琥珀酸在防治对虾肠炎中的应用的制作方法

本发明涉及水产养殖领域，具体涉及琥珀酸在防治对虾肠炎中的应用。

背景技术：

对虾是我国重要的海水养殖虾类，在促进沿海地区经济增长和提高农渔民收入中做出重要贡献。但是，随着集约化养殖的不断扩大和生态环境的恶化，对虾肠道炎症疾病频发，给对虾养殖业造成了严重的经济损失。肠道是对虾营养和免疫的主要器官组织，其作为动物消化道的主要屏障，能够阻止病原微生物入侵机体。对虾肠道内栖息着大量的微生物菌群尤其是病原微生物，当机体受到刺激、抵抗力下降时，病原菌或内毒素会穿透肠壁进入机体，继而导致炎症发生，损伤肠道黏膜，危害动物健康。因此，降低对虾肠道炎症、修复肠道黏膜损伤具有重要意义。

琥珀酸，是一种常见的天然有机酸，是三羧酸循环中丙酸生成的中间产物。琥珀酸常见的用途为抗菌，在较多文献中可见到报道：nanobiomedicineandengineering,2015,7(2):62-74中报道了琥珀酸具有抗菌作用；cn108403676a公开了琥珀酸在提高细菌对抗生素敏感性方面的应用。该发明发现琥珀酸通过提高细菌的质子动力势，从而使进入细菌内部的抗生素数量增加，最终使细菌死亡，因此琥珀酸能够提高细菌对抗生素的敏感性，从而克服细菌耐药性的问题。将琥珀酸与抗生素联用可以显著提高抗生素的杀菌作用，与现有的只用抗生素作为抗细菌药物相比，具有更好的效果以及更高的安全性和可操作性。

在水产养殖方面，也常见到将琥珀酸用于水产动物抗菌抑菌，cn102112009a公开了一种包含琥珀酸或其衍生物的组合物，发明人发现琥珀酸及其衍生物具有用于动物饲料中的巨大潜力，例如用于改进饲料转换比(fcr)和/或用于调控肠道菌群。cn108186621a公开了琥珀酸在抑制罗非鱼源无乳链球菌β-溶血/溶细胞素的活性，并将其应用于制备防治水产养殖动物细菌性疾病药物，尤其是罗非鱼无乳链球菌病的防控药物，具有显著的疗效；琥珀酸为三羧酸循环中间产物，也是厌氧代谢的发酵产物之一，它也广泛存在于多种植物、动物的组织中，用于防治水产动物无乳链球菌病，具有来源丰富、价格低廉、无毒、无残留、无污染、高效等优势，符合发展无公害水产业、生产绿色水产品的病害防治准则。fishandshellfishimmunology,2018,7:10-17中报道了琥珀酸能够降低对虾饲料转换比、提高动物抗菌和抗氧化功能。

除了琥珀酸的抗菌用途，nature,2013,496(7444):238中报道了琥珀酸通过激活hif-1α诱导il-1β分泌促进炎症的功能。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种琥珀酸及其衍生物在琥珀酸在防治对虾肠炎中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

琥珀酸或其衍生物在制备防治对虾肠炎的药物中的应用。

进一步地，所述药物可降低对虾肠道炎症因子表达量。

进一步地，所述药物可修复肠道黏膜损伤。

进一步地，琥珀酸衍生物为琥珀酸酯、琥珀酸盐、琥珀酸铵、琥珀酰卤、琥珀酸酐中的至少一种。

进一步地，将药物直接投入养殖水体使用时，药物的用量为：以琥珀酸或其衍生物的质量浓度计1～100g/吨养殖水体。

进一步地，将药物掺入饲料使用时，药物的用量为：以琥珀酸或其衍生物的质量浓度计1～100g/kg饲料。

本发明的有益效果是：

本发明中首次公开了琥珀酸在降低对虾肠道炎症、修复肠道黏膜损伤方面有较好的效果，并通过实验证明，应用琥珀酸对对虾肠道炎症具有显著的改善作用，具体表现为明显降低了肠道炎症因子表达量，修复了肠道黏膜病理学损伤，为防治对虾肠道炎症提供了新方法。

附图说明

图1是琥珀酸对对虾细菌性肠炎肠道组织病理影响的he染色图，图中：a：空白对照组；b：肠炎模型组；c：琥珀酸低剂量治疗组；d：琥珀酸高剂量治疗组。

图2是琥珀酸对对虾肠道炎症因子表达水平的影响。

具体实施方式

下面将结合实施例进一步阐述本发明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

实施例1

1.对虾肠炎模型的建立

将对虾随机分为两组，对照组对虾(30只)饲喂普通饲料，其余对虾(30只)饲喂含有脂多糖的普通饲料，饱食投喂。连续喂养3天后，与对照组比较，病理切片观察可见造模对虾肠道黏膜明显损伤，黏膜脱落，上皮细胞排列紊乱，坏死或空泡化；细胞炎症因子nf-κb、tnf-α、il-10和il-1β表达量显著上调。

2.琥珀酸饲养对肠炎模型对虾

将肠炎模型对虾随机分为3组，每组30只，分别为肠炎模型组、琥珀酸低剂量治疗组、琥珀酸高剂量治疗组。另设含30只健康对虾的空白对照组。空白对照组虾投喂基础饲料；肠炎模型组虾投喂含脂多糖的基础饲料；琥珀酸低剂量治疗组虾投喂含0.25％琥珀酸的基础饲料；琥珀酸高剂量治疗组虾投喂含1％琥珀酸的基础饲料。4组对虾饲养条件一致，连续饲养7天。

3.检测项目与方法

琥珀酸饲养对肠炎模型对虾第7天，取各组对虾肠道用4％多聚甲醛固定，he染色，切片，显微镜观察(×200)肠道黏膜病理变化。另取肠道组织于液氮中冷冻保存，用于炎症因子表达量检测。

使用预冷的0.86％生理盐水对所取的肠道组织进行漂洗，去除组织液，滤纸拭干，称重后置于离心管中。按照m(组织,g):v(生理盐水,ml)＝1:9加入预冷的0.86％生理盐水，超声粉碎制备组织匀浆液；然后于4℃3000r/min离心10min，取上清液，使用南京建成生物工程研究所试剂盒分别测定tnf-α、il-10和il-1β含量，相关操作按试剂盒说明书进行。另使用trizol试剂提取对虾肠道组织的总rna，将rna反转录为cdna；利用real-timepcr检测nf-κb基因表达量。

4.数据分析

所得实验数据均以平均值±标准差表示，用spss17.0进行多因素方差分析，p＜0.05表示差异显著。

5.结果分析

(1)肠道黏膜组织病理学观察，结果如图1所示。

空白对照组：肠道黏膜细胞形态完整，结构清晰，排列整齐，无损伤特征。

肠炎模型组：肠道黏膜明显损伤，黏膜脱落，上皮细胞排列紊乱，坏死或空泡化。

琥珀酸低剂量治疗组：肠道黏膜损伤已修复，形态完整，结构清晰，上皮细胞高度比空白对照组有明显增加。

琥珀酸高剂量治疗组：肠道黏膜损伤已修复，形态完整，结构清晰，上皮细胞高度比空白对照组、琥珀酸低剂量治疗组均有明显增加。

(2)琥珀酸对肠炎对虾肠道炎症因子表达量的影响，结果如图2所示

与空白对照组相比，肠炎模型组肠道炎症因子nf-κb、tnf-α、il-10和il-1β表达量显著升高，表明脂多糖诱导对虾肠炎模型是成功的。

与肠炎模型组相比，琥珀酸低、高剂量治疗组肠道炎症因子nf-κb、tnf-α、il-10和il-1β表达量显著降低，表明琥珀酸可以降低对虾肠道炎症。

由以上结果可知，应用琥珀酸对对虾肠道炎症具有显著的改善作用，具体表现为明显修复了脂多糖诱导的肠道黏膜病理学改变，减轻了肠道黏膜上皮细胞的损伤，降低了肠道炎症因子表达量，其机制与其抑制病原细菌及修复肠道黏膜损伤相关，故琥珀酸还可用于防治其他细菌感染相关疾病。