裂果薯皂苷ⅱ(taccaosideⅱ)。在本发明的另一方面，本发明还涉及含有上述裂果薯皂苷化合物的药物组合物。

本发明另一方面涉及上述裂果薯皂苷化合物或药物组合物在制备治疗肝纤维化疾病的药物中的应用。

在本发明中，如果无特殊说明，在化学名与结构式发生冲突时，以结构式为准，申请人保留基于结构式修改化学名的权利。

二、裂果薯皂苷抗肝纤维化药效学实验

1、对肝星状细胞的影响

用hsc-t6细胞作为体外模型,研究裂果薯皂苷对hsc-t6的影响,观察裂果薯皂苷对肝星状细胞的影响。结果表明,裂果薯皂苷可显著抑制细胞增殖，且随着药物浓度的增加,其抑制作用逐渐增强,呈现量效反应关系。提示裂果薯皂苷在体外对hsc-t6细胞有显著的抗增殖作用。

2、对大鼠肝纤维化的保护作用

将雄性大鼠ccl4油溶液诱导形成肝纤维化动物模型,观察裂果薯皂苷抗肝纤维化的作用。

对肝纤维化大鼠血清学指标的影响：裂果薯皂苷各剂量组均可显著降低肝纤维化大鼠血清ha、ln、col-ⅳ、pcⅲ含量及肝组织hyp水平、,且随着药物浓度的增加,其作用逐渐增强,呈现量效反应关系。

对肝纤维化大鼠肝组织形态学的影响：he和masson染色病理结果显示,正常对照组大鼠肝脏结构完整，肝细胞未见变性或坏死。模型对照组大鼠肝脏正常肝小叶结构被破坏,由大小不等的圆形或椭圆形肝细胞结节所构成的假小叶取代,结节周围纤维组织增生。裂果薯皂苷中剂量组大鼠肝脏肝小叶结构完整,汇管区有少量纤维组织增生，低剂量组肝细胞排列紊乱,肝小叶结构有破坏,尚完整,结节周围纤维组织增生。

电镜结果显示,正常对照组大鼠肝细胞形态清晰,模型对照组大鼠肝细胞周边胶原纤维增生明显,裂果薯皂苷作用后的大鼠肝纤维化组织可见较多正常线粒体,形态良好的肝细胞,少量星状细胞凋亡小体。

总之,本发明首次对裂果薯总皂苷、甾体皂苷类化合物进行了抗肝纤维化的研究,体外和体内实验表明,裂果薯皂苷具有较强的抑制肝星状细胞增殖的作用、具有优良的抗肝纤维化效果,既可在细胞水平抑制肝星状细胞的增殖,又能明显减少胶原的合成,使肝纤维化明显减轻,对防治肝纤维化具有独特优势，具有广泛的用途，是治疗化学性肝纤维化的一种非常有潜在价值的新药。裂果薯皂苷用于治疗肝纤维化具有非常好的研发前景。

附图说明

图1sfsp对hsc-t6细胞的增殖的抑制作用，

图2不同浓度裂果薯总皂苷对肝星状细胞hsc-t6增殖的影响(200×)，

图3肝组织病理学变化(×100)①he染色结果，

图4肝组织病理学变化(×100)②masson染色结果，

图5肝组织细胞超微结构变化透射电镜结果。

具体实施方式

一、裂果薯皂苷制备

裂果薯块茎粉末以80％乙醇常压回流提取，醇提物含量为85.31％，依次用石油醚(60～90℃)、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取醇提物，正丁醇萃取部位经d101大孔吸附树脂富集皂苷，50％-95％的乙醇梯度洗脱得到裂果薯总皂苷(sfsp)；60％乙醇组分用硅胶柱，经氯仿-甲醇-水(8：1:0.05，6:1:0.05，4:1:0.05)梯度洗脱，收集合并洗脱液，多次纯化，再经氯仿-甲醇(1:1)sephadexlh-20柱洗脱，多次纯化后得到裂果薯甾体皂苷化合物sphsⅰ和sphsⅱ。

结果：除裂果薯总皂苷(sfsp)外，共分离得到2个裂果薯皂苷化合物单体，结构鉴定分别为：

①裂果薯皂苷ⅰ(taccaosideⅰ)(25s)-spirost-5-en-3β-yl-o-α

-l-rhamnopyranosyl-(1→2)-o-[o-β-d-glucopyranosyl-(1→4)-α

-l-rhamnopyranosyl-(1→3)]-β-d-glucopyranoside、

②裂果薯皂苷ⅱ(taccaosideⅱ)(yamogenin3-0-[α-l-rhamnopyranosyl-(1→3)]-[α-l-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-d-glucopyranoside)、

裂果薯皂苷化合物结构解析

1.1裂果薯皂苷ⅰ命名为：(25s)-spirost-5-en-3β-yl-o-α-l-rhamnopyranosyl-(1→2)-o-[o-β-d-glucopyranosyl-(1→4)-α-l-rhamnopyranosyl-(1→3)]-β-d-glucopyranoside，分子式为c51h82o21，分子质量：1030，结构式如下：

裂果薯皂苷ⅰ的主要图谱数据：

¹hnmr(400mhz，c5d5n)：δ5.82(1h，s，h-1″)，5.77(1h，s，h-1″′)，5.29(1h，m，h-6)，5.25(1h，d，j＝7.5hz，h-1″″)，4.89(1h，d，j＝7.4hz，h-1′)，1.75(3h，d，j＝6.1hz，me-6″)，1.68(3h，d，j＝5.8hz，me-6″′)，1.13(3h，d，j＝6.8hz，me-21)，1.05(3h，d，j＝6.8hz，me-27)，1.02(3h，s，me-19)，0.80(3h，s，me-18)；¹³cnmr(200mhz，c5d5n)：δ37.5(c-1)，30.1(c-2)，77.8(c-3)，38.6(c-4)，140.8(c-5)，121.8(c-6)，32.3(c-7)，31.7(c-8)，50.3(c-9)，37.1(c-10)，21.1(c-11)，39.8(c-12)，40.4(c-13)，56.6(c-14)，32.2(c-15)，81.2(c-16)，62.7(c-17)，16.3(c-18)，19.4(c-19)，42.5(c-20)，14.9(c-21)，109.7(c-22)，26.4(c-23)，26.2(c-24)，27.5(c-25)，65.1(c-26)，16.3(c-27)，99.9(c-1′)，78.6(c-2′)，86.2(c-3′)，69.7(c-4′)，78.1(c-5′)，62.2(c-6′)，102.7(c-1″)，72.5(c-2″)，72.8(c-3″)，73.8(c-4″)，69.9(c-5″)，18.7(c-6″)，103.2(c-1″′)，72.1(c-2″′)，72.4(c-3″′)，84.6(c-4″′)，68.7(c-5″′)，18.3(c-6″′)，106.6(c-1″″)，76.5(c-2″″)，78.7(c-3″″)，71.4(c-4″″)，78.5(c-5″″)，62.6(c-6″″).

1.2裂果薯皂苷ⅱ命名为：yamogenin3-0-[α-l-rhamnopyranosyl-(1→3)]-[α-l-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-d-glucopyranoside，分子式为c45h72o16，分子质量：868，结构式如下：

裂果薯皂苷ⅱ的主要图谱数据：

¹hnmr(400mhz，c5d5n)：δ0.80(1h，s，19-ch)，1.02(1h，s，18-ch3)，1.05(1h，d，j＝6.8hz，21-ch3)，1.13(1h，d，j＝6.8hz，27-ch3)，5.07(1h，br，rha1-ch)；¹³cnmr(500mhz，c5d5n)：δ38.5(c-1)，28.5(c-2)，79.0(c-3)，39.3(c-4)，141.9(c-5)，122.7(c-6)，33.2(c-7)，32.7(c-8)，51.7(c-9)，38.0(c-10)，22.0(c-11)，40.9(c-12)，41.4(c-13)，57.8(c-14)，32.8(c-15)，79.4(c-16)，62.5(c-17)，16.8(c-18)，19.8(c-19)，43.4(c-20)，14.7(c-21)，111.1(c-22)，30.7(c-23)，26.7(c-24)，27.0(c-25)，64.4(c-26)，16.4(c-27)，100.2(c-1′)，77.5(c-2′)，88.3(c-3′)，82.3(c-4′)，73.7(c-5′)，63.5(c-6′)，102.2(c-1″)，72.1(c-2″)，72.3(c-3″)，72.4(c-4″)，70.5(c-5″)，17.8(c-6″)，103.8(c-1″′)，70.8(c-2″′)，72.3(c-3″′)，73.5(c-4″′)，70.1(c-5″′)，18.1(c-6″′).

二、体外实验探究裂果薯皂苷抗肝纤维化的作用

方法：

用mtt法分别测定裂果薯总皂苷、裂果薯皂苷ⅰ、裂果薯皂苷ⅱ对大鼠肝星状细胞hsc-t6增殖的抑制作用，体外实验初步探究了裂果薯皂苷抗肝纤维化的作用。

结果：

mtt法检测结果显示：不同浓度sfsp分别作用hsc-t6细胞，sshps能明显抑制hsc-t6细胞存活，随着浓度的增加，其抑制作用增强。利用spss22.0计算出sfsp对hsc-t6细胞作用24h时ic50为3.841μg/ml。结果见表1，表2，表3。

表1sfsp对hsc-t6细胞的增殖的抑制作用(x±s，n＝3)

与对照组比较：*p＜0.05**p＜0.01

*p<0.05**p<0.01vscontrolgroup,sameasbelow

表2sphsⅰ对hsc-t6细胞增殖的抑制作用(x±s，n＝3)

表3sphsⅱ对hsc-t6细胞增殖的抑制作用(x±s，n＝3)

三、体内实验观察裂果薯皂苷对大鼠肝纤维化的影响

目的：研究裂果薯皂苷对大鼠肝纤维化的影响

方法：

1.大鼠肝纤维化动物模型的制备、分组与处理:

将雄性sd大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、秋水仙碱(阳性对照)组、低剂量药物组、中剂量药物组。每组12只，除正常组，其余为肝纤维化造模组。造模组灌胃给50％ccl4花生油溶液2ml/kg，正常对照组灌胃同体积的生理盐水，每周2次。分别于造模后第8周、第9周及第10周抽取2只肝纤维化大鼠及1只正常对照组大鼠，进行病理学检查，监测肝纤维化形成的情况。10周后,处死大鼠,取血，大鼠血液静置2h后，3000转/分钟(revolutionsperminute，rpm)下离心15min，取上清，-80℃冻存，备用。

2.检测指标：

①肝组织病理学观察

②透射电镜观察肝组织细胞超微结构

③肝组织羟脯氨酸(hyp)

④血清透明质酸(ha)、层黏连蛋白(ln)

⑤血清ecm成分如iv胶原(colⅳ)、ⅲ型前胶原(pcⅲ)

结果：

(1)对肝组织病理形态学及细胞超微结构的影响

图3和图4he染色和masson染色结果显示：对照组大鼠肝小叶结构完整，肝细胞索以中央静脉为中心向四周呈放射状整齐排列，肝细胞未见变性或坏死。模型组大鼠肝细胞呈弥漫性脂肪变性，肝索排列紊乱，肝小叶被破坏，形成大小不等的圆形或椭圆形肝细胞结节所构成的假小叶,周围纤维组织增生。裂果薯总皂苷各组大鼠肝细胞排列紊乱,肝小叶结构有破坏肝小叶间纤维间隔形成减少，纤维结缔组织增生分布较模型组少，可观察到肝组织病理损伤比模型组明显减轻。

图5电镜结果显示,正常组大鼠肝细胞核圆或椭圆，核膜清晰，内质网分布规律，线粒体呈圆，未见明显脂滴存在；模型对照组细胞核固缩，内质网扩张，无规律分布，线粒体肿胀，糖原减少，胶原纤维束明显增生；裂果薯总皂苷作用后，肝细胞器病变改善，形态良好,纤维细小,可见少量肝星状细胞凋亡小体。

(2)肝组织羟脯氨酸(hyp)含量

相比正常组，模型组大鼠肝组织中hyp水平明显上升，给予药物后，与模型组相比，裂果薯总皂苷能明显降低hyp水平。结果见表4

表4裂果薯总皂苷对肝纤维化大鼠肝脏hyp的影响

注：与对照组相比较，#p﹤0.05或##p﹤0.01；与模型组相比较，*p﹤0.05或**p﹤0.01；

(3)血清ha、ln、col-ⅳ、pcⅲ含量

血清中ha、ln、col-ⅳ、pcⅲ含量是衡量肝纤维化发生的重要指标，本实验中，模型组血清中ha、ln、pcⅲ含量均明显升高，裂果薯总皂苷则能明显降低了上述指标的含量(p＜0.05)。结果见表5

表5裂果薯总皂苷对血清中ha、ln、col-ⅳ、pcⅲ含量的影响

注：与正常对照组相比较，#p﹤0.05或##p﹤0.01；与模型组相比较，*p﹤0.05或**p﹤0.01；

结论：ha是一种广泛存在于细胞外基质中的高分子多糖，主要由肝窦内皮细胞进行降解。因此，ha可以反映肝脏的损伤程度和纤维化的发展变化。ln是一种大分子非胶原糖蛋白，由肝星状细胞合成后主要分布于基底膜的透明层中。肝星状细胞大量合成和分泌胶原、ln等间质成分，形成完整的基底膜。而pcⅲ升高反映的是肝脏纤维增生活跃。hyp在肝脏胶原纤维含量最高，对肝纤维化的诊断具有重要意义。肝内胶原纤维的不断增加，也会促使肝纤维化的发生和发展。综合检测大鼠血清ha，ln，col-ⅳ、pcⅲ和肝组织中hyp水平可有效判断肝纤维化程度。本实验中，裂果薯总皂苷能显著降低肝纤维化大鼠中ha，ln，col-ⅳ、pcⅲ的含量和肝组织中hyp水平，抑制hsc-t6的活性，表明了裂果薯总皂苷能显著降低胶原纤维的堆积，减轻肝组织病理损伤、促进肝星状细胞凋亡等，提示裂果薯皂苷对肝纤维化具有明显抑制作用，是肝纤维化的一种非常有潜在价值的新药，值得进一步研究。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。