本发明涉及一种甘草黄酮纳米海绵及其制备工艺。
背景技术：
甘草为豆科蝶形花亚科甘草属多年生草本植物，汉代《名医别录》谓之为“国老”，并解释曰“此草为众药之主，经方少有不用者”。黄酮为甘草中主要有效成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、清除自由基、抗变态反应、抗病原微生物、抑制酶活性、抗溃疡、抗心律失常、抗糖尿病以及保肝护肝等多种药理作用。
甘草黄酮(lf)因水溶解性差、生物利用度低、口服制剂服用剂量大、日服用次数多等因素而广受诟病，限制了相关产品的进一步研究和应用。
目前对难溶性成分的增溶手段主要有β-cd包合、反胶束体系、固体分散技术、微乳、脂质体、自乳化、水溶性复合盐、磷脂复合物，以及近年的纳米混悬剂和微海绵剂等技术。综观研究进展，现有增溶手段对难溶性成分具有较好的效果，但同时存在一定的问题。如β-cd包合存在包合率低和对客体分子选择性的现状，固体分散体中药物有转化为稳定药物结晶趋势和制剂老化的问题，乳化剂的制剂稳定性和载药量低等问题不可忽视，脂质体的贮存稳定性和生产重现性差、包裹率低及药物泄露等问题。
因此，亟待出现一种对大多数难溶性药物都能增溶、且增溶效果好、性质稳定的广谱增溶载体。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种甘草黄酮(lf)纳米海绵(nsp)的制备工艺。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
纳米海绵5～20份，甘草黄酮2～10份；所述纳米海绵由交联剂和环糊精制成，交联剂与环糊精的摩尔比为(1～20)：(0.2～10)。
本发明进一步地，所述交联剂为含有羰基或二羧酸酯化合物的一种或两种以上混合物；优选为丙烯酸、聚丙烯酸酯、聚烷基丙烯酸酯、丙烯酸丁酯、碳酸二本酯的一种或两种以上混合物
所述环糊精为α环糊精、β-环糊精和γ-环糊精不同类型中的一种或几种。
本发明进一步地，所述交联剂与环糊精的摩尔比为(4～16)：(1～4)；优选为4:1。
进一步地，所述纳米海绵按照如下方法制备：取环糊精加至熔化后的交联剂中，搅拌，冷却，洗涤后纯化，干燥。
更进一步地，搅拌温度为35～55℃，搅拌时间为2～6h，搅拌速率为100～300r·min-1。
更进一步地，本发明所述甘草黄酮纳米海绵中纳米海绵与甘草黄酮的重量比为2:1。
更进一步地，本发明所述甘草黄酮纳米海绵按照如下方法制备：
取纳米海绵分散于水中，取甘草黄酮分散于乙醇中，将乙醇分散的甘草黄酮加入水分散的纳米海绵中，搅拌，离心，冷冻干燥。
更进一步地，本发明所述纳米海绵每0.156g分散于20ml水中，所述甘草黄酮每0.078g分散于5ml乙醇中。
进一步地，本发明所述纳米海绵制备工艺如下：所述搅拌温度为45℃，搅拌的时间为4～6h，优选为4.8h，搅拌速度为100～300r·min-1，优选200～300r·min-1，进一步优选为245r·min-1；所述离心是4000r·min-1离心15min；所述减压冷冻的冷冻温度-20℃，压力100pa。本发明还提供了甘草黄酮纳米海绵制备方法，步骤如下：取纳米海绵分散于水中，取甘草黄酮分散于乙醇中，将乙醇分散的甘草黄酮加入水分散的纳米海绵中，搅拌，离心，冷冻干燥。
本发明提供的甘草黄酮纳米海绵，其溶解度高，溶出度优良，性质稳定，显著提高了甘草黄酮的生物利用度，提高了患者的依从性，保证了临床疗效，同时制备工艺简便，成本低廉。
lf：甘草黄酮；
nsp：纳米海绵；
cd：环糊精；
β-cd：β-环糊精；
dpc：碳酸二本酯。
附图说明
图1β-cd(a)，nsp(b)，lf(c)，lf-nsp(d)及其物理混合物(e)的ft-ir图
图2β-cd(a)、nsp(b)、lf(c)、lf-nsp(d)、物理混合物(e)的dsc图
图3lf-nspsem图
图4物理混合物(a)，lf-nsp(b)，lf(c)，nsp(d)以及β-cd(e)的xrd图
图5lf-nsp及lf原料药累计释放曲线
具体实施方式
1仪器与材料
85-2a数显恒温测速磁力搅拌器(金坛市白塔新宝仪器厂)；upt-i-10t超纯水器(成都超纯科技有限公司)；fa224型电子天平(万分之一，上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；uv-6000型紫外-可见分光光度计(上海美谱达有限公司)；nicomp380zls型激光粒度分析仪(美国pss公司)；hsc-1差式扫描量热仪(北京恒久科学仪器厂)；rc-3型溶出度测试仪(山东博科科学仪器有限公司)；80-1型离心沉淀器(江苏正基仪器有限公司)；sjia-10n-50型冷冻干燥机(宁波市双嘉仪器有限公司)；spectrumone红外光谱仪(美国perkunelmer公司)。
甘草苷对照品(成都曼思特生物科技有限公司，批号must-16032801，纯度98％)；甘草黄酮原料药lf(西安小草植物科技有限公司，批号xc20160508，总黄酮质量分数70.0％)；碳酸二苯酯(dpc，南京都莱生物技术有限公司，纯度99.0％)；β-环糊精(β-cd，成都市科龙化工试剂厂)，水为超纯水，其余所用试剂均为分析纯。
实施例1本发明中nsp的制备
以dpc与β-cd的摩尔比为4:1进行制备，将β-cd缓慢加至熔化后的dpc中，搅拌，放冷，蒸馏水搅拌洗涤，抽滤，纯化，干燥，即得。
实施例2本发明中lf-nsp的制备
依据本发明实施例1制备的nsp。
以无水乙醇为分散介质，nsp与lf质量比为2:1，采用搅拌-冷冻干燥法制备甘草黄酮纳米海绵。称取0.156gnsp分散于20ml蒸馏水中，缓慢加入5ml无水乙醇分散的0.078glf，45℃恒温搅拌4.8h，搅拌速度为245r·min-1，混悬液离心(4000r·min-1，15min)，上清液置于-20℃冰箱中预冻24h后，减压冷冻(冷冻温度-20℃，压力100pa。)干燥48h，即得。
实施例3本发明甘草黄酮纳米海绵的工艺筛选实验
1考察指标
1.1载药量的测定
精密称取适量甘草黄酮纳米海绵于10ml容量瓶中，适量70％乙醇溶解，再加入0.2ml氨水，定容至刻度，超声10min，4000r·min-1离心15min，取上清液0.8ml至25ml量瓶中，按2.1.3项下方法显色测定吸光度a，计算载药量，公式如下：
载药量(％)＝m药/m总×100％(其中m药为lf的实际测得质量，m总为lf-nsp的总质量)
1.2粒径测定
室温下，取适量甘草黄酮纳米海绵溶于水中，经适当振摇使溶解，采用激光粒度分析仪测定其分散的平均粒径。
2critic法确定权重系数
药物制剂体系的稳定性、体内的吸收过程以及临床应用剂量直接影响着其临床疗效，由于甘草黄酮纳米海绵制备过程中载药量以及粒径这两个指标对其总体临床疗效贡献存在差异，直接采用主观赋值法确定权重系数有失偏颇。critic法是一种较为客观的权重赋值法，该法能客观反映各指标权重，相较于主观的权重赋值法更加科学合理，故本实验采用critic法对甘草黄酮纳米海绵制备过程中的考察指标进行权重赋值，以期更客观反映实验情况。
制备10批样品，分别测定载药量和平均粒径，结合数据按照critic法确定上述两个指标的权重系数，首先按照“归一化值＝(实测值-最小值)/
(最大值-最小值)×100”对数据归一化处理，得2×10矩阵，继而由软件spss17.0得到相关系数矩阵m，经对比强度σi及冲突性δi最终得到载药量和粒径的权重系数分别为0.54、0.46。公式如下：
注：σi为标准化之后各列指标的标准差
3甘草黄酮纳米海绵制备工艺的筛选
3.1实验设计
在前期预试验中，集中考察了甘草黄酮和纳米海绵的质量比、搅拌温度、搅拌时间以及搅拌速度四个因素，发现当质量比为1∶4时，即有纳米海绵的形成，当比例达到1:2时，载药量和粒径要求均较好，继续增大甘草黄酮的用量，载药量基本趋于平稳，而粒径却显著增大，同时静置1h后发现有部分棕色沉淀产生，可能为甘草黄酮未被负载的部分，考虑到载药量和粒径的要求，故固定甘草黄酮和纳米海绵的质量比为1:2，不作后续优化。
因此，为得到最优的制备工艺，在预试验的基础上，选择搅拌温度(a)、搅拌时间(b)以及搅拌速度(c)为考察因素，以box-behnken响应面法优化其工艺参数，因素水平见表1，试验设计及结果见表2。以载药量(y1，最大值为优)和粒径(y2，最小值为优)为指标，分别设置权重系数为0.54,0.46，总分为100分，以综合评分值(y)对各项结果进行加权。加权得分公式设定为：y＝(y1i/y1max)×0.54×100+(y2min/y2i)×0.46×100
表1因素水平表
表2试验设计及结果
实验结果说明，在本发明工艺条件下，制备的甘草黄酮纳米海绵的性质优良，搅拌温度为45℃，搅拌的时间为4～6h，搅拌速度为100～300r·min-1，优选200～300r·min-1，其中最佳处方为18号处方，搅拌温度45℃，搅拌时间4.8h，搅拌速度245r·min-1。
以下通过试验例具体说明本发明的有益效果。
实验例1本发明甘草黄酮纳米海绵的性质检测
取实施例2制备的甘草黄酮纳米海绵，按照如下方法检测其性质：
1甘草黄酮纳米海绵表征分析
1.1傅里叶变换红外光谱(ft-ir)
分别对甘草黄酮原料药lf(a)、甘草黄酮纳米海绵lf-nsp(b)、β-环糊精(c)及纳米海绵nsp(d)进行红外光谱分析，以kbr压片，扫描范围4000～400cm-1，并以透光率t为纵坐标，波数为横坐标绘制红外光谱图，结果见图1。与β-cd的红外光图谱相比，纳米海绵nsp在波数1780cm-1处显示较明显新峰，该峰为碳酸酯键的羰基峰，与文献报道一致，表明纳米海绵合成成功。甘草黄酮原料药在波数2854cm-1处的特征吸收峰为饱和碳链甲基、亚甲基c-h的伸缩振动，波数1608cm-1处为c＝c经偏移后的特征吸收峰，而醚键的吸收峰出现于波数1274cmcm-1处。在甘草黄酮纳米海绵的红外谱图中，波数2854cm-1处的吸收峰消失，1608cm-1以及1274cm-1处的吸收峰分别迁移至1621cm-1和1298cm-1，且吸收峰强度变强。由此推断，药物与纳米海绵分子之间可能发生了相互作用，形成氢键。物质特征峰的变化，验证了甘草黄酮纳米海绵的形成。
1.2差示扫描量热法(dsc)
采用dsc对β-环糊精(a)、纳米海绵nsp(b)、甘草黄酮原料药lf(c)、甘草黄酮纳米海绵lf-nsp(d)以及物理混合物(e)进行分析，以空白坩埚为参比，升温速率10℃·min-1，升温范围为50～600℃，样品量10mg。结果见图2。与β-cd的图谱相比，纳米海绵在300.6℃处的吸收峰消失，而于370.7℃处出现新的放热峰，表明纳米海绵合成成功；甘草黄酮原料药从472.8℃开始出现一较宽的放热峰，物理混合物仅是辅料和原料药特征峰的简单叠加，但原料药特征峰受到纳米海绵的影响而有所变化。甘草黄酮纳米海绵在原料药中的特征峰消失，而在323.2℃和414.7℃处出现新的较强放热峰，提示甘草黄酮纳米海绵的形成。
1.3lf-nsp扫描电镜(sem)分析
分别取lf和lf-nsp适量，进行sem分析，由图可知，在2000倍条件下进行扫描，nsp呈碎棉絮状，继续扩大至50000倍下扫描，见图3，可见其为球形颗粒状。
1.4x射线衍射(xrd)分析
取物理混合物(a)、lf-nsp(b)、lf(c)、nsp(d)以及β-cd(e)进行xrd分析，检测条件为cu靶，k线，管压40kv，扫描步长0.02度，扫描范围5～90度，扫描速度2度/min，结果见图4。由图可知，lf原料药并未检测到晶体衍射峰，证明其可能以无定型或者分子状态存在；nsp在9.02，10.79,12.60度处出现其特征衍射峰，而物理混合物中仅是二者峰强度的叠加，但可能受到相互的影响，其峰强度有所变化；在lf-nsp中，nsp和lf的衍射峰微乎其微，nsp的峰强度有所降低，可能是由于粒径减小或者二者峰强相互干扰所致。以上提示lf在nsp中以无定型状态存在。
2体外释放度的测定
按《中国药典》2015年版(第四部)通则0931项下第二法(桨法)测定lf以及lf-nsp的体外释放度。以900ml脱气的蒸馏水为介质，控制温度(37±0.5)℃，转速100r·min-1，分别于15、30、45、60、90、120、180、240、360min取样4ml，补足等温等体积介质，0.88μm微孔滤膜过滤，按“2.1.3”项下方法测定，计算累积释放度，结果见图5。由图可知，甘草黄酮纳米海绵在240min时的溶出率达81.8％，而原料药不超过32％，表明纳米海绵能提高甘草黄酮的溶出度，而且提高幅度非常大。
增溶效果分析
精密称取过量且质量恒定的甘草黄酮原料药lf和甘草黄酮纳米海绵lf-nsp，分别置于试管中，加入适量蒸馏水制成过饱和溶液，超声5h，离心(4000r·min-1，15min)，取上清液以0.8μm微孔滤膜过滤，滤液经适度稀释，10％koh溶液显色，显色后测定其含量。结果lf在常温下的溶解度为0.204mg·ml-1，lf-nsp在水中的溶解度达到了2.422mg·ml-1，即甘草黄酮原料药经纳米海绵负载后，溶解度增大了11.9倍，表明纳米海绵可明显提高甘草黄酮在水中的溶解性。
综上，本发明提供的药物制备工艺成功制备了性能优良的lf-nsp，能显著提高lf的溶解度和溶出度，以增加药物的生物利用度，提高患者的依从性，保证临床疗效，为难溶性药物制剂的一种选择。