一种抗HSV-1病毒的咖啡酸衍生物的制备和用途的制作方法

本发明涉及一种咖啡酸衍生物在制备抗病毒感染的药物中的应用，尤其是在制备抗单纯疱疹病毒1型的药物中的应用，属于医药技术领域。

背景技术：

氧化应激是病毒感染引起病理进程中的重要环节，病毒感染后细胞内产生大量的活性氧自由基(ros)，在机体引起氧化应激并增强细胞对前氧化因子的敏感性，造成广泛的损伤进一步加重疾病进程，而清除体内的ros在治疗病毒性疾病中非常关键，目前应用抗氧化剂进行抗病毒治疗的尝试仍然很有限(施志慧等,病毒感染与氧化应激的关系.复旦学报(医学版)，2012,39(1):80)。

单纯疱疹病毒感染是高发感染性疾病之一，疱疹病毒、麻疹病毒等多种非嗜肝病毒均可引起肝损伤，单纯疱疹病毒肝损伤是单纯疱疹病毒感染的一种罕见的表现，尤其是孕妇和免疫力抑制的患者出现性肝损伤的风险更大，可以引起严重或暴发性急性肝衰竭。阿昔洛韦是抗疱疹病毒的常用药物，在阿昔洛韦抗病毒治疗的基础上，如果转氨酶明显升高可给予甘草酸制剂等保肝降酶治疗，如果肝损伤重、凝血功能障碍，可给予凝血酶原复合物等改善凝血功能，防止出血治疗(杜林林等，单纯疱疹病毒感染引起的肝损伤.中国医刊,2014,49(3):6)。

咖啡酸(caffeicacid，ca)具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、升高白细胞及血小板等多种药理作用，可用于多种与氧化应激、炎症反应、病毒感染相关的疾病(杨九凌等，咖啡酸及其衍生物咖啡酸苯乙酯药理作用研究进展.中国药学杂志,2013,48(8):577)。咖啡酸改善缺血再灌注引起的大鼠肝脏微循环障碍和肝损伤，咖啡酸在病毒dna复制完成之前可抑制hsv-1增殖，而绿原酸(一种含有奎尼酸的咖啡酸酯)则对hsv-1没有抑制作用(ikedaketal.inhibitionofmultiplicationofherpessimplexvirusbycaffeicacid.intjmolmed,2011,28(4):595)。咖啡酸片在临床上用于预防出血或止血，也用于各种原因引起的白细胞减少症、血小板减少症。本发明以咖啡酸为先导化合物设计新结构，解决现有抗病毒药物在肝脏损伤方面的缺陷，筛选抗病毒的新型咖啡酸衍生物。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种咖啡酸衍生物在制备抗病毒感染药物中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种含有所述咖啡酸衍生物的药物组合物。

本发明的又一目的在于提供一种所述药物组合物，在制备治疗和预防病毒感染相关的药物中的应用，尤其是在制备治疗和预防呼吸道合胞病毒(rsv)、单纯疱疹病毒1型(hsv-1)或肠道病毒71型(ev71)感染的药物中的应用。

本发明的再一目的在于提供一种所述药物组合物，在治疗和预防病毒感染相关的病症中的应用，尤其是由致病性微生物导致肝炎、药物性肝损伤、酒精性肝损伤、非特异性脂肪肝、肝纤维化、肝硬化、急性肝损伤或慢性肝损伤的患者在治疗和预防病毒感染相关的病症中的应用。

本发明的又一目的在于提供一种所述药物组合物为口服剂或注射剂，优选剂型为片剂、胶囊剂、滴丸、分散片、颗粒剂、水针或粉针。

实现本发明所述的咖啡酸衍生物，其特征在于，所述的咖啡酸衍生物的结构式如通式(ⅰ)所示：

其中，所述r1选自氢、烷基或乙酰基；r2选自氢、羟基或甲氧基；r3选自氢或烷基；r4选自氢或甲磺酰基。术语“烷基”包括1-10个碳原子的直链或支链基团。更优选的烷基基团是1-6个碳原子的低级烷基基团。烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基、异己基、庚基或辛基等。

上述咖啡酸衍生物进一步优选的结构式如通式(ⅰ)所示。其中，所述r1选自氢、甲基、乙基或乙酰基；r2选自氢、羟基或甲氧基；r3选自氢、甲基或乙基；r4选自氢或甲磺酰基。

上述咖啡酸衍生物最优选如下列化合物之一：(e)-2-(4-甲磺酰基苯基)-3-(3,4-二羟基苯基)丙烯酸、(e)-2-(4-甲磺酰基苯基)-3-(3,4-二羟基苯基)丙烯酸乙酯、(e)-2-(4-苯基)-3-(3,4-二羟基苯基)丙烯酸、(e)-2-苯基-3-(4-羟基苯基)丙烯酸、(e)-2-(4-甲磺酰基苯基)-3-(4-羟基苯基)丙烯酸。

上述咖啡酸衍生物精选结构式为：

本发明的目的是提供咖啡酸衍生物如式(ⅰ)在制备治疗和预防呼吸道合胞病毒(rsv)、单纯疱疹病毒1型(hsv-1)或肠道病毒71型(ev71)感染药物中的应用，在治疗和预防呼吸道合胞病毒(rsv)、单纯疱疹病毒1型(hsv-1)或肠道病毒71型(ev71)感染相关的病症中的应用，尤其是由致病性微生物导致肝炎、药物性肝损伤、酒精性肝损伤、非特异性脂肪肝、肝纤维化、肝硬化、急性肝损伤或慢性肝损伤的患者在治疗和预防病毒感染相关的病症中的应用。

本发明以咖啡酸为先导化合物设计新结构，筛选抗病毒的新型咖啡酸衍生物，结构设计如下图所示：

本发明的咖啡酸衍生物通过perkin缩合反应，将取代苯乙酸和取代苯甲醛脱水得到乙烯桥连有两个苯环的新型咖啡酸衍生物。将取代苯乙酸、取代苯甲醛、乙酸酐和三乙胺混合后，在130～140℃的电热包中回流反应约4小时，加入少量的水分解，将反应物冷却到室温，放置析出固体。再进一步酯化、酰化或成盐得到目标结构。反应路线如下图所示：

本发明的咖啡酸衍生物进行抗呼吸道合胞病毒(rsv)、单纯疱疹病毒1型(hsv-1)或肠道病毒71型(ev71)，抗氧化，保护肝细胞氧化损伤的筛选实验。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明中合成出的新型咖啡酸衍生物，其中衍生物a2与咖啡酸(ca)比较，对hsv-1的选择抑制效果显著增强，ti分别为32和16，并对肝细胞的氧化损伤具有保护作用，在治疗hsv-1病毒感染性疾病领域存在潜在的应用价值。

(2)本发明合成出的化合物结构明确、抑制效果明确，实用性强，易于生产推广。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。以下实施例中各剂型的辅料可以用药学上可接受的辅料替换，或者减少、增加。其中，10％pvpk30乙醇液，“适量”含义：以片剂为例，用量一般为2％～5％，浓度一般为0.5％～5％。

附图说明

图1是咖啡酸衍生物对h2o2氧化损伤肝细胞l02的影响图。

具体实施方式

实施例1衍生物制备

在单口瓶中，将取代苯乙酸(0.01mol)，取代苯甲醛(0.01mol)，乙酸酐6.0ml(新蒸馏)和三乙胺0.7ml(新蒸馏)混合后，在130～140℃的电热包中回流反应4～6小时，降温到100℃，加入蒸馏水1～2ml分解，再搅拌反应5分钟，将反应物移出电热包，冷却到室温，投入到60ml的水中，室温放置析出固体，过滤得到固状产物。

上步的固状产物，若加入naoh溶液，调节ph在9左右，在90℃下搅拌反应2小时，冷却至室温，用稀hcl溶液调节ph在6～7，析出固体，过滤得到产物，可制备得到具有酚羟基的e-构型衍生物a1、a3、a4和a5。将制备出的衍生物a1，加入无水乙醇中，再加入浓硫酸，回流反应6小时，析出酯化后的e-构型衍生物a2。

衍生物(a1)：(e)-2-(4-甲磺酰基苯基)-3-(3,4-二羟基苯基)丙烯酸。

将4-甲磺酰基苯乙酸和3,4-二羟基苯甲醛混合，按照上述条件反应，最终得到淡黄色固体，收率28.7％，熔点240.7-241.9℃；紫外最大吸收(溶剂为甲醇)，λmax＝332；¹hnmr(dmso)δ12.62(s,1h),9.48(s,1h),8.97(s,1h),7.94(d,j＝8.0hz,2h),7.68(s,1h),7.45(d,j＝8.0hz,2h),6.60(d,j＝8.2hz,1h),6.45(dd,j＝8.3,2.2hz,1h),6.39(d,j＝2.0hz,1h),3.26(s,3h)；¹³cnmr(dmso)δ168.52,147.97,145.42,143.04,141.29,140.05,131.25,128.34,127.63,125.54,124.05,117.87,115.89,44.08。

衍生物(a2)：(e)-2-(4-甲磺酰基苯基)-3-(3,4-二羟基苯基)丙烯酸乙酯。

将上一步衍生物(a1)加入无水乙醇中，再加入浓硫酸回流，按照上述条件处理，得到白色晶体，收率54.5％，熔点176.0－176.3℃；紫外最大吸收(溶剂为甲醇)，λmax＝334；¹hnmr(dmso)δ12.77(s,1h),7.73(s,1h),7.39(qd,j＝7.4,6.2,3.4hz,3h),7.18(dd,j＝6.9,2.6hz,2h),7.09(d,j＝8.5hz,1h),6.95(dd,j＝8.5,2.1hz,1h),6.90(d,j＝2.1hz,1h),2.22(s,3h),2.19(s,3h)；¹³cnmr(dmso)δ166.41,147.68,144.94,141.89,141.28,139.77,130.79,127.18,127.04,124.79,123.73,117.40,115.40,60.67,43.51,14.16。

衍生物(a3)：(e)-2-(4-苯基)-3-(3,4-二羟基苯基)丙烯酸。

将苯乙酸和3,4-二羟基苯甲醛混合，按照上述条件反应，最终得到白色固体，收率8％，熔点215.1-215.8℃；紫外最大吸收(溶剂为甲醇)，λmax＝324；¹hnmr(dmso)δ12.41(s,1h),9.41(s,1h),8.80(s,1h),7.58(s,1h),7.38(d,j＝5.9hz,2h),7.35(dd,j＝6.8,1.8hz,1h),7.15(dd,j＝6.6,1.7hz,2h),6.54(d,j＝8.2hz,1h),6.43(d,j＝2.1hz,1h),6.39(dd,j＝8.3,1.9hz,1h)；¹³cnmr(dmso)δ169.15,147.50,145.24,140.10,137.36,129.98,129.92,128.92,127.76,126.16,123.61,118.19,115.64。

衍生物(a4)：(e)-2-苯基-3-(4-羟基苯基)丙烯酸。

将苯乙酸和对羟基苯甲醛混合，按照上述条件反应，最终得到白色固体，10.0％，熔点231.7～232.1℃；紫外最大吸收(溶剂为甲醇)，λmax＝286；¹hnmr(dmso)δ12.34(s,1h),9.82(s,1h),7.66(s,1h),7.38(d,j＝1.8hz,3h),7.35(d,j＝7.2hz,1h),7.15(dd,j＝6.7,1.5hz,2h),6.87(dd,j＝6.9,1.9hz,2h),6.55(dd,j＝9.1,2.6hz,2h)；¹³cnmr(dmso)δ172.45,169.07,159.00,139.71,137.41,132.66,130.09,129.97,129.00,127.81,125.67,115.64,21.50。

衍生物(a5)：(e)-2-(4-甲磺酰基苯基)-3-(4-羟基苯基)丙烯酸。

将4-甲磺酰基苯乙酸和对羟基苯甲醛混合，按照上述条件反应，最终得到白色固体，收率68％，熔点236.9～237.7℃；紫外最大吸收(溶剂为甲醇)，λmax＝310；¹hnmr(dmso)δ12.33(s,1h；-cooh),9.92(s,1h；-oh),7.93(d,j＝6.5hz,2h),7.75(s,1h),7.45(d,j＝8.3hz,2h),6.84(d,j＝8.2hz,2h),6.59(d,j＝8.7hz,2h),3.26(s,3h)；¹³cnmr(dmso)δ168.40,159.34,143.03,140.86,140.14,132.80,131.24,128.56,127.63,125.07,115.88,43.99。

实施例2生物学试验

一、抗病毒活性的筛选

咖啡酸衍生物的体外抗病毒作用，进行常见的呼吸道合胞病毒(rsv)、单纯疱疹病毒1型(hsv-1)、肠道病毒71型(ev71)等抗病毒效应研究，参考文献(岳路路等，世界中医药，2018,13(01):199-206)方法，显微镜下观察细胞存活率。此部分内容，由山东省抗病毒研究中心测试。

实验分为细胞对照组、病毒对照组和系列咖啡酸衍生物的药物组，利巴韦林作参照品。每组设3个重复孔。药物组将咖啡酸衍生物用细胞维持液稀释，从1﹕2开始进行梯度稀释，加入到已培养好的单层细胞人喉癌细胞(hep2)或恒河猴胚胎肾细胞(ma104)中，每孔50μl。将rsv、hsv-1病毒接种在hep2细胞上，将ev71病毒接种在ma104细胞上，在37℃、5％co2无菌箱中培养，显微镜下每日观察细胞病变(cpe)，当cpe大于50％视为细胞毒性，计算得到半数中毒浓度(tc50)。当cpe大于90％时终止培养，显微镜下观察其cpe，将cpe发生50％的稀释度，视为药物半数有效浓度(ec50)。根据上述药物半数中毒浓度(tc50)及药物半数有效浓度(ec50)，按照下述公式(1)计算咖啡酸衍生物的抑毒指数(ti)，ti大于4者判为有效。实验结果，见表1。

公式(1)：ti＝tc50/ec50。

表1咖啡酸衍生物对rsv、hsv-1和ev71病毒的作用

实验结果：利巴韦林对三种病毒rsv、hsv-1、ev71都具有一定的抑制作用，实验模型成功；咖啡酸(ca)对三种病毒rsv、hsv-1、ev71也都有一定的抑制作用，对hsv-1抑制作用与利巴韦林相当。咖啡酸修饰改造后得到衍生物a1～a5，其中a2和a5对hsv-1的抑毒指数(ti)大于4，都具有良好的选择性抑制hsv-1作用，其中衍生物a2的抑制作用最强。这些衍生物对rsv和ev71的抑制作用，除a2、a4和a5对rsv具有一定的效果，其他未观察到抑制作用。

二、抗氧化活性的筛选

咖啡酸衍生物对dpph自由基和abts+自由基清除能力的研究，参考文献(曾维才等，化工进展,2013(06):1205-1213)方法，并稍作改进。将咖啡酸及其衍生物配制成溶液，稀释成不同浓度的测试液。维生素c(vc)作参照品。

移液枪移取测试液50μl置96孔板内，设两个副孔，再加入120μg·ml^-1的dpph溶液100μl，对照组用70％乙醇代替，避光反应30min，用多功能读板机在517nm处测各孔的吸光度，分别记作a测试和a对照，按照清除率公式(1)计算dpph清除率。移液枪移取测试液50μl置96孔板内，设两个副孔，再加入135μg·ml^-1的abts溶液100μl，对照组用95％乙醇代替，避光反应6min，用多功能读板机在734nm处测各孔的吸光度，分别记作a测试和a对照，按照清除率公式(2)计算abts清除率。实验结果，见表2。

公式(2)：自由基清除率(％)＝[(a对照-a测试)/a对照]×100％。

自由基清除能力以半数抑制率(ic50)来衡量，ic50是指清除率为50％时的药物浓度，ic50值越小其清除自由基的能力越强。ic50值以浓度为横坐标，以清除率为纵坐标做回归方程来计算求得。

表2咖啡酸衍生物对dpph和abts的清除率(ic50)

实验结果：维生素c(vc)对dpph和abts⁺自由基都具有良好的清除作用，实验模型成功；咖啡酸(fa)具有酚羟基，对dpph和abts⁺自由基都具有良好的清除作用。咖啡酸衍生物的抗氧化作用通过半数清除率(ic50)比较，ic50值越小其抗氧化作用越强。咖啡酸修饰改造后得到衍生物a1～a5都具有酚羟基，对自由基都具有一定的清除效果，尤其是a1、a2和a3具有良好的抗氧化作用。衍生物a1的羧基被酯化后生成a2，对自由基的清除能力相当，但a2对hsv-1的选择抑制作用显著增强。

三、对肝损伤的筛选

咖啡酸衍生物对肝损伤的保护作用，参考文献(韩延忠等.中国中药杂志,2016,41(7):1302)方法，并稍作改进。将咖啡酸(ca)及其衍生物配制成溶液，稀释成50μg/ml的测试液。

将浓度为8.0×10⁴个/ml的肝细胞l02接种在96孔细胞培养板中，每孔100μl，细胞接种12h后，实验设阴性对照组、空白对照组和药物组，设3个复孔，以0.3mmol/l的h2o2造模，时间为0.5h，再用mtt法检测细胞l02的存活率。用酶标仪在490nm处测量吸光度(od值)，根据各组测定的od值，按照下述公式(3)计算药物组的细胞活力。实验结果，见图1。

公式(3)：细胞活力(％)＝[(od药物组-od空白组)/(od对照组-od空白组)]×100％

实验结果：在肝细胞l02中加入一定浓度的咖啡酸(ca)及其衍生物a1～a5，以h2o2造模，用mtt法检测细胞的活性，实验结果如图-1所示。模型组的细胞存活率为45.2％，对肝细胞的氧化损伤较大；加入咖啡酸(ca)后的细胞存活率为91.5％，咖啡酸对肝细胞的氧化损伤具有保护作用。衍生物a2的细胞存活率为90.2％，与咖啡酸的保护作用基本相当；其他衍生物与a2比较，对肝细胞的氧化损伤保护作用较差。

基于以上实验结果，在本发明中咖啡酸(ca)经结构改造后，获得的部分咖啡酸衍生物对单纯疱疹病毒1型(hsv-1)具有良好的选择抑制作用。衍生物a2与咖啡酸(ca)比较，a2对hsv-1的选择抑制效果显著增强，ti分别为32和16；但对肝细胞l02的氧化损伤保护作用相当，分别为90.2％和91.5％。咖啡酸衍生物具有抗氧化作用，其中a1、a2和a3具有良好的抗氧化作用，通过保护肝细胞的氧化损伤，有利于降低hsv-1病毒以及药物对肝脏的损伤。综上实验结果表明，本发明的部分咖啡酸衍生物对单纯疱疹病毒1型(hsv-1)具有选择抑制作用，对肝细胞l02表现出良好的氧化损伤保护作用，尤其是咖啡酸衍生物a2抗病毒效果最佳，可用于制备具有肝脏病症状的患者可使用的抗病毒药物。

实施例3药物组合物制备

本发明药物组合物的剂型可以是片剂、胶囊剂、滴丸、分散片、颗粒剂、水针或粉针，实施例通过片剂和胶囊剂对本发明的内容作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明的范围仅限于以下实施例。

一、片剂制备

处方：衍生物a2称取1.0g，微晶纤维素称取50g，预胶化淀粉称取100g，10％pvpk30乙醇液适量，硬脂酸镁称取3g，共制备1000片。将原料和辅料分别粉碎过80目筛备用；制粒溶液制备：取pvpk30加浓度为30～95％药用乙醇制成5～10％的溶液；取原料和辅料混匀，加入制粒溶液适量制软材，20目制粒，50～70℃干燥后，18目整粒，加入硬脂酸镁混匀；测定颗粒含量，冲压片，计算片重，随机检测装量；成品全检，包装入库。

二、胶囊制备

处方：衍生物a2称取0.5g，微晶纤维素称取50g，预胶化淀粉称取100g，10％pvpk30乙醇液适量，硬脂酸镁称取3g，共制备1000粒。将原料和辅料分别粉碎过80目筛备用；制粒溶液制备：取pvpk30加浓度为30～95％药用乙醇制成5～10％的溶液；取原料和辅料混匀，加入制粒溶液适量制软材，20目制粒，50～70℃干燥后，18目整粒，加入硬脂酸镁混匀；测定颗粒含量，胶囊填充，随机检测装量；成品全检，包装入库。