一种枸橼酸盐化合物的新用途的制作方法

本发明涉及一种化合物的新用途，尤其是一种枸橼酸盐化合物的新用途。

背景技术：

转录因子eb(transcriptionfactoreb，tfeb)是第一个鉴定出的mitf/tfe家族的一种基本螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链(basic-helix-loop-helixleucinezipper，bhlh-zip)类转录因子，在溶酶体的生物合成和代谢过程中起着重要的调控作用，是细胞自噬重要的调控因子，具有广泛的生理功能。

tfeb的细胞定位和活性调节与其磷酸化修饰状态相关，在营养丰富的条件下，tfeb主要以无活性状态存在于细胞质，但在饥饿或溶酶体功能障碍的条件下，tfeb迅速转位至细胞核并激活其靶基因的转录。tfeb蛋白至少可以在20个位点被磷酸化，其中的ser142和ser211这两个丝氨酸残基对其细胞定位具有关键作用。当这两个丝氨酸残基都被磷酸化时，tfeb定位在细胞质中且无活性，如果将这两个氨基酸突变为ala，那么突变tfeb则总是定位在核里并具有相应的活性。在正常营养条件下，tfeb的ser211以mtorc1依赖性方式磷酸化，促进tfeb与ywha(14-3-3)蛋白结合并保留在细胞质中，抑制mtorc1将导致tfeb/ywha复合体的解离，tfeb迅速转位至核内，提高与自噬和溶酶体功能有关的多个基因的转录。还有研究表明，tfeb的ser211位点去磷酸化后依然具有调控作用，不足以将tfeb定位到细胞核中，ser122才是mtor直接磷酸化的位点，其磷酸化在很大程度上阻断了mtorc1抑制对tfeb的作用。mtorc1协调地对ser211和ser122的磷酸化进行调节，当mtorc1被抑制后，用不能磷酸化的残基同时取代两个位置而不是其中任一个位置，才能使tfeb核定位占优势，而且ser122的去磷酸化对于tfeb的核定位是必需的。

研究表明，在hela细胞中tfeb过表达能够诱导许多溶酶体相关基因的转录激活，并导致溶酶体数量显著增加。tfeb还靶向编码质子泵亚基的基因，产生并维持溶酶体水解酶水解反应所需的酸性环境，从而对溶酶体降解途径进行调节。此外，tfeb与许多自噬基因的启动子区结合，诱导自噬体的生物合成和自噬体与溶酶体的融合。过表达tfeb增强了与自噬相关的51个基因的表达水平，而沉默tfeb则会下调它们的表达。tfeb对自噬途径的多个关键步骤进行调控，且对自噬的激活具有直接调控作用。

研究表明，tfeb通过调控细胞自噬或溶酶体的生物合成参与细胞内物质清除，它可以做为靶点用于治疗与自噬或溶酶体功能障碍有关的疾病，如溶酶体贮积症(lsds)、神经退行性疾病(帕金森氏病、亨廷顿舞蹈病、阿尔茨海默氏病)及肿瘤(肾癌、胰管腺癌)等。因此，以tfeb为靶点筛选促进其活性的小分子化合物对上述疾病治疗具有很好的临床应用前景。已有一些促进tfeb表达的化合物用于临床试验，如2-羟丙基-β-环糊精(hpβcd)和染料木黄酮。但到目前为止，发现的具有诱导tfeb发挥作用的小分子化合物数量较少，且特异性较差。因此，需要研究开发更多tfeb特异性激活剂，并研究其激活tfeb的分子机制及对细胞自噬、细胞生长的影响，对指导临床tefb靶点药物研发具有重要意义。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于提供一种枸橼酸盐化合物的新用途。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

枸橼酸盐化合物促进tfeb入核方面的应用，所述化合物可促进tfeb核转位及其靶基因表达，所述枸橼酸盐化合物为n,n-二乙基-2-[4-(1,2-二苯基-2-氯乙烯基)苯氧基]乙胺顺反异构体混合物的枸橼酸盐，具有式(i)所示结构：

上述枸橼酸盐化合物为选择性雌激素受体调节剂，作为促进tfeb入核的小分子化合物，是利用稳定表达tfeb-gfp的hela细胞筛选获得的。

优选的，上述枸橼酸盐化合物的应用，所述化合物能明显增加hela细胞细胞核中tfeb蛋白水平。

优选的，上述枸橼酸盐化合物的应用，所述化合物能明显增加mda-mb231细胞细胞核中tfeb蛋白水平。

优选的，上述枸橼酸盐化合物的应用，所述化合物能促进转录因子tfeb靶基因包括p62、cathepsinb的表达。

上述枸橼酸盐化合物在制备自噬激动剂方面的应用。

优选的，上述枸橼酸盐化合物的应用，所述化合物能明显增加hela细胞中lc3点状分布。

优选的，上述枸橼酸盐化合物的应用，所述化合物能有效促进自噬流。

优选的，上述枸橼酸盐化合物的应用，所述化合物能抑制hela、mda-mb231细胞活力。

上述枸橼酸盐化合物作为研究tfeb活性及功能小分子的应用。

上述枸橼酸盐化合物在促进溶酶体功能方面的应用。

上述枸橼酸盐化合物在制备以tfeb为靶点的自噬或溶酶体功能障碍相关疾病的治疗药物方面的应用。

上述枸橼酸盐化合物在制备抗肿瘤药物方面的应用。

本发明的有益效果是：

上述枸橼酸盐化合物，是利用建立稳定表达tfeb-gfp的hela细胞筛选体系对小分子化合物库进行筛选所发现的一种小分子化合物，该小分子化合物为选择性雌激素受体调节剂n,n-二乙基-2-[4-(1,2-二苯基-2-氯乙烯基)苯氧基]乙胺顺反异构体混合物的枸橼酸盐，能有效的促进转录因子tfeb核转位。荧光筛选实验表明该化合物能明显促进tfeb-gfp入核并能明显增加稳定表达gfp-lc3的hela细胞中lc3的点状分布。核质分离实验结果显示该化合物处理后，hela、mda-mb231细胞的细胞核中tfeb蛋白水平明显比对照组增多，进一步表明该化合物能有效促进tfeb入核。蛋白免疫印迹实验结果表明该化合物能促进转录因子tfeb靶基因包括p62、cathepsinb的表达，促进稳定表达egfp-lc3的hela细胞中游离egfp片段的数量增加。mtt实验表明该化合物抑制hela、mda-mb231细胞活力。这些结果都说明该化合物可以促进转录因子tfeb核转位及细胞自噬，并可作为一种以tfeb为靶点的治疗自噬或溶酶体功能障碍相关疾病的药物和抗肿瘤药物的制备。

附图说明

图1为本发明利用稳定表达tfeb-gfp的hela细胞筛选促进tfeb入核的结果，i号药物即为本发明所述药物。结果说明，i号药物即为本发明所述药物是利用稳定表达tfeb-gfp的hela细胞筛选得到的有效促进tfeb入核药物。

图2为本发明通过核质分离技术以及蛋白免疫印迹技术检测本发明所述药物对内源性tfeb细胞定位的影响结果。结果说明，i号药物即为本发明所述药物能明显增加hela、mda-mb231细胞核中tfeb蛋白水平。

图3为本发明通过蛋白免疫印迹技术检测本发明所述药物对转录因子tfeb靶基因p62、cathepsinb表达的影响结果。结果说明，i号药物即为本发明所述药物能促进转录因子tfeb靶基因p62、cathepsinb的表达。

图4为本发明利用稳定表达gfp-lc3的hela细胞检测本发明所述药物为自噬激动剂的结果。结果说明，i号药物即为本发明所述药物能明显增加稳定表达gfp-lc3的hela细胞中lc3点状分布。

图5为本发明通过蛋白免疫印迹技术检测本发明所述药物对稳定表达gfp-lc3的hela细胞自噬流的影响结果。结果说明，i号药物即为本发明所述药物以浓度依赖性增加游离egfp片段的数量，促进自噬流发生。

图6为本发明mtt法检测本发明所述药物对细胞活力影响的结果。结果说明，i号药物即为本发明所述药物抑制hela、mda-mb231细胞活力。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。

实施例1

(1)促tfeb入核药物的筛选

①96孔板铺板：收集细胞，按照血球计数板计数结果调整细胞悬液的浓度，铺板使待测细胞密度8000个/孔，每孔加入200μl培养基，96孔板边缘用pbs填充。

②5％co2，37℃孵育24h后加入终浓度为5μm的药物(二甲基亚砜(dmso)、化合物i)。

③加药24h后，荧光显微镜拍照观察。图1结果显示，化合物i可以明显促进稳定表达tfeb-gfphela细胞中tfeb-gfp入核。

(2)核质分离技术

通过细胞浆蛋白抽提试剂cerⅰ和cerⅱ，在低渗透压条件下，使细胞充分膨胀，然后破坏细胞膜，释放出细胞浆蛋白，然后通过离心得到细胞核沉淀，沉淀即为细胞核，上清液为胞浆蛋白。

①在6孔板接种适量细胞，置于37℃，5％co2条件下培养过夜。

②用小分子化合物处理细胞，置于37℃，5％co2条件下继续培养。

③对于贴壁细胞，用含乙二胺四乙酸二钠盐(edta)的胰酶消化细胞，然后加入完全培养基终止消化，转移至1.5ml离心管中，3000rpm离心5min，收集细胞。

④将收集到的细胞用磷酸盐缓冲液(pbs)洗一次，倒掉，3000rpm空离30s。

⑤按以下比例向收集的细胞中加入冷的cerⅰ。

注：2×10⁶个hela细胞的体积为20μl。

⑥加入cerⅰ后(提前加入苯甲基磺酰氟(pmsf))，将漩涡振荡器调至最高速，剧烈震荡5s，使成为均一的液体，然后冰上静置10min。

⑦按上表加入相应体积的cerⅱ，从最高速度剧烈震荡5s，然后冰上静置1min。

⑧静置结束后，再从最高速度剧烈震荡5s，使细胞膜充分破裂。

⑨最后，4℃，14000rpm离心4min，此时上清蛋白即为胞浆蛋白。

⑩离心管底部沉淀即为细胞核。向细胞核沉淀中加入与胞浆蛋白等体积的细胞裂解液(ripa)，即得到细胞核蛋白。(对于沉淀，完全吸尽残余的上清，可加200μlpbs，离心一下再吸走，加入ripa，最高速剧烈震荡15-30s，冰浴30min。每隔1-2min，涡旋振荡15-30s。4℃，14000rpm离心10min，立即吸取上清至一预冷的ep管中，即为抽提得到的细胞核蛋白。图2结果显示，化合物i可以使hela、mda-mb231细胞核中tfeb蛋白表达量明显增多，进一步确定化合物i促进tfeb入核。

(3)化合物i对hela、mda-mb231细胞中转录因子tfeb靶基因p62、cathepsinb表达的影响

①hela、mda-mb231细胞用化合物i(5μm)处理24h,对照组用等体积的dmso做相同时间处理。

②提取细胞总蛋白，以β-actin为内参，利用蛋白免疫印记技术分别检测p62、cathepsinb的表达量。图3结果显示，化合物i可以促进转录因子tfeb靶基因p62、cathepsinb的表达。

(4)促进细胞自噬作用

①96孔板铺板：收集细胞，按照血球计数板计数结果调整细胞悬液的浓度，铺板使待测细胞密度8000个/孔，每孔加入200μl培养基，96孔板边缘用pbs填充。

②37℃，5％co2条件下孵育24h后加入终浓度为5μm的药物(dmso、雷帕霉素(rapa)、化合物i)。

③加药6h后，4％多聚甲醛室温固定15-20min。

④弃去4％多聚甲醛，pbs洗三次，荧光显微镜拍照或4℃保存后续拍照。图4结果显示，化合物i可以明显增加hela细胞中lc3点状分布。

(5)化合物i对稳定表达egfp-lc3的hela细胞自噬流的影响。

①稳定表达egfp-lc3的hela细胞用化合物i(2.5μm、5μm、10μm、15μm及20μm)处理12h，对照组用等量的dmso做相同时间处理。

②提取细胞总蛋白，以β-actin为内参，利用蛋白免疫印记技术检测游离egfp的数量。图5结果显示，化合物i可以促进稳定表达egfp-lc3的hela细胞中游离egfp片段的数量增加。

(6)化合物i对细胞活力的影响

①96孔板铺板：收集对数期hela、mda-mb231细胞，调整细胞悬液的浓度，每孔加入100μl培养基，铺板使待测细胞密度5000个/孔。

②利用不同浓度(1μm、2.5μm、5μm、10μm、15μm及20μm)的化合物i或dmso处理细胞48h。

③每孔加入20μl噻唑蓝(mtt)(现用现配，用pbs配置成5mg/ml的mtt溶液)继续培养4h。

④终止培养，小心吸去孔内的培养基，注意不要吸走沉淀。

⑤每孔加入200μl二甲基亚砜(dmso)溶解沉淀，低速振荡10min，使结晶充分溶解。

⑥利用酶标仪检测490nm波长下各孔的吸光度(od490nm)。

⑦细胞活力＝实验组吸光值/对照组吸光值。图6的结果显示，化合物i处理后细胞活力均出现了明显降低，说明化合物i抑制hela、mda-mb231细胞活力。

上述参照实施例对该一种枸橼酸盐化合物的新用途进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。