一种含有SUMO抑制剂的组合物及应用的制作方法

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种含有sumo抑制剂的组合物及应用。

背景技术：

肝脏疾病尤其是病毒性肝炎、脂肪肝病、肝纤维化和肝癌等，在全球范围的发病率居高不下。如非酒精性脂肪肝在欧美普通成年人中的发病率为20～33％，肥胖人群中发病率达60～90％；在中国普通成年人患病率约为15％(fanjg,farrellgc.epidemiologyofnon-alcoholicfattyliverdiseaseinchina.journalofhepatology,2009,50(1):204-10.)。肝纤维化(fibrosis)是一种病理状态，是指肝脏纤维结缔组织的过渡沉积。肝纤维化是慢性病毒性肝炎、代谢紊乱和慢性酒精性/非酒精性脂肪肝等慢性肝脏疾病进一步向肝硬化发展的中间环节，肝纤维化是慢性肝病的共同重要特征，且25～40％的慢性肝病患者最终发展为肝硬化甚至是肝癌。近几年的研究表明，肝纤维化是一个可以逆转的病变，而肝硬化是不可逆性病变。因此，抑制、阻止并逆转肝纤维化是治疗各种慢性肝病的中心环节。肝星状细胞(hepaticstellatecells，hscs)是介导肝纤维化发生发展的最主要细胞。正常肝脏中，hscs处于静息态；当受到病理因素刺激时，hscs活化为具有增殖能力的成纤维细胞表型，该表型的hscs细胞可以分泌大量的纤维化因子和胶原纤维，最终引起肝纤维化和肝硬化的发生发展。因此，hscs是肝纤维化发生发展的决定因素，抑制hscs活化是治疗和逆转肝纤维化的重要策略。

抗肝纤维化药物的研发是当前肝药的研发热点，同时也取得了一定的研究进展。当前申报的防治肝纤维化相关的治疗药物主要有以下几类：1)中草药及其提取物，如姜黄、白藜芦醇、水飞蓟宾、别隐品碱及其盐(授权公告号cn10132721b)；2)化学药物及其制剂，如吡非尼酮和肌酐组合物(授权公告号cn103550242b)、闭花木酮cleistanone衍生物(授权公开号cn104095857b)；3)生物制剂，包括重组蛋白和基因药物等，前者包括tgfβ1-抑制肽(授权公告号cn1203091c)、il-4(授权公告号cn101318013b)、单克隆抗体hab18gc2及其重链和轻链可变去基因和多肽(授权公告号cn100586960c)；基因药物包括肝细胞核因子1α基因(授权公告号cn102552935b)、表达肝细胞生成素的基因药物(申请号200610145523.0)、人肝细胞生长因子基因(授权公告号cn1142272c)等。尽管治疗的药物很多，但是目前尚未发现对肝纤维化的特效药物。因此，寻找确切有效的抗肝纤维化药物是今后努力发展的方向。

法尼醇x受体(farnesoidxreceptor，fxr)又称nr1h4(nuclearreceptorsubfamily1，grouph，member4)，是核受体超家族的一员。自1995年被克隆以来，该受体越来越多的功能被认识：fxr不仅在胆汁酸、脂质和糖代谢等生理过程中发挥重要作用，同时对多种病理进程具有调控作用：fxr通过fxr-fgf15/19信号通路介导了胆汁酸的促肝再生作用；fxr通过fxr/nf-κb负反馈环发挥抗炎作用(wangyd,chenwd,wangm,etal.farnesoidxreceptorantagonizesnuclearfactorkappabinhepaticinflammatoryresponse.hepatology,2008,48(5):1632-43.)；fxr通过阻断creb-crtc2复合体形成并抑制下游自噬相关基因表达进而发挥抗自噬作用(seoks,fut,choise,etal.transcriptionalregulationofautophagybyanfxr-crebaxis.nature2014；516:108-u274.)；另外fxr与肝脏肿瘤的形成密切相关：fxr^-/-小鼠正常饲养至15个月时全部自发性发生肝脏肿瘤，而同龄野生型小鼠未见同样变化(yangf,huangx,yit,etal.spontaneousdevelopmentoflivertumorsintheabsenceofthebileacidreceptorfarnesoidxreceptor.cancerres2007；67:863-867.)。上述研究表明，fxr与肝脏疾病的发生发展密切相关。fxr激动剂是保肝抗纤维化药物的主要研究策略，有大量相关的专利申报(wangh,heq,wangg,etal.fxrmodulatorsforenterohepaticandmetabolicdiseases.expertopintherpat.2018nov；28(11):765-782)，如cn201210482982.3(申请号)提供了细格菌素类化合物及其药学上可接受的盐在制备治疗fxr介导疾病药物中的应用，cn201180067346.8和cn201080043283.8(申请号)公开了fxr活性调节剂在药物组合物中的应用，均已被授权。另外，奥贝胆酸(obeticholicacid,oca)作为一种强fxr激动剂，其抗nash药效正在进行临床iii期研究，作为抗原发性胆汁性肝硬化(pbc)药物已于2016年5月被美国fda批准上市(markhama,keamsj.obeticholicacid:firstglobalapproval.drugs.2016aug；76(12):1221-6.)，成为以fxr为靶点成功上市的第一例药物。

前期部分动物实验结果表明，oca等fxr激动剂对于肝纤维化具有显著的疗效，其作用机制在于fxr激动剂可以通过激动hsc细胞中fxr信号通路进而抑制hsc细胞的活化(fioruccis,antonellie,rizzog,etal.thenuclearreceptorshpmediatesinhibitionofhepaticstellatecellsbyfxrandprotectsagainstliverfibrosis.gastroenterology.2004nov；127(5):1497-512.fioruccis1,rizzog,antonellie,etal.afarnesoidxreceptor-smallheterodimerpartnerregulatorycascademodulatestissuemetalloproteinaseinhibitor-1andmatrixmetalloproteaseexpressioninhepaticstellatecellsandpromotesresolutionofliverfibrosis.jpharmacolexpther.2005aug；314(2):584-95.)；然而近期的研究发现，fxr激动剂对活化的hsc细胞的fxr信号通路没有作用，且对hsc细胞的活化没有改善作用(kowdleykv,luketicv,chapmanr,etal.arandomizedtrialofobeticholicacidmonotherapyinpatientswithprimarybiliarycholangitis.hepatology.2018may；67(5):1890-1902.)；此外，近期的两项临床研究结果显示：与安慰剂相比较，oca等fxr激动剂对患者的肝纤维化指标并没有显著的改善作用(nevensf,andreonep,mazzellag,etal.aplacebo-controlledtrialofobeticholicacidinprimarybiliarycholangitis.nengljmed.2016aug18；375(7):631-43；kowdleykv,luketicv,chapmanr,etal.arandomizedtrialofobeticholicacidmonotherapyinpatientswithprimarybiliarycholangitis.hepatology.2018may；67(5):1890-1902.)。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种含有sumo抑制剂的组合物，所述组合物包括fxr激动剂和sumo抑制剂，能够显著抑制肝星状细胞高活化，减少胶原纤维沉积，进而显著抗肝纤维化。

本发明提供了一种含有sumo抑制剂的组合物，所述组合物包括fxr激动剂和sumo抑制剂。

优选的，所述fxr激动剂包括但不仅限于奥贝胆酸、gw4064和way-362450中的一种或多种。

优选的，所述sumo抑制剂包括但不仅限于奇霉素和/或银杏酸。

本发明还提供了上述技术方案所述的组合物在制备抗肝纤维化药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的组合物在制备对抗伴有肝纤维化症状的药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的组合物在制备抑制肝星状细胞活化药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的组合物在制备减少胶原纤维沉积药物中的应用。

优选的，所述药物的剂型独立的包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂或注射剂。

本发明提供了一种含有sumo抑制剂的组合物，所述组合物包括fxr激动剂和sumo抑制剂。在肝星状细胞高活化状态下，fxr激动剂不具备抑制肝星状细胞活化的作用；本发明将fxr激动剂和sumo抑制剂复配后，在高度活化的肝星状细胞中也能够激活fxr信号通路，抑制肝星状细胞的活化，减少胶原纤维沉积，进而能够抗肝纤维化。

此外，本发明的重要意义还在于：对于健康人体而言，肝星状细胞处于静息态，对fxr激动剂具有反应性；然而，对于伴有纤维化的患者而言，肝星状细胞已处于活化态，此时该细胞对fxr激动剂的反应性降低或丧失，故而fxr激动剂不能抑制处于活化态的肝星状细胞的活化，因此当患者肝脏出现纤维化症状时，服用fxr激动剂不能产生抗肝纤维化的药理活性；本发明在阐释活化的肝星状细胞丧失对fxr激动剂反应性的机理的基础上，创新性的提出了一种组合方式，即包含sumo抑制剂和fxr激动剂的组合物在制备抗肝纤维化药物中的应用：活化的肝星状细胞对该复合物仍具有良好的反应性，同时该复合物可以显著抑制处于活化态的肝星状细胞的活化，因此对于患有肝纤维化的患者而言，服用该组合物仍可以抑制肝星状细胞的活化，减少胶原纤维沉积，产生良好的抗肝纤维化的药理效应。因此，该组合物对于伴有纤维化症状的患者而言具有重要的实际价值和应用价值。

附图说明

图1为静息态和活化态hscs的fxr转录活性差异分析图，其中图1-1为：oca对静息态(vehicle)和活化态(tgf-β)hscs细胞fxr的mrna水平分析；

图1-2为：oca对静息态(vehicle)和活化态(tgf-β)hscs细胞shp的mrna水平分析；

图1-3为：gw4064对静息态(vehicle)和活化态(tgf-β)hscs细胞fxr的mrna水平分析；

图1-4为：gw4064对静息态(vehicle)和活化态(tgf-β)hscs细胞shp的mrna水平分析；

图1-5为way-362450对静息态(vehicle)和活化态(tgf-β)hscs细胞fxr的mrna水平分析；

图1-6为：way-362450对静息态(vehicle)和活化态(tgf-β)hscs细胞shp的mrna水平分析。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；

图2为hscs活化后fxr蛋白sumo化水平分析。***p<0.001；

图3为sumo抑制剂sp和ga对活化的hscs中fxr蛋白sumo化水平分析，***p<0.001，##p<0.01，###p<0.001；

图4为fxr激动剂与sumo抑制剂联用对活化态hscs的fxr转录活性的作用，其中图4-1为：oca与sp联用对活化的hscs细胞fxr的mrna水平分析；

图4-2为：oca与sp联用对活化的hscs细胞shp的mrna水平分析；

图4-3为：gw4064与sp联用对活化的hscs细胞fxr的mrna水平分析；

图4-4为：gw4064与sp联用对活化的hscs细胞shp的mrna水平分析；

图4-5为：way-362450与sp联用对活化的hscs细胞fxr的mrna水平分析；

图4-6为：way-362450与sp联用对活化的hscs细胞shp的mrna水平分析；

图4-7为：oca与ga联用对活化的hscs细胞fxr的mrna水平分析；

图4-8为：oca与ga联用对活化的hscs细胞shp的mrna水平分析，nsp>0.05,*p<0.05，**p<0.01；

图5为fxr激动剂与sumo抑制剂联用对hscs活化的影响，其中图5-1为：oca与sp联用对acta-2mrna表达水平分析；

图5-2为：gw4064与sp联用对acta-2mrna表达水平分析；

图5-3为：way-362450与sp联用对acta-2mrna表达水平分析；

图5-4为：oca与ga联用对acta-2mrna表达水平分析，nsp>0.05,*p<0.05；

图6为fxr激动剂与sumo抑制剂联用对ccl4诱导的肝纤维化状态下肝脏fxr及其转录活性的作用，其中图6-1为：fxrmrna表达水平分析；

图6-2为：shpmrna表达水平分析，*p<0.05；

图7为fxr激动剂与sumo抑制剂联用对ccl4诱导的肝纤维化的作用，其中图7-1为：acta-2mrna表达水平分析，**p<0.01；

图7-2为：肝脏siriusred染色。

备注：本发明的所有图中p<0.05时表示有统计学差异。

具体实施方式

本发明提供了一种含有sumo抑制剂的组合物，所述组合物包括fxr激动剂和sumo抑制剂。本发明对所述fxr激动剂和sumo抑制剂的质量比没有特殊限定，任意质量比例皆可。

在本发明中，所述fxr激动剂优选包括但不仅限于奥贝胆酸、gw4064和way-362450中的一种或多种，所述多种具体为两种或两种以上。在本发明中，当所述fxr激动剂为两种或两种以上时，各组分任意质量混合。本发明对所述fxr激动剂不局限于上述3种，其来源没有特殊限定，优选包括天然来源、半合成或化学合成的各种fxr激动剂。

在本发明中，所述sumo抑制剂优选包括但不仅限于奇霉素和/或银杏酸。在本发明中，当所述sumo抑制剂优选包括奇霉素和银杏酸时，所述奇霉素和银杏酸以任意质量比混合。本发明对所述sumo抑制剂不局限于上述2种，其来源没有特殊限定，优选包括天然来源、半合成或化学合成的各种sumo抑制剂。

在本发明中，高度活化状态的肝星状细胞丧失对fxr激动剂的反应性，且fxr激动剂不具备抑制肝星状细胞活化的作用，所述sumo抑制剂能够显著提高高度活化的肝星状细胞对fxr激动剂的反应性，且能显著增强fxr激动剂对肝星状细胞高活化的抑制作用；伴有肝纤维化症状的个体，其肝星状细胞已处于活化态，单用fxr激动剂不能产生良好的抗纤维化作用，而本发明提供的fxr激动剂和sumo抑制剂的组合物可以显著抑制肝星状细胞的活化，减少胶原纤维沉积，进而能够抗肝纤维化。

本发明还提供了上述技术方案所述的组合物在制备抗肝纤维化药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的组合物在制备对抗伴有肝纤维化症状的药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的组合物在制备抑制肝星状细胞活化药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的组合物在制备减少胶原纤维沉积药物中的应用。

在本发明中，所述药物的剂型独立的优选包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂或注射剂。本发明对上述剂型的制备方法没有特殊限定，采用常规制备相应剂型的制备方法和所用相应的辅料制备即可。

在本发明中，所述组合物的服用方法优选包括口服、静脉注射、静脉滴注、肌肉注射等，以及各种服用方式的组合。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种含有sumo抑制剂的组合物及应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

hscs细胞活化后对fxr激动剂反应性降低原因分析

1实验材料

本发明使用的hsc-t6细胞系购自中南大学细胞库；

本发明使用的奥贝胆酸(oca)、gw4064和way-362450购自mce公司，tgf-β重组蛋白购自r&dsystems公司，逆转录试剂盒购自appliedbiosystems公司，trizolrnaisoplus购自takara公司，所用引物由lifeinvitrogen公司合成，sumo化elisa检测试剂盒购自epigentek公司，其余试剂均可由市售途径获得。

2实验方法

2.1hsc-t6细胞系培养和造模

hsc-t6细胞系培养至合适密度之后，更换含tgf-β(10mg/ml)或者oca(5μm)或者gw40064(5μm)或者way-362450(5μm)的含药低血清培养基进行孵育12h后，收集细胞。

2.2实时定量pcr

2.2.1细胞样本总rna提取

1)使用pbs清洗细胞后，加入800ultrizol试剂，移液枪反复吹打后，转移至ep管中，室温静置5min。

2)加入160μl氯仿，剧烈振荡15sec，室温放置5min后12000g离心15min。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。

3)小心转移上层水相300μl到新管中，并加入300μl异丙醇，颠倒混匀后，室温放置10min，而后12000g离心10min，弃去上清；

4)用预冷的75％乙醇1.0ml洗涤rna沉淀，而后12000g离心5min，弃上清得到总rna，并用10μldepc水复溶，定量后稀释至0.5μg/μl。

2.2.2逆转录

按照说明书要求的体系配比将rna溶液和试剂盒成分配制成总体积为20μl的体系并设定程序温度进行逆转录，具体配比要求如表1：

表1逆转录配比

逆转录的使用条件如下：

stage1:逆转录37℃15min；

stage2:变性85℃5s。

2.2.3pcr

pcr体系见表2：

表2pcr体系

pcr使用条件如下：

stage1：预变性95℃1min；

stage2：pcr反应95℃15sec；如60℃30secfor40cycles；72℃30sec；

stage3：融解曲线分析65～95℃，0.5℃/5s。

待测基因引物序列见表3：

表3引物序列

2.3sumo化elisa检测试剂盒

按照elisa检测试剂盒说明书要求提取细胞核蛋白之后，将一抗和细胞样本的核蛋白在板孔中共室温孵育60min，按照说明书要求接着补充加入sumo特异检测抗体，进一步加入颜色增敏剂显色，之后迅速读取655nm的吸光度，进行相对定量分析。

3实验结果

3.1活化的hscs对fxr激动剂反应性降低

在体外培养的hscs细胞中，通过给予细胞tgf-β1刺激，促进hscs细胞活化。根据实时rt-pcr的结果显示(图1)，在呈现高度活化状态的体外造模的hsc-t6细胞系中，存在fxr激动剂调控fxr下游靶基因能力减弱的现象。在静息态细胞中，fxr激动剂oca、gw4064和way-362450可以显著诱导fxr靶基因shp的mrna水平的上调(图1-2,图1-4,图1-6)；而在高活化态下，fxr激动剂oca、gw4064和way-362450均无法显著提高fxr下游靶基因shp的mrna水平(图1-2,图1-4,图1-6)。

3.2活化的hscs中fxr蛋白的sumo化水平提高

根据针对sumo化水平的elisa试剂盒检测发现(图2)，在造模后高度活化的hsc细胞中的fxr蛋白sumo化水平会随着培养时间的推进呈现逐渐提升。

实施例2

sumo抑制剂在体外hscs中对fxr通路的作用

1实验材料

sumo抑制剂奇霉素(spectinomycin,sp)和银杏酸(ginkgolicacid,ga)购自mce公司。

其余实验材料同实施例1。

2实验方法

2.1hsc-t6细胞系培养和造模

具体方法同实施例1中2.1部分。

2.2rt-pcr

具体方法同实施例1中2.2部分。

2.3sumo化elisa检测试剂盒

具体方法同实施例1中2.3部分。

3实验结果

3.1sumo抑制剂可以抑制活化的hscs细胞中fxr蛋白的sumo化水平

通过sumo化elisa试剂盒检测，发现sumo化抑制剂sp和ga可以显著减少hscs细胞内fxr蛋白的sumo化水平(图3)。

3.2sumo抑制剂可以提高活化的hscs细胞对fxr激动剂的反应性

在实施例1中，发现在活化的hscs细胞中，fxr激动剂oca、gw4064和way-362450对fxr信号通路的调控作用丧失，表现为对shp基因的诱导作用丢失。在本部分的研究中，拟考察在sumo抑制剂存在的条件下fxr激动剂对fxr信号通路的调控作用。根据rt-pcr的相对定量结果(图4)，发现在活化的hscs细胞中，在给予sumo抑制剂sp的条件下，fxr激动剂oca、gw4064和way-36250对fxr下游靶基因shp的诱导作用显著增强(图4-2,4-4和4-6)；此外在给予sumo抑制剂ga的条件下，fxr激动剂oca对shp的诱导作用也显著增强(图4-8)。

3.3sumo抑制剂可以增强fxr激动剂对hscs细胞活化的抑制作用

上述结果显示，sumo抑制剂可以抑制活化的hscs细胞中fxr的sumo化水平，进而增强fxr激动剂oca、gw4064和way-362450对fxr下游信号通路的调控作用。接下来，拟考察sumo抑制剂对fxr激动剂抗hscs活化的作用。同样根据rt-pcr的相对定量结果(图5)，活化的hscs细胞给予sp后，fxr激动剂oca、gw4064和way36250给药组的肝星状细胞的纤维化相关基因acta2的表达显著降低；活化的hscs细胞给予ga后，fxr激动剂oca可以显著抑制acta2的表达。上述结果表明，sumo抑制剂sp和ga可以降低fxr蛋白sumo化水平，有利于fxr激动剂oca、gw4064和way-362450调控减少纤维化相关基因的表达，从而提高抗纤维化的药效。

实施例3

sumo抑制剂在小鼠肝纤维化状态下对fxr通路的作用

1实验材料

实验小鼠(c57bl/6)购自扬州大学比较医学中心；

ccl4购自上海凌峰化学试剂公司，矿物油购自sigma-aldrich公司。

其余实验材料同实施例1。

2实验方法

2.1sumo抑制剂与oca联用对ccl4诱导的小鼠肝纤维化的作用。

动物适应性饲养一周后，将小鼠随机分为5组，每组8只，共计40只。分别为对照组、模型组、oca单给药组、sp单给药组、oca+sp联合给药组，其中模型组通过腹腔注射方式给予ccl4(20％，溶解于矿物油)，对照组给予相应体积的溶媒(矿物油)，每周给2次，共持续4周。从造模后的第三周开始进行oca腹腔灌胃给药，剂量为1.5mg/kg，每日一次为时两周。此外，联用sp的oca给药组从第一周开始就进行sp的皮下注射给药，剂量为200mg/kg，每天一次。给药周期结束后处死小鼠，分离保存肝脏备用。

2.2rt-pcr

具体同实施例1种2.2部分。

2.3肝脏病理分析：

部分肝脏组织于4％多聚甲醛中固定后，送于武汉谷歌生物科技有限公司(武汉，中国)进行双盲分析检测，检测项目为siriusred染色分析。

3实验结果

3.1sumo抑制剂sp增强oca对纤维化小鼠fxr通路的调控作用

通过rt-pcr实验对肝脏组织中fxr下游基因的mrna相对表达进行考察(图6)，发现oca治疗性给药组小鼠的肝脏组织fxr下游基因的mrna水平在和sp联用之后有了一定的回升。表明sumo化抑制剂可以增强fxr激动剂oca对纤维化小鼠的fxr通路的激动作用。

3.2sumo抑制剂sp可以增强oca抗肝纤维化药效

根据rt-pcr实验对肝脏组织纤维化相关基因的表达考察以及肝脏病理分析的染色结果，发现联用sp的oca给药组的oca抗纤维化药效有了显著提升。rt-pcr结果显示，肝脏组织中主要纤维化基因acta2的表达在联用组(sp+oca)中也呈现较明显的下降，相对与单给药组的药效较为明显(图7-1)；此外，siriusred染色结果显示对照组肝脏只有较少的红色胶原纤维染色，而模型组以及oca单给药组的切片中均因肝毒性而含有大量的红色胶原纤维，而采用oca联用sp给药后，肝脏中红色胶原纤维增生减少(图7-2)。

由以上实施例可以得出，高活化状态的肝星状细胞丧失对fxr激动剂的反应性，且fxr激动剂不具备抑制肝星状细胞活化的作用；本发明将fxr激动剂和sumo抑制剂复配后，高活化状态下的肝星状细胞对fxr激动剂恢复反应性，且能够抑制肝星状细胞的高活化作用，减少胶原纤维沉积，进而能够抗肝纤维化。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>中国药科大学

<120>一种含有sumo抑制剂的组合物及应用

<160>16

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

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