本发明涉及组织工程领域，具体涉及一种猪主动脉脱细胞基质的制备方法。
背景技术
以主动脉瘤、血管夹层、动脉粥样硬化为代表的血管性疾病不仅是发达国家，还是发展中国家的首要致死性病变之一。外科手术置换病变血管是血管性疾病治疗的最终手段，因而需要各种血管置换材料。另外，随着食管癌发病率的逐年增高，人工食管置换材料的需求也越来越多。
同种组织置换虽然是理想的置换材料，但来源少、存在伦理学限制。而当前随着生物科技的发展，现已研发出多种高分子生物合成材料作为人工组织置换材料。例如，pet(polyethyleneterephthalate,dacron)和eptfe(expandedpolytetra-fluoroethylene)、聚氨酯(polyurethane)因其具有较好的生物力学性能和体内相容性而广泛应用于心血管外科手术。但是合成材料在临床应用时也有局限性，例如合成生物材料与天然组织不匹配是导致移植失败的重要因素，增加患者死亡率。另外，持续的慢性炎症反应所导致的移植组织内膜增生、慢性感染等风险增加了移植后期衰败的发生率。
因此，研发一种在组织结构和功能上和正常主动脉、食管相类似的替代物至关重要。基于此原因，脱细胞猪主动脉因其在大体、显微镜下以及生理功能上类似于人主动脉而受到越来越多的关注。并且，有研究表明，猪主动脉在功能上可以代替食管。
脱细胞是组织工程研究中降低移植组织免疫原性、保留移植物三维组织结构、生物力学性能、生物活性的重要方法，并且，脱细胞方法已成功应用于心脏瓣膜、前列腺、角膜、跟腱等组织工程研究中。现有技术一般使用去污剂来处理猪主动脉从而实现脱细胞的目的，虽然这种方法能取得良好的脱细胞效果，但是通过这种方法得到的脱细胞猪主动脉基质往往残存毒性，并且其生物力学性能也遭到了破坏。此外，大量研究表明脱细胞的猪主动脉的细胞外基质结构致密，因此，应用于宿主体内时细胞很难内生性生长，在宿主体内重塑效果不佳。
技术实现要素：
本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种猪主动脉脱细胞基质的制备方法。
本发明提供了一种猪主动脉脱细胞基质的制备方法，具有这样的特征，包括以下步骤：步骤一，在真空条件下，将猪主动脉置于低浓度去污剂缓冲液中冷冻2～6h；步骤二，冷冻结束后，将冷冻后的猪主动脉水浴溶解；步骤三，重复步骤一与步骤二1～10次，将猪主动脉进行多次冻融；步骤四，将多次冻融后的猪主动脉放置于低浓度去污剂缓冲液中，并在30～50℃摇床中处理震荡28～96h；步骤五，用无菌去离子水对震荡后的猪主动脉震荡清洗12～48h；以及步骤六，用磷酸盐溶液对无菌去离子水清洗后的猪主动脉震荡清洗48～96h后，得到猪主动脉细胞的脱细胞基质，其中，低浓度去污剂缓冲液包括tris缓冲液、十二烷基硫酸钠以及脱氧胆酸钠，tris缓冲液的浓度范围为8～12mmol/l，ph值为7.4～7.8，十二烷基硫酸钠在tris缓冲液的体积分数范围为0.1％～0.5％w/v，脱氧胆酸钠在tris缓冲液的体积分数范围为0～0.8％w/v。
在本发明提供的猪主动脉脱细胞基质的制备方法中，还可以具有这样的特征：其中，在步骤二中，水浴的温度为30～50℃。
在本发明提供的猪主动脉脱细胞基质的制备方法中，还可以具有这样的特征：其中，tris缓冲液的浓度为10mmol/l、ph为7.6。
在本发明提供的猪主动脉脱细胞基质的制备方法中，还可以具有这样的特征：其中，在步骤一中，猪主动脉的冷冻时间为4～5h。
在本发明提供的猪主动脉脱细胞基质的制备方法中，还可以具有这样的特征：其中，在步骤五中，去离子水的震荡清洗时间为24～36h。
在本发明提供的猪主动脉脱细胞基质的制备方法中，还可以具有这样的特征：其中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.1～0.5mmol/l。
在本发明提供的猪主动脉脱细胞基质的制备方法中，还可以具有这样的特征：其中，在步骤六中，磷酸盐溶液的震荡清洗时间为72h。
发明的作用与效果
根据本发明所涉及的猪主动脉脱细胞基质的制备方法，因为该制备方法中以猪主动脉为研究对象，采用低浓度去污剂作为缓冲液进行冷冻，然后水浴溶解，将猪主动脉经过多次冻融之后放置在去污剂缓冲液中震荡，最后分别用去离子水以及磷酸盐溶液对震荡后的猪主动脉进行震荡清洗，即可得到猪主动脉的脱细胞基质，所以，本发明的制备方法得到的脱细胞基质呈微孔样结构、力学性能优良，且无毒性，免疫原性低，钙化率低，可用于血管、食管等临床组织工程移植，且体内重塑性好。
另外，由于本制备方法是以猪主动脉为研究对象，因此，本制备方法的成本低廉，节省了数亿元的宝贵的医疗资源，为组织工程血管、食管的临床应用及脱细胞基质的优化研发提供了实验依据和指针。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，以下结合实施例对本发明猪主动脉脱细胞基质的制备方法作具体阐述。
猪主动脉脱细胞基质的制备方法主要包括以下步骤：
步骤一，在真空条件下，将猪主动脉置于低浓度去污剂缓冲液中冷冻2～6h，低浓度去污剂缓冲液包括：tris缓冲液、十二烷基硫酸钠以及脱氧胆酸钠。tris缓冲液的浓度范围为8～12mmol/l，ph值为7.4～7.8，十二烷基硫酸钠在tris缓冲液的体积分数范围为0.1％～0.5％w/v，脱氧胆酸钠在tris缓冲液的体积分数范围为0～0.8％w/v。在本实施例中，缓冲液、十二烷基硫酸钠以及脱氧胆酸钠的配比为：tris缓冲液的浓度为10mmol/l、ph为7.6，每100ml的tris缓冲液中加入0.1～0.4g十二烷基硫酸钠和0.1～0.5g的脱氧胆酸钠。猪主动脉在低浓度去污剂缓冲液中的冷冻时间为4～5h。
步骤二，冷冻结束后，将冷冻后的猪主动脉放置在温度为30～50℃的水浴中溶解。
步骤三，重复步骤一与步骤二1～10次，将猪主动脉进行多次冻融。
步骤四，将多次冻融后的猪主动脉从低浓度去污剂缓冲液中取出，然后放置于去污剂缓冲液中，并在30～50℃摇床中处理震荡28～96h。
步骤五，用无菌去离子水对震荡后的猪主动脉震荡清洗12～48h。在本实施例中，无菌去离子水对猪主动脉的震荡清洗时间为24～36h，优选震荡时间为24h。
步骤六，用磷酸盐溶液对无菌去离子水清洗后的猪主动脉震荡清洗48～96h后，得到猪主动脉的脱细胞基质。在本实施例中，磷酸盐溶液对猪主动脉的震荡清洗时间为72h。
以本实施例中的真空冻融-低浓度十二烷基硫酸钠(vacuum-freeze-thawing-lowconcentrationsds,vls)处理得到的猪主动脉的脱细胞基质为实验组，以高浓度十二烷基硫酸钠(highconcentrationsds,hcs)处理得到的猪主动脉的脱细胞基质为对照组，对上述两组脱细胞基质进行结构以及性能测定，其得到的结果如下：
(一)真空冻融-低浓度十二烷基硫酸钠方法能有效去除猪主动脉细胞dna，形成连续的微孔样结构
病理h&e染色表明，与正常猪主动脉相比，vls方法和hcs均能有效去除细胞及细胞碎片。
dna定量检测结果为：hcs组的dna含量为818.4±226.2ng/mg湿重组织；vls组的dna含量为497.5±323.6ng/mg湿重组织。dna定量检测则表明，vls和hcs均能有效降低猪主动脉组织中的dna含量，并且vls处理组织中的dna含量明显低于hcs处理组织(p<0.05)。
扫描电镜表明，vls处理组织形成连续的微孔样结果，而hcs处理组织也能形成微孔样结构，但是孔壁断裂。
(二)真空冻融-低浓度十二烷基硫酸钠方法能保持猪主动脉生物力学性能和三维结构
生物力学性能检测结果如表1所示：
表1
如表1所示，长轴生物力学分析表明，与正常猪主动脉相比，vls处理猪主动脉的最大载荷、最大应力以及弹性模量无明显统计学意义(p>0.05)。但是，hcs处理却显著降低猪主动脉的最大载荷、最大应力以及弹性模量(p<0.05)。
横轴生物力学分析表明，vls处理后，猪主动脉的最大载荷、最大应力以及弹性模量上升。hcs处理却显著降低猪主动脉的最大载荷(p<0.05)。
弹力胶原染色表明，vls处理的猪主动脉细胞外基质结构完整，而hcs破坏猪主动脉细胞外基质，部分区域胶原弹力断裂。
(三)真空冻融-低浓度十二烷基硫酸钠方法所处理的猪主动脉无细胞毒性
抽提细胞毒性检测表明，与正常培养基处理细胞相比，vls处理抽提基质能显著促进脐静脉内皮细胞和间充质干细胞的生长，但是hcs处理抽提基质导致大量细胞凋亡、坏死，生长抑制。vls组脐静脉内皮细胞的生长能力是正常培养基细胞生长能力的1.5±0.1倍，而hcs组细胞的生长能力仅为正常培养基细胞生长能力的0.3±0.1倍。vls组间充质干细胞的生长能力是正常培养基细胞生长能力的1.1±0.1倍，而hcs组细胞的生长能力仅为正常培养基细胞生长能力的0.6±0.3倍。vls组和hcs组相比具有明显的统计学意义(p<0.05)。
接触细胞毒性检测表明，vls处理猪主动脉共培养的脐静脉内皮细胞和间充质干细胞的生长状况良好，但是与hcs处理猪主动脉共培养的细胞大量坏死、凋亡，呈球形漂浮。
(四)体内，真空冻融-低浓度十二烷基硫酸钠方法处理的猪主动脉的钙化及炎症反应轻
将处理的猪主动脉大鼠皮下包埋，在特定时间点取出检测钙化及炎症反应。结果表明在第28天，vls处理(19.2±5.4/单位)猪主动脉的钙化程度显著低于hcs组(31.8±12.5)，两组相比具有统计学意义(p<0.05)。
炎症反应检测则表明，早期，hcs处理猪主动脉导致持续的急性炎症反应，高峰期在第3天(231.2±139.3个/高倍镜视野)，而vls处理组急性炎症反应轻，第3天就已经结束。中后期，两组移植物中均可见以cd4和cd8为主的慢性t淋巴细胞浸润。在第28天，hcs组中的cd4和cd8细胞的数量分别为90.0±23.3个/高倍镜视野、165.8±65.3个/高倍镜视野；而vls组中的cd4和cd8细胞的数量则分别为61.2±13.4个/高倍镜视野、57.8±30.8个/高倍镜视野。vls组和hcs组相比具有明显的统计学意义(p<0.05)。
(五)体内，真空冻融-低浓度十二烷基硫酸钠方法处理的猪主动脉的血管和组织重塑显著
免疫组织化学染色结果表明，28天时，vls处理猪主动脉中肌纤维母细胞均匀分布于猪主动脉各层；hcs处理猪主动脉虽然中央也有肌纤维母细胞浸润(28天，37.7±19.3个/高倍镜视野)，但数量显著低于vls处理组(28天，127.5±20.3个/高倍镜视野)的数量(p<0.05)。肌纤维母细胞是分泌胶原的重要细胞，与肌纤维母细胞分布一致，胶原染色表明，vls处理猪主动脉中周围及中央区域均有新生胶原形成。
血管免疫组织化学结果表明，28天时，vls处理猪主动脉中新生血管均匀分布于猪主动脉各层；hcs处理猪主动脉(28天，15.8±12.4个/高倍镜视野)虽然中央也有新生血管形成，但数量显著低于vls处理组(28天，39.3±11.9个/高倍镜视野)的数量(p<0.05)。
实施例的作用与效果
根据上述实施例中的猪主动脉脱细胞基质的制备方法，因为该制备方法中以猪主动脉为研究对象，采用低浓度去污剂作为缓冲液进行冷冻，然后水浴溶解，将猪主动脉经过多次冻融之后放置在去污剂缓冲液中震荡，最后分别用去离子水以及磷酸盐溶液对震荡后的猪主动脉进行震荡清洗，即可得到猪主动脉的脱细胞基质，所以，本发明的制备方法得到的脱细胞基质呈微孔样结构、力学性能优良，且无毒性，免疫原性低，钙化率低，可用于血管、食管等临床组织工程移植，且体内重塑性好。
另外，由于本制备方法是以猪主动脉为研究对象，因此，本制备方法的成本低廉，节省了数亿元的宝贵的医疗资源，为组织工程血管、食管的临床应用及脱细胞基质的优化研发提供了实验依据和指针。
此外，在上述实施例中，因为采用的低浓度去污剂缓冲液为低浓度十二烷基硫酸钠缓冲液，该缓冲液中包括tris缓冲液、十二烷基硫酸钠以及脱氧胆酸钠，所以，本发明的制备方法可以有效地去除猪主动脉组织的细胞及核材料，降低体内炎症反应和钙盐沉积。
另外，本实施例中的制备方法能够促进猪主动脉组织形成连续的微孔样结构，该微孔样结构能够促进去污剂侵入组织内部去除细胞，进而能够减少去污剂的使用浓度，有效保留猪主动脉组织的三维结构及生物力学性能，并且显著降低去污剂的残留毒性。
不仅如此，通过上述实施例得到的猪主动脉的脱细胞基质的微孔样结构能够促进纤维母细胞和血管内皮细胞浸润性生长，从而促进促管与胶原新生。
上述实施方式为本发明的优选案例，并不用来限制本发明的保护范围。