本发明属于医药技术领域，具体涉及光甘草素在制备抗癌药物中的应用。
背景技术：
光甘草素(glabrene，cas号：60008-03-9)属异黄烯类黄酮化合物，分子式为c20h18o4分子量322.36406。光甘草素又名光果甘草素，为豆科植物光甘草根的主要有效成份。光甘草素为淡黄色粉末，不溶于水，可溶于甲醇、乙醇和乙醚。现代研究显示，光甘草素具有清除超氧离子、抑制酪氨酸酶及类雌激素样作用等多种药理活性。但目前尚未有文献报道光甘草素具有较为突出的抗癌效果。
技术实现要素：
针对上述问题和现有技术的不足，本发明提供了光甘草素在制备抗癌药物中的应用。
进一步地，所述的光甘草素的化学结构式如式ⅰ所示：
进一步地，所述的癌症为肝癌。
进一步地，所述的癌症为结肠癌。
本发明的有益效果在于：
发现了光甘草素具有较好的抗肿瘤效果，尤其是针对肝癌和结肠癌，有望开发成为抗肿瘤新型药物，并进一步推进临床研究的发展。
具体实施方式
实施例1光甘草素对人源性肝癌细胞(heparg)及人源性结肠癌细胞(caco2)的细胞毒作用
1、药品及试剂：
光甘草素购自天津万象恒远科技有限公司，纯度97.42％。噻唑蓝(mtt)、乳酸脱氢酶(ldh)活性检测试剂盒、二甲基亚砜(dmso)、十二烷基硫酸钠(sds)均购自美国sigma公司；rpmi1640液体培养基、青-链霉素双抗及胰蛋白酶-edta溶液购自美国thermo公司。
2、细胞株
heparg及caco2的细胞株购于上海中科院细胞库。
3、仪器设备
co2培养箱及全自动酶标仪为美国thermo公司生产；beckman-coulter流式细胞仪为美国fullerton公司产品；倒置显微镜为日本olympus公司产品；台式低温离心机为美国sigma公司产品。
4、实验方法
4.1细胞培养及药物配制
细胞用含10％小牛血清和青、链霉素各100u/ml的rpmi1640培养液，置37℃、5％co2的培养箱培养。2天换液一次，取对数生长期细胞进行实验。称取光甘草素，用5％dmso溶解，并用细胞培养液稀释成应用浓度。
4.2mtt法测定细胞增殖活性
取对数生长期细胞，用rpmi1640培养液调整细胞浓度至1×105/ml，在96孔培养板中以90μl/孔加入细胞悬液，10μl/孔加入药物，培养24或48小时。于实验终止前4h加入mtt(10μl/孔)，实验终止时加入10％sds(100μl/孔)，震荡10分钟，于波长570nm处测定吸光值。根据下式计算抑制率(ir)值。
抑制率(ir.％)＝((阴性od均值－受试药od均值)/阴性od均值)×100％。
4.3ldh法测定细胞毒作用
取对数生长期细胞，用rpmi1640培养液调整细胞浓度至1×105/ml，在96孔培养板中以90μl/孔加入细胞悬液，10μl/孔加入药物，应用1％血清培养基继续培养24或48小时。收集细胞培养液，根据ldh检测试剂盒操作说明进行测定,以给药组数据与对照组数据的比值计算ldh释放率。
4.4统计分析
计量资料数据用均数±标准差表示，采用spss19.0进行t检验统计分析。p＜0.05为有统计学意义。
5、实验结果
5.1光甘草素对heparg及caco2细胞增殖的影响
由表1可以看出，光甘草素对heparg及caco2细胞增殖均有一定抑制作用，且在浓度为6.25～200μmol/l的剂量范围内呈明显的剂量和时间依赖性。处理时间为48h时，光甘草素对heparg及caco2的ic50分别为89.18和171.59μg/ml。
表1光甘草素对heparg及caco2细胞增殖的影响(
*p＜0.05，**p＜0.01vs阴性对照组
5.2光甘草素对heparg及caco2的细胞毒作用
如表2所示，6.25～200μmol/l的光甘草素孵育heparg及caco2细胞24h及48h后，ldh释放率呈现明显的剂量和时间依赖性。25～200μmol/l光甘草素孵育后，heparg及caco2细胞中ldh的释放率显著高于阴性对照组(p＜0.05，)，但光甘草素对heparg及caco2细胞ldh释放率的影响，两者无显著性差异(p＞0.05)。
表2光甘草素对heparg及caco2细胞ldh释放率的影响(
*p＜0.05，**p＜0.01vs阴性对照组
6、结论
本实验mtt细胞增殖实验及ldh细胞毒实验考察了光甘草素对人源性肝癌heparg细胞及结肠癌caco2增殖及细胞活力的影响，结果发现，光甘草素(12.5～200μmol/l)孵育细胞可显著抑制两种受试肿瘤细胞的增殖活性并具有明显的细胞毒作用，而且光甘草素对肿瘤细胞的抑制及杀伤作用具有时间和剂量依赖性，说明光甘草素具有抗肿瘤细胞增殖及肿瘤细胞杀伤作用。
实施例2光甘草素对heparg及caco2细胞凋亡及细胞周期的影响
1、实验材料
1.1药品及试剂
光甘草素购自天津万象恒远科技有限公司，纯度97.42％。二甲基亚砜(dmso)、和碘化丙啶(pi)均购自美国sigma公司；rpmi1640液体培养基、青-链霉素双抗及胰蛋白酶-edta溶液购自美国thermo公司。
1.2细胞株
heparg及caco2的细胞株购于上海中科院细胞库。
1.3仪器设备
co2培养箱为美国thermo公司生产；beckman-coulter流式细胞仪为美国fullerton公司产品；倒置显微镜为日本olympus公司产品；台式低温离心机为美国sigma公司产品。
2、实验方法
取对数生长期heparg及caco2的细胞，用含10％小牛血清的rpmi1640完全培养液调节细胞浓度为1×105/ml，以9ml/瓶接种至100ml培养瓶内。培养48小时后，分别以1ml/瓶加入光甘草素或0.01％dmso，继续培养24小时。实验终止时先将培养液离心(2g，10min)，再消化贴壁细胞离心，混合所得细胞沉淀用预冷的pbs洗2遍，用70％乙醇固定。细胞固定24小时后离心，弃去固定液，用pbs洗1遍；细胞沉淀中加入含rna酶(50mg/ml)的碘化丙啶(pi，50mg/ml)溶液0.5ml，避光、室温放置30min后过300目细胞筛；流式细胞仪(激发波长488nm，吸收波长600nm)检测，用flowjo10.0软件分析，计算凋亡细胞百分数和各细胞周期百分数。
3、统计分析
计量资料数据用均数±标准差表示，采用spss19.0进行t检验统计分析。p＜0.05为有统计学意义。
4、实验结果
4.1光甘草素对heparg及caco2细胞凋亡率的影响
如表3所示，阴性对照组细胞无明显凋亡，凋亡率为0.08±0.4％。光甘草素25、50及100μmol/l处理heparg细胞在g1期前出现明显凋亡峰，凋亡率分别为4.2±2.7、13.7±2.2和25.4±2.1％；光甘草素25、50及100μmol/l处理caco2细胞的凋亡率分别为4.4±2.6、11.8±1.9和22.9±2.4％；且光甘草素50及100μmol/l处理的heparg及caco2细胞的凋亡率均明显高于阴性组(p＜0.05)，说明光甘草素可诱导肿瘤细胞凋亡。
表3光甘草素对heparg及caco2细胞凋亡的影响(
*p＜0.05vs阴性对照组
4.2光甘草素对heparg及caco2细胞周期的影响
如表4所示，heparg阴性对照组细胞处于g0/g1、s和g2/m期的细胞分别占56.8、23.7和19.5％；光甘草素50及100μmol/l处理48h后，heparg细胞处于g0/g1、s和g2/m期的细胞分别占细胞总数的45.2、34.1和20.7％和9.8、45.2和45.3％。caco2阴性对照组细胞处于g0/g1、s和g2/m期的细胞分别占54.6、25.1和20.3％；光甘草素50及100μmol/l处理48h后，caco2细胞处于g0/g1、s和g2/m期的细胞分别占细胞总数的46.3、33.1和21.6％和12.1、45.1和42.8％。由此可见，光甘草素可浓度依赖性地增加heparg和caco2细胞处于g2/m的比例，同时减少g0/g1期细胞的比例。
表4光甘草素对heparg及caco2细胞周期的影响(
*p＜0.05vs阴性对照组
5小结
本研究结果显示，光甘草素25～100μmol/l处理可浓度依赖性地诱导heparg及caco2细胞凋亡，并形成细胞g2/m期阻滞，说明光甘草素抑制heparg和caco2细胞增殖作用可能与其诱导细胞凋亡及g2/m期阻滞有关。
实施例3光甘草素对h22小鼠肝癌的抗肿瘤作用
1、实验材料：
1.1药品与试剂
光甘草素购自天津万象恒远科技有限公司(纯度97.42％)。二甲基亚砜(dmso)购自美国sigma公司；环磷酰胺(ctx，200mg/支)山西普德药业有限公司，批号：h14023686。
1.2实验动物
雄性昆明种小鼠，spf级，体重18-22g，购自甘肃中医药大学实验动物中心，许可证号(scxk(甘)2001-0001-0001335)。
1.3肿瘤细胞株
小鼠肝癌h22细胞株由兰州大学药理教研室馈赠，用昆明种小鼠腹腔内传代保种。
2、实验方法
2.1小鼠h22肝癌移植瘤种植
用无菌注射器取小鼠肝癌h22腹水细胞，用无菌生理盐水调整细胞浓度至2.5×106个细胞/ml，取细胞悬液按每鼠0.2ml接种于昆明种小鼠右侧腋窝皮下(每鼠接种5×105个细胞)。
2.2药物配制
光甘草素先用dmso溶解后再加入生理盐水稀释，其中dmso浓度不超过0.01％；ctx临用前用生理盐水新鲜配制。
2.3分组及给药
实验设溶媒对照组(0.01％dmso)，化疗药阳性对照组(环磷酰胺，ctx，20mg/kg，i.p.)，及光甘草素低(1mg/kg)、中(2mg/kg)、高(4mg/kg)三个剂量组，具体分组及处理见结果部分。昆明种小鼠于接种肿瘤后次日随机分组并给予药物治疗，药物按0.1ml/10g体重，腹腔注射，隔日给药一次，共给药5-6次。
2.4指标测定及评价
抑瘤率计算：于末次给药后次日称体重，处死动物，剥取瘤块，称瘤重。按下式计算抑瘤率。抑瘤率(ir，％)＝(阴性对照组平均瘤重(g)-给药组平均瘤重(g))/阴性对照组平均瘤重(g)×100％
2.5统计分析
计量资料数据用均数±标准差表示，采用spss19.0进行t检验统计分析。p＜0.05为有统计学意义。
3、实验结果
如表5所示，与溶媒对照组相比，ctx组及光甘草素中剂量和高剂量组均可使肿瘤重量明显减轻，差别有显著性(p＜0.05)。其中，ctx组的抑瘤率为52％，光甘草素低、中及高剂量组的抑瘤率分别为15.65、30.23和42.44％。
表5光甘草素对小鼠肝癌h22的生长抑制作用
*p＜0.05vs溶媒对照组
4、结论
研究发现光甘草素腹腔注射对h22小鼠肝癌具有明显的抗肿瘤作用，光甘草素剂量为2mg/kg及4mg/kg对h22小鼠肝癌的抑瘤作用尤为显著。