亚硫酸氢钠穿心莲内酯抗皮肤光老化的应用及防晒霜的制作方法

本发明涉及皮肤问题防治领域，且特别涉及一种亚硫酸氢钠穿心莲内酯抗皮肤光老化的应用及防晒霜。

背景技术

皮肤光老化区别于正常老化，是由日光辐射(其中紫外线辐射是主要因素)引起的皮肤多重损伤，其加快了皮肤的衰老进程。更值得关注的是皮肤光老化还容易发展成皮肤癌，如鳞状细胞癌等，严重威胁人类皮肤健康。

光老化的临床治疗手段以化学剥脱术、光电技术、外科手术为主。其中，传统的剥脱性激光治疗，如二氧化碳激光和饵激光，均有修复皱纹和治皮肤疗光老化的功效，但剥脱性激光治疗过程中需要剥脱整个表皮，术后需要较长的时间修复，且同时伴有红斑、水肿、感染、结痂及色素沉着等一系列副作用。非剥脱性激光治疗，如光子嫩肤技术，可通过特定的宽光谱彩光选择作用于真皮乳头层及以上皮肤层，但其治疗效果一般。剥脱性点阵激光治疗，可靶向作用于微热损伤区，皮肤恢复较快，副作用较少。强脉冲光技术是以闪光灯为广源，通过不同滤光技术取得不同光谱段的高强度脉冲光，用于光老化皮肤的治疗。

虽然目前有一些比较有效的皮肤光老化治疗手段，但需要一些专用设备才能进行治疗，很少有药物用于临床上皮肤光老化的治疗或辅佐治疗。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种亚硫酸氢钠穿心莲内酯抗皮肤光老化的应用，亚硫酸氢钠穿心莲内酯用于制备预防和治疗皮肤光老化的皮肤用品，以用于临床上皮肤光老化的治疗或辅佐治疗，且药效好。

本发明的另一目的在于提供一种防晒霜，含有抗皮肤光老化的高活性成分，扩充市场上的防晒产品种类，增强用户体验。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

本发明提出一种亚硫酸氢钠穿心莲内酯抗皮肤光老化的应用，亚硫酸氢钠穿心莲内酯用于制备预防和治疗皮肤光老化的皮肤用品。

进一步地，在本发明较佳实施例中，亚硫酸氢钠穿心莲内酯通过调节nf-kb和nrf2信号通路，达到抗炎抗氧化的作用。

进一步地，在本发明较佳实施例中，亚硫酸氢钠穿心莲内酯用于制备治疗uva+uvb辐射诱导的hacat细胞光老化的皮肤用品。

进一步地，在本发明较佳实施例中，皮肤用品为护肤品、化妆品、药品中的一种。

进一步地，在本发明较佳实施例中，亚硫酸氢钠穿心莲内酯在皮肤用品中质量百分比浓度为0.05％～5％。

进一步地，在本发明较佳实施例中，亚硫酸氢钠穿心莲内酯的制备方法包括以下步骤：

将穿心莲内酯溶于甲醇水溶液中，得穿心莲内酯溶液；将亚硫酸氢钠溶于水中，得亚硫酸氢钠溶液；

将亚硫酸氢钠溶液加入到穿心莲内酯溶液中，于40～95℃反应0.5～6小时；

在真空度>0.03mpa，温度20～85℃的条件下蒸发去除甲醇；

冷却至0～10℃，静置1～12小时，吸附过滤得滤液；

向滤液中加入酸溶液，冷却至-5℃～40℃，析出结晶；

将结晶溶于水中，调节ph为4.0～6.5，冷却至-5℃～30℃，析出亚硫酸氢钠穿心莲内酯结晶，再抽滤，将滤饼真空干燥，得白色的亚硫酸氢钠穿心莲内酯。

进一步地，在本发明较佳实施例中，配制穿心莲内酯溶液时，穿心莲内酯与甲醇水溶液的重量比为1：6～14，甲醇水溶液的质量百分比浓度为50％～100％的甲醇水溶液中。

进一步地，在本发明较佳实施例中，配制亚硫酸氢钠溶液时，亚硫酸氢钠与水的重量比为1：3.5～10。

进一步地，在本发明较佳实施例中，酸溶液的加入量为亚硫酸氢钠的0.7～1.5倍质量。

本发明提出一种防晒霜，其含有亚硫酸氢钠穿心莲内酯，亚硫酸氢钠穿心莲内酯的质量百分比浓度为1％～2％。

本发明实施例的亚硫酸氢钠穿心莲内酯抗皮肤光老化的应用及防晒霜的有益效果是：本发明实施例的亚硫酸氢钠穿心莲内酯抗皮肤光老化的应用是亚硫酸氢钠穿心莲内酯用于制备预防和治疗皮肤光老化的皮肤用品，以用于临床上皮肤光老化的治疗或辅佐治疗，且药效好；本发明实施例的防晒霜含有亚硫酸氢钠穿心莲内酯这种抗皮肤光老化的高活性成分，扩充市场上的防晒产品种类，增强用户体验。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为不同浓度的亚硫酸氢钠穿心莲内酯作用后的细胞活性结果图；

图2为不同浓度的亚硫酸氢钠穿心莲内酯对光老化细胞作用后的细胞荧光图；

图3为不同浓度的亚硫酸氢钠穿心莲内酯对光老化细胞中ros的影响结果图；

图4为不同浓度的亚硫酸氢钠穿心莲内酯对光老化细胞抗炎水平的影响结果图；

图5为亚硫酸氢钠穿心莲内酯对光老化细胞抗氧化水平的影响结果图；

图6为不同浓度的亚硫酸氢钠穿心莲内酯对光老化细胞nf-kb与nrf2信号通路的调节结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的亚硫酸氢钠穿心莲内酯抗皮肤光老化的应用及防晒霜进行具体说明。

本发明实施例提供一种亚硫酸氢钠穿心莲内酯抗皮肤光老化的应用，亚硫酸氢钠穿心莲内酯用于制备预防和治疗皮肤光老化的皮肤用品。

具体的，亚硫酸氢钠穿心莲内酯通过调节nf-kb和nrf2信号通路，达到抗炎抗氧化的作用，因此，亚硫酸氢钠穿心莲内酯对uva+uvb辐射诱导的hacat细胞光老化具有防护作用，能治疗uva+uvb辐射诱导的hacat细胞光老化，相应的，亚硫酸氢钠穿心莲内酯用于制备治疗uva+uvb辐射诱导的hacat细胞光老化的皮肤用品。

本实施例的皮肤用品是指作用于皮肤的产品，多为涂抹类产品，比如，皮肤用品为抗皮肤光老化的护肤品、抗皮肤光老化的化妆品、抗皮肤光老化的药品中的一种。在实际应用中，亚硫酸氢钠穿心莲内酯在皮肤用品中质量百分比浓度一般为0.05％～5％。

本实施例中的亚硫酸氢钠穿心莲内酯是指纯度在99.8％以上的产品，可以直接购买，也可以按照以下制备方法制备，亚硫酸氢钠穿心莲内酯的制备方法包括以下步骤：

(1)将穿心莲内酯溶于甲醇水溶液中，得穿心莲内酯溶液，配制穿心莲内酯溶液时，穿心莲内酯与甲醇水溶液的重量比为1：6～14，甲醇水溶液的质量百分比浓度为50％～100％的甲醇水溶液中；将亚硫酸氢钠溶于水中，得亚硫酸氢钠溶液，配制亚硫酸氢钠溶液时，亚硫酸氢钠与水的重量比为1：3.5～10。

(2)将亚硫酸氢钠溶液加入到穿心莲内酯溶液中，于40～95℃反应0.5～6小时；

(3)在真空度>0.03mpa，温度20～85℃的条件下蒸发去除甲醇；

(4)冷却至0～10℃，静置1～12小时，吸附过滤得滤液；

(5)向滤液中加入酸溶液，酸溶液的加入量为亚硫酸氢钠的0.7～1.5倍质量，冷却至-5℃～40℃，析出结晶；

(6)将结晶溶于水中，调节ph为4.0～6.5，冷却至-5℃～30℃，析出亚硫酸氢钠穿心莲内酯结晶，再抽滤，将滤饼真空干燥，得白色的亚硫酸氢钠穿心莲内酯。

本发明实施例还提供一种防晒霜，其含有亚硫酸氢钠穿心莲内酯，亚硫酸氢钠穿心莲内酯的质量百分比浓度为1％～2％。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供一种亚硫酸氢钠穿心莲内酯，其按照以下方法制得：

(1)将350重量份的穿心莲内酯溶于2100重量份的重量百分浓度为100％的甲醇，得穿心莲内酯溶液；将100重量份的亚硫酸氢钠溶于700重量份的水中，得亚硫酸氢钠溶液。

(2)将亚硫酸氢钠溶液加入到穿心莲内酯溶液中，于40℃～50℃反应6小时。

(3)在真空度>0.03mpa，温度85℃蒸尽甲醇。

(4)冷却至0℃，静置1小时，加1重量份的活性炭过滤。

(5)向滤液中加入相当于亚硫酸氢钠0.7倍质量倍的硫酸，冷却至-5℃，析出结晶。

(6)将析出的结晶溶于0.6倍于所述结晶的40℃的水中，加氢氧化钠，使ph为4.0，冷却至-5℃，析出亚硫酸氢钠穿心莲内酯结晶，再抽滤，将滤饼真空干燥，得白色的亚硫酸氢钠穿心莲内酯。

以下通过试验对亚硫酸氢钠穿心莲内酯的作用及性能进行测试。

一、亚硫酸氢钠穿心莲内酯的细胞毒性试验

在37℃、5％co2条件下用含10％胎牛血清的dmem高糖培养基培养永生化角质形成细胞系hacat细胞，待细胞长至约90％时，消化细胞，制备细胞悬液。调整细胞密度为3.5x10⁴个/ml，每孔加入量200μl，加入至96孔板中，隔日换液，待细胞长至约80％时，给予不同孔板中的细胞含不同浓度的亚硫酸氢钠穿心莲内酯培养基，给药剂量分别为0μm(对照组)、0.01μm、0.1μm、1μm、10μm、100μm、500μm、1000μm、2000μm，给药后培养24h。

采用mtt比色法检测细胞活力：细胞培养后取出96孔板，加入20μl的mtt溶液，再置于培养箱孵育4h。孵育结束后，吸取上清液，加入150μl的dmso溶液，低速振荡10min，用酶标仪检测其490nm处吸光度值。

图1为不同浓度的亚硫酸氢钠穿心莲内酯作用后的细胞活性结果图。由图1中可以看出，不同浓度的亚硫酸氢钠穿心莲内酯对细胞活性影响不大，由此可知，亚硫酸氢钠穿心莲内酯无明显的细胞毒性。另外，随着亚硫酸氢钠穿心莲内酯浓度的递增，细胞活性不断变化，在亚硫酸氢钠穿心莲内酯浓度为10～100μm，细胞活性相对稳定，确定亚硫酸氢钠穿心莲内酯的最佳给药剂量为10～100μm(10μm、30μm、100μm。

二、亚硫酸氢钠穿心莲内酯对光老化细胞凋亡水平的影响试验

待细胞长至约90％时，消化细胞，制备细胞悬液。调整细胞密度为3.5x10⁴个/ml，每2ml细胞悬液加入至35mm培养皿中，隔日换液，待细胞长至约80％时，给予不同培养皿中的细胞含不同浓度的亚硫酸氢钠穿心莲内酯培养基，给药剂量分别为10μm、30μm、100μm，给药24h之后，给予细胞90mj/cm²的uv辐射造模(造模时前吸出培养基、加pbs洗两次，并用700μlpbs覆盖细胞进行造模辐射)。

造模后弃pbs，加入培养基培养12h，弃原培养液，pbs洗2次，每个培养皿中加1010μlhoechst33342染液(10μlhoechst33342+1000μl培养基)，37℃培养箱中孵育35min，弃染液，加pbs洗涤两次，每个培养皿中加入1005μlpi染液(5μlpi+1000μlbuffera工作液)，室温避光孵育15min，弃染液，用pbs洗涤两次，在荧光显微镜下观察。

图2为不同浓度的亚硫酸氢钠穿心莲内酯对光老化细胞作用后的细胞荧光图。由图2可以看出，未用亚硫酸氢钠穿心莲内酯作用的光老化细胞的凋亡情况明显，用亚硫酸氢钠穿心莲内酯作用后的光老化细胞的凋亡情况明显减少，由此可知，亚硫酸氢钠穿心莲内酯对光老化细胞的凋亡具有阻抗作用。

三、亚硫酸氢钠穿心莲内酯对光老化细胞中活性氧簇ros的影响试验

按照试验(二)中的步骤进行细胞种板给药造模，造模后弃pbs，加入培养基培养1h，弃原培养液，pbs洗2次，加dcfh-da稀释液1000μl(1μldcfh-da+1500μl培养基)，37℃培养箱中避光孵育30min，弃染液，用pbs洗涤两次，荧光显微镜观察。

图3为不同浓度的亚硫酸氢钠穿心莲内酯对光老化细胞中ros的影响结果图。由图3可以看出，光老化细胞中ros含量显著升高(nc为自然细胞，mc为光老化细胞)，中、高浓度的ros通过细胞氧化应激反应诱导细胞凋亡甚至导致其坏死，经过亚硫酸氢钠穿心莲内酯处理后，光老化细胞中ros含量显著降低，其中，100μm亚硫酸氢钠穿心莲内酯对光老化细胞中ros的影响最显著。

四、亚硫酸氢钠穿心莲内酯对光老化细胞抗炎水平的影响试验

按照试验(二)中的步骤进行细胞种板给药造模，造模后弃pbs，加入培养基培养12h，取培养上清，-20℃保存备用。elisa测定il-1β、il-6、tnf-α的含量。

另外，按照试验(二)中的步骤进行细胞种板给药造模，造模后弃pbs，加入培养基培养2h，弃培养基，每个培养皿中加入1000μltrizol，用移液枪抽吸溶解细胞，留取样本-20℃保存备用。qrt-pcr检测nf-κb调控因子il-1β、il-6、tnf-α的基因表达水平。

图4为不同浓度的亚硫酸氢钠穿心莲内酯对光老化细胞抗炎水平的影响结果图。由图4可以看出，经过亚硫酸氢钠穿心莲内酯处理后，光老化细胞的il-1β、il-6、tnf-α的含量，以及il-1β、il-6、tnf-α的基因表达水平显著降低，由此可知，亚硫酸氢钠穿心莲内酯能提高光老化细胞的抗炎水平。

五、亚硫酸氢钠穿心莲内酯对光老化细胞抗氧化水平的影响试验

按照试验(二)中的步骤进行细胞种板给药造模，造模后弃pbs，加入培养基培养12h，弃培养基，每个培养皿中加入1000μltrizol，用移液枪抽吸溶解细胞，留取样本-20℃保存备用。qrt-pcr检测nrf2下游基因nqo1、gclc的基因表达水平。

图5为亚硫酸氢钠穿心莲内酯对光老化细胞抗氧化水平的影响结果图。由图5可以看出，经过100μm亚硫酸氢钠穿心莲内酯处理后，光老化细胞的nrf2下游基因nqo1、gclc的基因表达水平显著升高，由此可知，亚硫酸氢钠穿心莲内酯能提高光老化细胞的抗氧化水平。

六、亚硫酸氢钠穿心莲内酯对光老化细胞nf-kb与nrf2信号通路的调节作用试验

按照试验(二)中的步骤进行细胞种板给药造模，造模后弃pbs，加入培养基培养固定时间，弃培养基，用pbs洗2次，每孔加入100μl蛋白裂解液，用细胞刮刀刮取细胞，留取样本-20℃保存备用。westernblot检测细胞中nrf2、keap1、p65、ikbα的蛋白表达。

图6为不同浓度的亚硫酸氢钠穿心莲内酯对光老化细胞nf-kb与nrf2信号通路的调节结果图。由图6可以看出，经过亚硫酸氢钠穿心莲内酯处理后，光老化细胞中nrf2、keap1的蛋白表达水平显著升高，p65、ikbα的蛋白表达水平显著降低或呈下降趋势，由此可知，亚硫酸氢钠穿心莲内酯能调节光老化细胞nf-kb与nrf2信号通路。

综上所述，本发明实施例的亚硫酸氢钠穿心莲内酯抗皮肤光老化的应用是亚硫酸氢钠穿心莲内酯用于制备预防和治疗皮肤光老化的皮肤用品，以用于临床上皮肤光老化的治疗或辅佐治疗，且药效好；本发明实施例的防晒霜含有抗皮肤光老化的高活性成分，扩充市场上的防晒产品种类，增强用户体验。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。