一种玫瑰酸D在抗造血干细胞衰老方面的应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及造血干细胞抗衰老，具体涉及一种玫瑰酸d在抗造血干细胞衰老方面的应用。

背景技术：

造血干细胞经历自我更新、分化、衰老与死亡等复杂过程而维持机体终生血细胞产生。机体在衰老过程中造血系统的基本成分虽得以维持，但造血干细胞的功能和数量却逐渐降低，这导致机体造血功能降低、免疫功能衰退。

目前认为衰老是一种与基因相关的疾病，抑癌基因p16是调控细胞衰老的关键基因。研究已经证实，细胞衰老时，p16基因的转录及蛋白质表达水平增高，抑制细胞有丝分裂，刺激发生反应而产生rb蛋白的磷酸化，从而维持了衰老细胞不可逆的生长停滞状态。抑制p16基因的转录及蛋白表达可以抑制细胞衰老。

环氧胡萝卜烯醛a、环氧胡萝卜烯醛b、玫瑰酸a、玫瑰酸b和玫瑰酸d为重瓣玫瑰花中的成分，其化学结构如图1所示。目前尚未见这些化合物抗造血干细胞衰老的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种玫瑰酸d在抗造血干细胞衰老方面的应用。

本发明上述目的通过如下技术方案实现：

玫瑰酸d用作p16基因转录抑制剂的用途。

玫瑰酸d用于制备抗造血干细胞衰老的药物的用途。

一种用于抗造血干细胞衰老的药物制剂，以玫瑰酸d为活性成分，制成药学上可以接受的剂型。

有益效果：

本发明发现，环氧胡萝卜烯醛a、环氧胡萝卜烯醛b、玫瑰酸a或玫瑰酸d可以通过抑制p16基因转录抵抗造血干细胞衰老，环氧胡萝卜烯醛a、环氧胡萝卜烯醛b、玫瑰酸a或玫瑰酸d可以制成p16基因转录抑制剂和抗造血干细胞衰老的药物。

附图说明

图1为各化合物结构式；

图2为各组造血干细胞中p16mrna表达水平；

图3为各组造血干细胞sa-β-gal染色结果；

图4为各组造血干细胞混合集落培养结果。

具体实施方式

下面结合实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。

一、实验材料

健康清洁级c57bl/6j小鼠，雌雄各半，6～8周龄，体重18～20g，由中国药科大学动物中心提供。环氧胡萝卜烯醛a、环氧胡萝卜烯醛b、玫瑰酸a、玫瑰酸b和玫瑰酸d自制，纯度≥98％，干燥保存。anti-sca-1microbeadkit购自miltenyi公司。sa-β-galstainingkit购自cellsignaling公司。甲基纤维素培养基methocultgfm3434购自stemcell公司。

二、实验方法

1、造血干细胞衰老模型制备及分组干预

c57bl/6j小鼠随机分为对照组、模型组和给药组(包括环氧胡萝卜烯醛a、环氧胡萝卜烯醛b、玫瑰酸a、玫瑰酸b和玫瑰酸d给药组)，每组24只。模型组和给药组小鼠采用x线3.0gy全身均匀照射(照射能量6mev，照射源距动物的高度为100cm，照射面积为25cm×25cm，每次照射1min)每10天1次，共8次。给药组于照射当日分别灌胃给予环氧胡萝卜烯醛a、环氧胡萝卜烯醛b、玫瑰酸a、玫瑰酸b或玫瑰酸d50mg/kg，对照组和模型组灌胃给予等容量0.5％cmc-na，隔天1次，共40次。末次照射后第10天处死。

2、造血干细胞分离与纯化

无菌条件下取出小鼠股骨及胫骨，分离骨髓单个核细胞(mncs)。采用抗sca-1⁺免疫磁珠分选干细胞。取(2～5)×10⁷个mncs加入90μlbuffer和10μlanti-sca-1-fitc抗体，4℃孵育15min，离心弃上清，加入80μlbuffer和20μlanti-fitcmicrobeads，4℃孵育25min，离心弃上清，0.5mlbuffer重悬细胞，加入磁性分离柱内，分选柱用buffer洗涤3次，加入0.5mlbuffer收集sca-1⁺细胞，即分离纯化得到造血干细胞。用流式细胞仪检测sca-1⁺细胞比例即为造血干细胞的纯度。

3、rt-pcr检测p16mrna表达

采用trizol方法提取各组造血干细胞的总rna，检测完整性。取1μg总rna，用amv逆转录酶进行逆转录，逆转录产物pcr扩增，以gapdh为内参，检测p16mrna表达。引物序列如下。pcr反应体系：反转录产物1μl、taq酶(5u/μl)0.45μl、dntps(10mmo1/l)1μl、含15mmol/lmg²⁺缓冲液5μl，gapdh的上、下游引物各1μl，p16上、下游引物各1μl，用灭菌水补充至50μl。pcr反应条件为：93℃，30s；94℃，3min；64℃，30s；71℃，1min；35个循环，71℃，7min。以p16灰度值/gapdh灰度值之比表示p16mrna的相对值。

p16mrna上游引物：5′-ccatgtccaaaagtggtgtaat-3′

p16mrna下游引物：5′-atggatgcattgagtgaagta-3′

gapdh上游引物：5′-gacgcctatcggttagtc-3′

gapdh下游引物：5′-gaactgtgcgtctctgtc-3′

4、造血干细胞衰老指标检测

sa-β-gal染色：收集各组1×10⁵个造血干细胞，加fixative工作液1ml充分混匀，固定10min；pbs洗涤2次，加入含solutiona，solutionb，stainingsolution三者的工作液1ml混匀，37℃、无co2条件下孵育16h，甘油封片镜检，以随机计数的400个细胞中阳性细胞的个数计算阳性细胞率。

混合集落培养：收集各组1×10⁴个造血干细胞，离心弃上清，加甲基纤维素半固体培养基1ml混匀，接种于96孔板，在37℃、5％co2及饱和湿度培养箱孵育10～12d，依接种造血干细胞数量与形成混合集落形成单位(cfu-mix)的数量评价造血干细胞的多向分化能力。

5、统计学分析

采用spss19.0统计学软件，实验重复3次，数据资料用均值±标准差表示，样本均数比较采用组间t检验。p<0.05为差异有显著性意义。

三、实验结果

1、造血干细胞纯度检测

分离纯化后sca-1⁺细胞纯度达(90.55±7.24)％，提示分选的sca-1⁺hscs纯度较高。

2、各组造血干细胞中p16mrna表达水平

结果如表1和图2所示，与对照组相比，模型组造血干细胞中p16mrna表达水平显著升高，说明p16与造血干细胞衰老有关；与模型组相比，环氧胡萝卜烯醛a、环氧胡萝卜烯醛b、玫瑰酸a和玫瑰酸d给药组造血干细胞中p16mrna表达水平显著降低，说明环氧胡萝卜烯醛a、环氧胡萝卜烯醛b、玫瑰酸a和玫瑰酸d通过抑制p16转录抑制了造血干细胞的衰老。玫瑰酸b对p16转录水平无明显影响。

表1各组造血干细胞中p16mrna表达水平

3、各组造血干细胞sa-β-gal染色结果

各组造血干细胞sa-β-gal染色阳性百分比如表2和图3所示，与对照组相比，模型组sa-β-gal染色阳性百分比显著升高；与模型组相比，环氧胡萝卜烯醛a、环氧胡萝卜烯醛b、玫瑰酸a和玫瑰酸d给药组sa-β-gal染色阳性百分比显著降低；玫瑰酸b给药组sa-β-gal染色阳性百分比与模型组比较无显著差异。

表2各组造血干细胞sa-β-gal染色结果

4、各组造血干细胞混合集落培养结果

各组造血干细胞cfu-mix如表3和图4所示，与对照组相比，模型组cfu-mix显著降低；与模型组相比，环氧胡萝卜烯醛a、环氧胡萝卜烯醛b、玫瑰酸a和玫瑰酸d给药组cfu-mix显著升高；玫瑰酸b给药组cfu-mix与模型组比较无显著差异。

表3各组造血干细胞混合集落培养结果

上述结果表明，环氧胡萝卜烯醛a、环氧胡萝卜烯醛b、玫瑰酸a或玫瑰酸d可以通过抑制p16基因转录抵抗造血干细胞衰老，环氧胡萝卜烯醛a、环氧胡萝卜烯醛b、玫瑰酸a或玫瑰酸d可以制成p16基因转录抑制剂和抗造血干细胞衰老的药物。