靶向至细胞内质网纳米载药系统的构建与应用的制作方法

本发明属于医药领域，涉及一种新型的可靶向至细胞内质网的新型纳米载药系统，以及该载药系统在制备以内质网为靶标的抗病毒、抗肿瘤等药物中的应用。
背景技术：
：药物需要到达作用靶点才能发挥药效，药物的靶点一般为位于细胞内的蛋白质、核酸、酶和受体等功能性生物分子。现代给药系统要求药物能被转运至靶组织、靶细胞，甚至是特定的细胞器。纳米载体具有保护药物，达到缓释和毒副作用小等优点。目前组织及细胞靶向给药递释系统的研究已经较为成熟，三级靶向，即细胞器靶向是目前给药系统中研究的热点和难点。三级靶向包括细胞质靶向，细胞器靶向，如线粒体靶向，内质网靶向，溶酶体靶向等，细胞核靶向等。内质网膜(endoplasmicreticulum,er)是由内膜构成的封闭的网状管道系统，是细胞内蛋白质合成，脂质合成，物质运输，糖类代谢，解毒的主要场所其主要功能是合成蛋白质和脂类。内质网内含有多种酶，其标志酶为葡萄糖-6-磷酸酶，参与糖原异代谢，内质网腔内的水解酶用于各种药物代谢及解毒。肝脏、肠道细胞内质网上的细胞色素p450是人体内代谢药物的主要酶，能催化多种内、外源物质的(包括大多数临床药物)代谢。机体分泌的蛋白和膜蛋白在翻译过程中或翻译后被转运到内质网腔内进行修饰，折叠，正确装配。当内质网中未折叠或错误折叠的蛋白增多时，应激信号能通过内质网膜传递到细胞核中，继而引起系列特定的靶基因转录上调和蛋白质翻译水平下调，以使细胞能继续存活，这种反应就是未折叠蛋白反应(upr)，upr既有保护细胞的作用，又具有细胞毒性作用，引起细胞凋亡，从而导致一系列疾病，如阿尔茨海默症、纤维囊泡症的发生，糖尿病等。据此，内质网可作为肿瘤治疗的新靶点，根据其诱导细胞凋亡的通路可采用一些细胞毒性药物诱发内质网应激，加速癌细胞的凋亡来治疗癌。也可以应用一些药物或者细胞因子来阻断疾病诱导的异常的内质网应激反应，减少甚至逆转细胞的凋亡。目前对er的靶向给药并未受到足够的重视。对其研究的相关文献相对较少。costin等将内质网n-糖基化抑制剂n-丁基脱氧野尻霉素包载于ph敏感脂质体(由dope和胆甾醇半琥珀酸酯组成)内，成功抑制了小鼠黑色素瘤细胞酪氨酸活性，并明显减小了给药剂量(gertrude-e.costin,mihaelatrif,et.alph-sensitiveliposomesareefficientcarriersforendoplasmicreticulum-targeteddrugsinmousemelanomacells[j],bbrc293(2002):918–923)。pardaxin(pa)是从豹鳎中分离到一种含有33个氨基酸残基多肽(序列为：h-gffalipkiissplfktllsavgsalsssggqe-oh)，是最早从鱼类分离得到的两亲性阳离子α螺旋结构具有穿膜作用的多肽，是一种作用较强的抗菌活性肽。此外pardaxin还具有抑制增殖并诱导人癌细胞系凋亡的作用。它的33个氨基酸的结构包含许多阳离子型和两亲性氨基酸，使其更容易与阴离子膜相互作用，由于其特殊的构型，在浓度低于10-7m时pardaxin可在细胞脂质双层膜上形成单通道的孔径，在浓度为10-7-10-4m时则会引起细胞溶解(doronrapaport,yechielshai.interactionoffluorescentlylabledpardaxinanditsanalogueswithlipidbilayer.[j]thejournalofbiologicalchemistry266(1991):23769-23775；peteri.lelkesandphiliplazarovici.pardaxininducesaggregationbutnotfusionofphosphatidylserinevesicles[j].febsletters,230(1988):131-136；bhuniaa,domadiapn,torresj,et.al.nmrstructureofpardaxin,apore-formingantimicrobialpeptide,inlipopolysaccharidemicelles:mechanismofoutermembranepermeabilization[j].biolchem,285(2010):3883-3895)，低剂量时，pardaxin入胞后可避开线粒体，高尔基体及溶酶体，定向至内质网。chen-hungting对pardaxin入胞后的定位进行了荧光示踪研究，发现pardaxin入胞后累积于内质网上(chen-hungting,han-ninghuang,etalthemechanismsbywhichpardaxin,anaturalcationicantimicrobialpeptide,targetstheendoplasmicreticulumandinducesc-fos[j].biomaterials,35(2014):3627-3640)。技术实现要素：本发明的目的是提供一种靶向至细胞内质网纳米载药系统的构建，本发明利用水溶性多肽pardaxin具有内质网特异性趋向性特性，将其修饰在纳米载体表面，如此促使纳米载体细胞内在化后，具有内质网特异性靶向能力，实现纳米载体以及载体内药物的内质网部位特异性累积。通过以下方案实现：将水溶性多肽pardaxin以化学键合或物理吸附的方式修饰在纳米载体表面，所述pardaxin为含有33个氨基酸残基多肽，其氨基酸序列是：h-gffalipkiissplfktllsavgsalsssggqe-oh。。具体内容如下：1.pardaxin修饰纳米载体通过以下化学和/或物理方法实现：(1)利用pardaxin分子中的氨基或者羧基，直接与纳米载体发生化学键合完成修饰。(2)或利用pardaxin分子中的氨基或者羧基先与一种化合物(其连接作用)发生化学键合，再将起连接作用的化合物结合在纳米载体上完成修饰。这种起连接作用化合物如具有活泼反应基团的聚乙二醇、聚乙烯亚胺等。(3)或通过电荷吸附、氢键作用等物理相互作用实现pardaxin多肽在纳米粒子表面的修饰。2.构建pardaxin修饰的、具有内质网靶向的纳米脂质体载体：采用薄膜分散法，注入法等将制备脂质体材料(磷脂、胆固醇，dspe-peg-pardaxin等；如为脂溶性药物，此时加入)，按照摩尔比例(磷脂:胆固醇摩尔比为10～0.5:1，dspe-peg-pardaxin为总脂质重量的0.01％-10％)混合，加入有机溶剂溶解(如氯仿、二氯甲烷、乙醇等)，通过1)旋转蒸发形成薄膜，再加水性介质(含盐和或/者水溶性药物的水溶液)水化形成脂质体；或者2)直接注入水性介质中形成脂质体。脂质体粒径范围为1-1000纳米。本发明的另一个目的是提供所述靶向至细胞内质网纳米载药系统在制备以内质网为靶标的药物中的应用。所载药物可以为不同理化性质药物如脂溶性或水溶性抗肿瘤药物、不同治疗领域药物如抗肿瘤、抗炎药物或需要在内质网上的酶进一步活化的前体药物及内质网相关疾病的治疗药物，以及可以针对内质网应激的药物或因子。pardaxin裸露于纳米载体外，充当靶头，可特异性将入胞后的载药纳米脂质体载体靶向至细胞内质网，并在内质网释放药物，或特异性导致引起内质网行为应激反应(如激发或抑制内质网应激等)。所涉及到的疾病包括肿瘤，如肝癌；感染性炎症，以及与内质网应激有关的疾病，如阿尔兹海默症，糖尿病等。在此应用过程中，载药纳米粒的制备方式主要根据药物的理化性质(如亲脂亲水性、电性等)与纳米载体的不同而不同，对于脂溶性药物可采取相似相溶方法完成包裹，可将药物与脂质混合溶解成膜后完成装载。对于水溶性药物可利用其酸碱性或者带电性完成纳米药物的装载。水溶性药如环磷酰胺，阿霉素，脂溶性药如醋酸地塞米松等。本发明是将水溶性多肽pardaxin结合到纳米载体表面。本发明典型的是将pardaxin修饰在脂质体表面。利用dspe-peg-nh2的氨基与pardaxin的羧基进行脱水缩合反应形成较稳定的酰胺键。经修饰后形成了dspe-peg-pardaxin，该修饰物为两亲性，dspe为疏水端，peg-pardaxin为亲水端。疏水端可作为“锚”，铆钉在脂质类载体如脂质体的双分子层膜上，亲水端暴露在外，作为靶向内质网的“靶头”。本发明所构建的内质网靶向脂质体可以装载水溶性和脂溶性药物，并将药物传递到内质网部位，增强药物治疗功效，减少毒副作用。本发明所述纳米载体不仅仅局限于脂质体，也可以是固体脂质纳米粒，纳米乳，聚合物胶束，及无机纳米材料等。本发明所构建的新型内质网靶向纳米载体，可以显著提高以内质网为靶标的药物在其作用靶部位的浓度，为这些药物的疗效发挥提供了一条新的途径。附图说明图1是dspe-peg，pardaxins，dspe-peg-pardaxin的核磁共振图氢谱。图2是薄膜分散法制备时磷脂与药物的比对脂质体包封率的影响。图3是用醋酸钙梯度法梯度法制备时磷脂与药物的比对脂质体包封率的影响。图4是内质网靶向环磷酰胺脂质体内质网共定位图。图5是内质网靶向环磷酰胺脂质体溶酶体逃逸图。图6是内质网靶向环磷酰胺脂质体对skov-3，hepg-2的细胞毒性试验。具体实施方式本发明结合附图和实施例作进一步的说明。实施例1dspe-peg-pardaxin的合成：精密称取pardaxin，溶解在3ml-10ml无水dmf溶剂中，在避光和冰浴下加入(boc)2o试剂保护pardaxin多肽上的4个游离氨基，(boc)2o:pardaxin摩尔比为5.2:1，避光氮气密封进行反应12h。经(boc)2o试剂保护后，加入edc和nhs活化pardaxin多肽上羧基，edc:pardaxin摩尔比为10:1，nhs:pardaxin摩尔比为5:1常温下活化反应2个小时。活化结束后，加入dspe-peg-nh2，磁力搅拌下反应24小时，dspe-peg-nh2:pardaxin摩尔比为1:1。.反应结束后，用1ml12mhci搅拌反应2个小时脱去boc保护，后用3mnaoh(1.2g溶于10ml水)调回中性，透析，冻干即得dspe-peg-pardaxin,结构式如下：dspe-peg-pardaxin结构确证：采用核磁共振(nuclearmagneticresonance，nmr)，对dspe-peg-pardaxin进行1hnmr和红外光谱扫描结构确证(图1)。dspe-peg-pardaxin核磁共振氢谱图中，在化学位移6.81-8.23ppm处，出现了多个尖锐的信号峰，该峰归属于为酰胺键的特征峰；在化学位移4.46-4.65ppm处，出现了一个明显的双峰信号，该峰归属于pardaxin多肽中与酰胺键相邻的次甲基信号峰；此外，pardaxin多肽在化学位移12.15-12.76ppm的两个羧基单峰信号已经消失，说明已经成功合成了dspe-peg-pardaxin。图1是dspe-peg，pardaxins，dspe-peg-pardaxin的核磁共振图氢谱。如图所示：dspe-peg-pardaxin核磁共振氢谱图中，在化学位移6.81-8.23ppm处，出现了多个尖锐的信号峰，该峰归属于为酰胺键的特征峰；在化学位移4.46-4.65ppm处，出现了一个明显的双峰信号，该峰归属于，pardaxin多肽中与酰胺键相邻的次甲基信号峰；此外，pardaxin多肽在化学位移12.15-12.76ppm的两个羧基单峰信号已经消失，说明已经成功合成了dspe-peg-pardaxin。实施例2thiocticacid(ta)-peg-pardaxin的合成：通过nh2-peg-nh2和硫辛酸(thiocticacid,ta)之间的脱水反应合成nh2-peg-ta。首先，将ta，dcc，nhs(摩尔比：1:5:10)溶解在dmf中并在60℃下搅拌2小时以活化ta上的羧基。然后，加入一定量的nh2-peg-nh2(nh2-peg-nh2:ta＝1:2，mol/mol)并继续搅拌24小时。将粗产物用蒸馏水透析48小时，然后冻干，得到nh2-peg-ta。在合成pardaxin-peg-ta之前，使用上述方法，pardaxin肽上的氨基也被(boc)2o保护。之后，使用edc和nhs(pardaxin:edc:nhs＝1:5:10，mol/mol)来活化fal上的羧基。然后，加入nh2-peg-ta(pardaxin:nh2-peg-ta＝1:1，mol/mol)并继续搅拌24小时。在反应结束时，使用hcl除去保护基团，并通过naoh调节ph值。在进一步透析和冻干后，收集pardaxin-peg-ta并在使用前于4℃储存。实施例3pcl-peg-pardaxin的合成：在避光和冰浴下加入(boc)2o试剂保护pardaxin上游离氨基，(boc)2o:pardaxin摩尔比为5.2:1，避光氮气密封进行反应12h。经(boc)2o试剂保护后，加入edc和nhs活化pardaxin多肽上羧基，edc:pardaxin摩尔比为10:1，nhs:pardaxin摩尔比为5:1常温下活化反应2个小时。活化结束后，加入具有氨基端的聚乙二醇-聚己内酯(pcl-peg-nh2)，磁力搅拌下反应24小时，pcl-peg-nh2:pardaxin摩尔比为1:1。反应结束后，用1ml12mhci搅拌反应2个小时脱去boc保护，后用3mnaoh(1.2g溶于10ml水)调回中性，透析，冻干即得pcl-peg-pardaxin。实施例4内质网靶向环磷酰胺脂质体的组成：考察本发明制备的内质网靶向脂质体的内质网靶向效果及药效结果，本发明以实例4的环磷酰胺内质网靶向脂质体为例，进行了研究。环磷酰胺是目前临床上最常用的烷化剂类抗肿瘤药，进入体内后，在肝微粒体酶催化下分解释出烷化作用很强的氯乙基磷酰胺或称磷酰胺氮芥，而对肿瘤细胞产生细胞毒作用，此外本品还具有显著免疫抑制作用。临床用于恶性淋巴瘤，多发性骨髓瘤，白血病、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、结肠癌、支气管癌、肺癌等，有一定疗效。也可用于类风湿关节炎、儿童肾病综合征以及自身免疫疾病的治疗。前体药物环磷酰胺在体外无抗肿瘤活性，进入体内后先被肝细胞内质网上的微粒体功能氧化酶转化成醛磷酰胺方能发挥药效。构建内质网靶向的环磷酰胺可有效提高环磷酰胺的活化效率，降低给药剂量，减少毒副作用。环磷酰胺为水溶性药物，且ph值为5.6-6.5之间，其水溶液显弱酸性，因此本发明首次采用醋酸钙梯度法对内质网靶向环磷酰胺脂质体给药系统进行了构建，并进行了处方考察，细胞摄取，细胞毒等研究。1、内质网靶向脂质体的理化性质表征首先对环磷酰胺脂质体的处方进行了研究，发现最佳制备方式为醋酸钙梯度法，磷脂为氢化大豆磷脂，采用高效液相法(hplc)测定内质网靶向脂质体中环磷酰胺的包封率，结果为40％以上(图2和3)。采用动态光散射法(dynamiclightscattering，dls)对其粒径和电位进行测定。结果见表1。表1为内质网靶向环磷酰胺脂质体理化性质，采用透射电子显微镜(transmissionelectronmicroscope，tem)，对内质网靶向脂质体的表面形态进行观察。从表1中可以看到，内质网靶向脂质体的粒径分布较均一，脂质体包封率和载药量均在可接受范围之内。脂质体的粒径小于200nm且较均一。表1内质网靶向环磷酰胺脂质体理化性质载药量(％)包封率(％)粒径pdi1.89±0.0748.99±2.405184±10.750.206±0.045图3是用醋酸钙梯度法梯度法制备时磷脂与药物的比对脂质体包封率的影响。在相同处方下hspc效果优于s100。且采用ph梯度法制备得到的脂质体包封率比薄膜分散法高。本发明优选醋酸钙梯度法来制备环磷酰胺脂质体。2、内质网靶向性实验验证(激光共聚焦)将人源性卵巢癌skov-3，人源性肝癌hepg-2，鼠源性结肠癌ct-26细胞按5×104个/孔接种于24孔板每孔的10mm2的玻片上。待24h贴壁后，每孔分别加入含脂质体500μg/ml的被fitc荧光标记的空白内质网靶向脂质体和空白非靶向脂质体。孵育12h后吸掉孔内的培养基，用pbs洗涤每孔3次。用hochest33342染料对细胞进行核染，每孔加入浓度为5ug/ml的核染料100ul，37℃避光孵育30min后，吸掉染液，用pbs洗涤三遍；加入浓度为5ug/ml的内质网染料er-tracker100ul避光孵育30min，对细胞内质网进行标记，吸去染液并用pbs洗涤2-3遍，每孔加入4％的多聚甲醛溶液固定细胞，20分钟后取出玻片进行封片，置于激光共聚焦显微镜下观察。结果见图4，靶向组内质网荧光信号与脂质体荧光信号重合性较好，非靶向组与内质网重合度较低。表明pardaxins的内质网靶向作用效果良好(红色荧光代表内质网，绿色荧光代表脂质体。)3、溶酶体逃逸实验(激光共聚焦)同法将人源性卵巢癌skov-3，人源性肝癌hepg-2，鼠源性结肠癌ct-26细胞按5×104个/孔接种于玻璃底培养皿中。待24h贴壁后，每皿分别加入含脂质体500μg/ml的被fitc荧光标记的空白内质网靶向脂质体和空白非靶向脂质体。孵育12h后吸掉皿内的培养基，用pbs洗涤每孔3次。用hochest33342染料对细胞进行核染，每孔加入浓度为5ug/ml的核染料100ul，37℃避光孵育30min后，吸掉染液，用pbs洗涤三遍；加入浓度为5ug/ml的溶酶体lys-tracker染料100ul避光孵育30min，对细胞溶酶体进行标记，吸去染液并用pbs洗涤2-3遍，每孔加入4％的多聚甲醛溶液固定细胞，20分钟后取出玻片进行封片，置于激光共聚焦显微镜下观察。结果见图5，靶向组溶酶体荧光信号与脂质体荧光信号重合度较低，非靶向组与内质网重合度较高。表明pardaxin具有帮助从溶酶体逃逸的作用。4、细胞毒性实验将人源性卵巢癌skov-3，人源性肝癌hepg-2，鼠源性结肠癌ct-26细胞按5×104个，200μl/孔的量嫁接在96孔板上。待24h细胞贴壁后，把空白非靶向脂质体，载药脂质体，空白靶向脂质体和载药的内质网靶向脂质体，按照载体的系列浓度(25ug/ml50ug/ml,100ug/ml,250ug/ml)加入到肿瘤细胞中。孵育72h。再每孔加入20μl的mtt水溶液(5mg/ml)，继续孵育4h后，弃去培养液，每孔加入100μl的dmso，摇床上振荡20分钟后，酶标仪在570nm处测定吸光值。空白脂质体组及空白靶向脂质体组作为对照组，游离的环磷酰胺组用作阳性对照。结果见图6，游离的环磷酰胺因其水溶性且为前药故而体外细胞毒性较弱，普通的环磷酰胺脂质体增大了环磷酰胺的入胞率，提高了体系内活性环磷酰胺的量，其体外细胞毒性比游离明显增大药物大，说明脂质体制剂可以改善细胞对药物的摄取，增强药物疗效。用dspe-peg-pardaxin修饰脂质体后可以进一步增大环磷酰胺对细胞的毒性，且随着dspe-peg-pardaxin比例的增大对细胞毒性作用没有显著的提高，表明可能dspe-peg-pardaxin与内质网的识别具有饱和性两个不同细胞系中药物对hepg-2的细胞毒性比skov-3大，这可能因为肝癌细胞内质网上有较多活化环磷酰胺的细胞色素酶，进一步说明了在内质网靶向作用下环磷酰胺活化程度增大，细胞毒性作用增强。实施例5内质网靶向阿霉素脂质体的组成：处方量的hspc、cholesterol、dspe-peg2000和dspe-peg-par，置于茄形瓶中，加入有机溶剂(氯仿)中溶解，55℃水浴中真空减压旋转蒸发过夜，瓶壁形成薄膜。向茄形瓶中加入ph＝5.4的硫酸铵溶液，60℃水浴水合1h，薄膜脱落溶解并形成多层脂质体溶液。使用探头超声将上述溶液超声至所需粒径。将所得的脂质体溶液过sephadexg50柱，用pbs(ph＝7.4)洗脱，除去脂质体外相的硫酸铵溶液。内质网靶向脂质体中加入2mg/ml的阿霉素溶液，使药脂质量比为1:20，50℃水浴中搅拌孵育30min。再经过sephadexg50柱，除去游离的盐酸阿霉素，最终收集为载阿霉素的内质网靶向脂质体。阿霉素是一种抗肿瘤抗生素，可抑制rna和dna的合成，对rna的抑制作用最强，抗瘤谱较广，对多种肿瘤均有作用，属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。主要适用于急性白血病，对急性淋巴细胞白血病及粒细胞白血病均有效。本发明在阿霉素脂质体的经典处方加入pardaxin，pardaxin可帮助阿霉素脂质体入胞并靶向至内质网膜上，阿霉素脂质体可绕过溶酶体从而保护了药物。本发明可降低阿霉素的给药剂量，降低药物毒副作用。实施例6内质网靶向醋酸地塞米松脂质体的组成：处方量的dex-ac，hspc、cholesterol、dspe-peg2000和dspe-peg-par，置于茄形瓶中，加入有机溶剂(氯仿)中溶解，55℃水浴中真空减压旋转蒸发过夜，瓶壁形成薄膜。向茄形瓶中加入ph＝7.4的pbs，60℃水浴水合1h，薄膜脱落溶解并形成多层脂质体溶液。使用探头超声将上述溶液超声至所需粒径。将所得的脂质体溶液过sephadexg50柱，用pbs(ph＝7.4)洗脱，除去脂质体内游离的醋酸地塞米松药物。收集洗脱下来的带乳光的脂质体，即为载有醋酸地塞米松的内质网靶向脂质体。醋酸地塞米松是一种肾上腺皮质激素药。具有抗炎、抗内毒素、抑制免疫、抗休克及增强应激反应等药理作用，广泛应用于各科治疗多种疾病，如自身免疫性疾病，过敏，炎症，哮喘及皮肤科、眼科疾病。醋酸地塞米松不良反应较多，多发生在应用药理剂量时，且与疗程、剂量、用药种类、用法及给药途径等有密切关系。常见不良反应有以下几类:医源性库欣综合征面容和体态，消化道溃疡，精神不正常，糖皮质激素停药综合征，糖尿及类柯兴综合症等。醋酸地塞米松给药后在肝药酶的作用下代谢成地塞米松，是肝药酶诱导剂，长期使用会引起肝药酶活性增强，导致细胞色素p450含量的增加，促进肝脏内质网增生和微粒体膜结合蛋白合成。在乙醇或三氯甲烷中可溶解，因此可采用薄膜分散法制备醋酸地塞米松脂质体。利用pardaxin靶头将醋酸地塞米松制备成具有内质网靶向的脂质体。该发明的三大优势：一是可以提高药物在靶器官的浓度，降低药物在其他器官的分布，二是直接将药物靶向至内质网可利用内质网上的酶提高机体对醋酸地塞米松的活化效率，三是赋予药物三级靶向之后，能较好的控制药物给药剂量，对其发挥肝药酶诱导剂的作用有所控制。醋酸地塞米松的不良反应较多，将其制备成具有内质网靶向的脂质体制剂可以有效地降低给药剂量，减少不良反应，控制其对肝药酶的诱导作用。实施例7内质网靶向载药血红蛋白脂质体的组成：处方量的e80、cholesterol、dspe-peg2000和dspe-peg-par，置于茄形瓶中，加入有机溶剂(氯仿)中溶解，55℃水浴中真空减压旋转蒸发过夜，瓶壁形成薄膜。向茄形瓶中加入含有hb处方量的pbs，60℃水浴水合1h，薄膜脱落溶解并形成多层脂质体溶液。使用探头超声将上述溶液超声至所需粒径。将所得的脂质体溶液过sephadexg50柱，用pbs(ph＝7.4)洗脱，除去脂质体内游离的hb。收集洗脱下来的带乳光的脂质体，即为载有hb的内质网靶向脂质体。该脂质体可结合氧分子，并可将氧分子直接递送至细胞内质网部位，提高该部位氧含量，进而有利于后续的针对内质网部位的氧依赖的治疗。实施例8内质网靶向载紫杉醇固体脂质纳米粒的组成：紫杉醇5mg单硬脂酸甘油酯100mgdspe-peg-pardaxin2mg处方量的紫杉醇、单硬脂酸甘油酯和dspe-peg-pardaxin，加入无水乙醇中溶解，注入到pbs的缓冲溶液中，再通过超声或均质机获得所需粒径。将所得的纳米粒溶液过sephadexg50柱，用pbs(ph＝7.4)洗脱纯化，即为载有紫杉醇的内质网靶向固体脂质纳米粒。实施例9内质网靶向载多西紫杉醇纳米胶束的组成：多西紫杉醇5mg聚乙二醇-聚己内酯(peg-pcl)100mgpcl-peg-pardaxin10mg处方量的多西紫杉醇、聚乙二醇-聚己内酯和pcl-peg-pardaxin，加入无水乙醇中溶解，注入到pbs的缓冲溶液中，再通过超声或均质机获得所需粒径。将所得的纳米粒溶液过sephadexg50柱，用pbs(ph＝7.4)洗脱纯化，即为载有多西紫杉醇的内质网靶向纳米胶束。实施例10靶向内质网的金纳米粒的合成：取实施例2中合成的2mgpardaxin-peg-ta，室温下于水性介质中与10mg中空金纳米材料(hauns)(大小40nm，于800nm处有特异型吸收峰)，共孵育24小时，离心纯化得具有内质网靶向功能得中空金纳米粒。该纳米粒进入细胞后在内质网累积，进一步借助外界的刺激(近红外光)，可实现针对内质网的特异性行为(光热刺激，增强内质网应激水平)。序列表<110>浙江大学<120>靶向至细胞内质网纳米载药系统的构建与应用<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>33<212>prt<213>pardaxin<400>1glyphephealaleuileprolysileileserserproleuphelys151015thrleuleuseralavalglyseralaleuserserserglyglygln202530glu当前第1页12