本发明涉及组织工程领域，具体涉及一种可缓释生物活性因子的微孔隙脱细胞牛心包基质。
背景技术：
组织工程是将活细胞接种在组织基质上，制造出一种与受者组织相容性好，无免疫原性、不需抗凝、耐久性强的生物材料。其中，天然基质材料是组织工程研究的重要内容之一。理想的天然基质材料应具备以下优点：(1)良好的组织相容性，无生物毒性；(2)具有三维立体结构，材料需呈多孔海绵状，有利于细胞粘附浸润，以及营养物质的深入和代谢产物的排泄；(3)富含生物活性因子，为宿主细胞生长提供良好的微环境；(4)具有良好的机械性能，能抵抗体内血液等流体冲刷。
目前，组织工程基质材料主要分为人工高分子生物合成材料和天然基质材料两类。人工高分子生物合成材料组织相容性差、体内组织重塑不良，故限制了其广泛应用。而天然基质材料，例如牛心包因其来源广泛、具有良好的张力强度、易于塑形和缝合等优点，而广泛用于生物型人工心脏瓣膜、人工血管的制备以及各种组织器官缺损的修补材料。在当前的应用过程中，常用戊二醛对牛心包中的细胞和基质进行交联固定，以达到降低免疫原性、减轻异物反应、稳定胶原基质、增强抗酶解能力以及达到对材料进行消毒、保存的目的。尽管这种处理的牛心包在临床上已经获得很大成功，但戊二醛并不能完全封闭异种抗原，残留抗原所引起的免疫排斥反应以及戊二醛所致的钙化是导致构建组织器官失功、影响其临床使用寿命的主要原因之一。另外戊二醛具有生物毒性，导致宿主细胞不易生长，体内重塑性差。
因此，研发无免疫原性、组织相容性和力学性能优良，在结构上呈多孔海绵状、富含生物活性分子的牛心包基质材料对解决当前牛心包临床应用瓶颈至关重要。脱细胞是组织工程研究中降低移植组织免疫原性、保留移植物三维组织结构和生物力学性能的重要方法。其中，去污剂是最常用的脱细胞试剂，其可分为离子型和非离子型去污剂两种。虽然离子型去污剂能取得良好的脱细胞效果，但是残存毒性、易去除可溶性的生物活性因子、基质材料结构致密等导致细胞很难内生性生长，在宿主体内重塑效果不佳，这成为限制其处理临床组织标本的瓶颈。
技术实现要素：
本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种可缓释生物活性因子的微孔隙脱细胞牛心包基质。
本发明提供了一种可缓释生物活性因子的微孔隙脱细胞牛心包基质，具有这样的特征：可缓释生物活性因子的微孔隙脱细胞牛心包基质具有微孔结构以及附着在微孔结构表面的生物活性因子，微孔结构为海绵状，微孔结构的微孔的形状为圆形或椭圆形，可缓释生物活性因子的微孔隙脱细胞牛心包基质的微孔大小不一，最大直径可达50μm，其中，生物活性因子为具有生物活性的生长因子，可缓释生物活性因子的微孔隙脱细胞牛心包基质通过将牛心包在真空条件下置于非离子型去污剂缓冲液中进行多次冻融后再依次在非离子型去污剂缓冲液、无菌去离子水以及磷酸盐溶液中进行震荡清洗，最后浸没在生物活性因子琼脂糖材料中得到的。
在本发明提供的可缓释生物活性因子的微孔隙脱细胞牛心包基质中，还可以具有这样的特征：其中，非离子型去污剂缓冲液包括：tris缓冲液、非离子型去污剂以及脱氧胆酸钠，tris缓冲液的物质的量浓度范围为8～12mmol/l，ph值为7.4～7.8，非离子型去污剂在tris缓冲液的体积分数范围为0.8％～1.5％w/v，脱氧胆酸钠在tris缓冲液的体积分数范围为0～0.8％w/v。
在本发明提供的可缓释生物活性因子的微孔隙脱细胞牛心包基质中，还可以具有这样的特征：其中，去污剂为聚乙二醇辛基苯基醚。
在本发明提供的可缓释生物活性因子的微孔隙脱细胞牛心包基质中，还可以具有这样的特征：其中，生物活性因子琼脂糖材料中的生物活性因子的浓度范围为2.0～12.0μg/ml。
在本发明提供的可缓释生物活性因子的微孔隙脱细胞牛心包基质中，还可以具有这样的特征：其中，将牛心包在真空条件下置于非离子型去污剂缓冲液中进行2～10次冻融，每次冻融的冷冻时间为4～5h。
在本发明提供的可缓释生物活性因子的微孔隙脱细胞牛心包基质中，还可以具有这样的特征：其中，经过冻融后的牛心包瓣在非离子型去污剂缓冲液中进行震荡处理需要在30～50℃摇床中震荡处理28～96h。
在本发明提供的可缓释生物活性因子的微孔隙脱细胞牛心包基质中，还可以具有这样的特征：其中，对牛心包用无菌去离子水震荡清洗12～48h。
在本发明提供的可缓释生物活性因子的微孔隙脱细胞牛心包基质中，还可以具有这样的特征：其中，对牛心包用磷酸盐溶液震荡清洗48～96h。
发明的作用与效果
根据本发明所涉及的可缓释生物活性因子的微孔隙脱细胞牛心包基质，因为具有微孔结构和生物活性因子，微孔的形状为圆形或椭圆形，微孔大小不一，最大直径可达50μm，这样的微孔结构以及孔隙率能够促进去污剂侵入组织内部去除细胞，进而能够减少去污剂的使用浓度，有效保留牛心包的三维结构及生物力学性能，并且显著降低去污剂的残留毒性。此外，可缓释生物活性因子的微孔隙脱细胞牛心包基质在宿主体内能够释放生物活性因子，从而促进间充质干细胞聚集，维持宿主细胞成纤维细胞样表型。可用于生物型人工心脏瓣膜、人工血管的制备以及各种组织器官缺损的修补材料。因此，可缓释生物活性因子的微孔隙脱细胞牛心包基质非常适用于生物型人工心脏瓣膜、人工血管的制备以及各种组织器官缺损的修补材料。
附图说明
图1是本发明的实施例中牛心包和可缓释生物活性因子的微孔隙脱细胞牛心包基质的示意图；
图2是本发明的实施例中牛心包和可缓释生物活性因子的微孔隙脱细胞牛心包基质的扫描电镜示意图；以及
图3是本发明的实施例中牛心包和可缓释生物活性因子的微孔隙脱细胞牛心包基质的生物力学性能检测结果的示意图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，以下实施例结合附图对本发明可缓释生物活性因子的微孔隙脱细胞牛心包基质作具体阐述。
图1是本发明的实施例中牛心包和可缓释生物活性因子的微孔隙脱细胞牛心包基质的示意图。
图2是本发明的实施例中牛心包和可缓释生物活性因子的微孔隙脱细胞牛心包基质的扫描电镜示意图。
如图1、2所示，图1(a)处理前牛心包、图2(a)表示正常对照的牛心包，图1(b)、图2(b)表示可缓释生物活性因子的微孔隙脱细胞牛心包基质。如图1、2所示，本实施例中的可缓释生物活性因子的微孔隙脱细胞牛心包基质具有连续的微孔结构。微孔结构为海绵状，微孔结构的微孔的形状为圆形或椭圆形大小不一，最大直径可达50μm。微孔结构充填有生物活性因子。生物活性因子为有生物活性的生长因子。在本实施例中，生长因子为人重组碱性成纤维细胞生长因子(humanrecombinantbasicfibroblastgrowthfactor,hrbfgf)。可缓释生物活性因子的微孔隙脱细胞牛心包基质的吸水率为27.76±0.05％。
本实施例中的可缓释生物活性因子的微孔隙脱细胞牛心包基质的制备过程如下：
步骤一，在真空条件下，将牛心包置于非离子型去污剂缓冲液中冷冻2～6h，非离子型去污剂缓冲液包括：tris缓冲液、非离子型去污剂以及脱氧胆酸钠。非离子型去污剂为聚乙二醇辛基苯基醚(tritonx-100)。tris缓冲液的浓度范围为8～12mmol/l，ph值为7.4～7.8，tritonx-100在tris缓冲液的体积分数范围为0.8％～1.5％w/v，脱氧胆酸钠在tris缓冲液的体积分数范围为0～0.8％w/v。在本实施例中，tris缓冲液、tritonx-100以及脱氧胆酸钠的配比为：tris缓冲液的物质的量浓度为10mmol/l、ph为7.6，每100ml的tris缓冲液中加入0.8～1.5mltritonx-100和0.1～0.5g的脱氧胆酸钠。牛心包在非离子型去污剂缓冲液中的冷冻时间为4～5h。
步骤二，冷冻结束后，将冷冻后的牛心包放置在温度为30～50℃的水浴中溶解。
步骤三，重复步骤一与步骤二1～10次，将牛心包进行多次冻融。
步骤四，将多次冻融后的牛心包从非离子型去污剂缓冲液中取出，然后放置于新的非离子型去污剂缓冲液中，并在30～50℃摇床中处理震荡28～96h。
步骤五，用无菌去离子水对震荡后的牛心包震荡清洗12～48h。在本实施例中，无菌去离子水对牛心包的震荡清洗时间为24～36h，优选震荡时间为24h。
步骤六，用磷酸盐溶液对无菌去离子水清洗后的牛心包震荡清洗48～96h后，得到牛心包的脱细胞基质。在本实施例中，磷酸盐溶液对牛心包的震荡清洗时间为72h。
步骤七，将牛心包的脱细胞基质浸没在生物活性因子琼脂糖材料中20min～2h，得到可缓释生物活性因子的微孔隙脱细胞牛心包基质。生物活性因子琼脂糖材料为含有生物活性因子的琼脂糖材料。生物活性因子的浓度范围为2.0～12.0μg/ml。
以本实施例所涉及的可缓释生物活性因子的微孔隙脱细胞牛心包基质为实验组，以正常的牛心包(未进行脱细胞处理)作为对照组，对以上两种基质进行结构以及性能测定，其得到的结果如下：
(一)可缓释生物活性因子的微孔隙脱细胞牛心包基质不含细胞以及细胞碎片
dna定量检测结果为：对照组的dna含量为883.96±149.25ng/mg(湿重)；实验组的dna含量为608.30±67.48ng/mg(湿重)。
dna定量检测结果表明：实验组中的dna含量明显低于对照组(p<0.05)，说明可缓释生物活性因子的微孔隙脱细胞牛心包基质有效去除异种核材料。
(二)可缓释生物活性因子的微孔隙脱细胞牛心包基质具有连续的微孔结构
扫面电镜结果如图2所示，对照组的组织结构十分紧密，实验组具有连续的微孔结构，微孔结构为海绵状，直径大小不一，最大直径可达50μm。
(三)可缓释生物活性因子的微孔隙脱细胞牛心包基质的吸水率增高
吸水率检测结果为：对照组的吸水率为35.68±0.06％，实验组的吸水率为27.76±0.05％。与对照组相比，实验组的基质的吸水率下降。
(四)可缓释生物活性因子的微孔隙脱细胞牛心包基质能保持牛心包的生物力学性能和三维结构
图3是本发明的实施例中牛心包和可缓释生物活性因子的微孔隙脱细胞牛心包基质的生物力学性能检测结果的示意图。
如图3所示，图3(a)表示正常牛心包对照组，图3(b)表示实验组。实验组可缓释生物活性因子的微孔隙脱细胞牛心包基质的最大载荷量为97.02±28.09n，最大应力为18.62±4.84mpa，弹性模量为16.65±4.75mpa。与对照组相比，实验组的最大载荷(88.18±10.87n)、最大应力(15.57±1.73mpa)以及弹性模量(14.93±2.33mpa)均无明显统计学意义的改变(p>0.05)。
此外，弹力胶原染色表明，可缓释生物活性因子的微孔隙脱细胞牛心包基质细胞外基质结构完整，与对照组相比，结构疏松。
(五)将牛心包浸没在磷酸盐缓冲液中，收集浸提液，采用酶联免疫吸附测定检测生长因子的释放。结果表明hrbfgf在第1、4、8、12、16、20天的释放量分别为190.8±76.2ng/l、199.7±80.0ng/l、200.7±64.8ng/l、180±43.8ng/l、176.1±54.3ng/l、201.8±91.5ng/l，释放方式呈缓慢、平稳方式。
(六)在动物体内，本实施例所涉及的方法处理的能缓释生物活性因子的脱细胞牛心包基质能促进间充质干细胞的粘附生长。在第1天，实验组中的cd29阳性、cd45阴性的间充质干细胞的数量为78.7±23.7个/高倍镜视野，而对照组中间充质干细胞的数量则为46.3±25.5个/高倍镜视野。两组相比具有明显的统计学意义(p<0.05)。
(七)在动物体内，本实施例所涉及的方法处理的能缓释生物活性因子的脱细胞牛心包基质能抑制肌纤维母细胞分化。在第28天，实验组中肌纤维母细胞的数量为8.0±5.8个/高倍镜视野，而对照组中肌纤维母细胞的数量则为53.5±25.9个/高倍镜视野。两组相比具有明显的统计学意义。
(八)在动物体内，本实施例所涉及的方法处理的能缓释生物活性因子的脱细胞牛心包基质能促进血管新生。在第28天，实验组组织内部微血管数量为34.7±14.3个/高倍镜视野，而对照组组织内部微血管数量则为18.0±8.2个/高倍镜视野。两组相比具有明显的统计学意义。
实施例的作用与效果
根据本实施例所涉及的可缓释生物活性因子的微孔隙脱细胞牛心包基质，因为具有微孔结构和生物活性因子，微孔结构呈的微孔的形状为圆形或椭圆形，微孔的直径大小不一，最大直径可达50μm。这样的微孔结构以及孔隙率能够促进去污剂侵入组织内部去除细胞，进而能够减少去污剂的使用浓度，有效保留牛心包的三维结构及生物力学性能，并且显著降低去污剂的残留毒性。此外，可缓释生物活性因子的微孔隙脱细胞牛心包基质在宿主体内能够释放生物活性因子，从而促进间充质干细胞聚集，维持宿主细胞成纤维细胞样表型。可用于生物型人工心脏瓣膜、人工血管的制备以及各种组织器官缺损的修补材料。因此，可缓释生物活性因子的微孔隙脱细胞牛心包基质非常适用于生物型人工心脏瓣膜、人工血管的制备以及各种组织器官缺损的修补材料。
另外，由于本制备方法是以牛心包为研究对象，因此，本制备方法的成本低廉，节省了数亿元的宝贵的医疗资源，为其临床应用及脱细胞基质的优化研发提供了实验依据和指针。
此外，在上述实施例中，因为采用的非离子型去污剂缓冲液中包括tris缓冲液、非离子型去污剂tritonx-100以及脱氧胆酸钠，所以，本发明的制备方法可以有效地去除牛心包的细胞及核材料，降低体内炎症反应和钙盐沉积。
上述实施方式为本发明的优选案例，并不用来限制本发明的保护范围。