一种含有自体子宫内膜间充质干细胞外泌体的制剂的制作方法

本发明涉及生物干细胞技术领域，尤其涉及一种含有自体子宫内膜间充质干细胞外泌体的制剂。

背景技术

子宫对于女性的一生至关重要，但是一旦子宫内膜损伤，则会造成一系列后果，现有的子宫内膜修复难度大，治疗时间较长，给很多女性带来了极大的困扰。

间充质干细胞(mesenchymalstemcells,msc)间充质细胞属于多能干细胞，具有多向分化、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控等多种功能，主要存在于子宫内膜、脂肪和骨髓中。

因此如何使得间充质干细胞能够用于治疗子宫内膜损伤成为了本领域技术人员亟待解决的问题。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的不足，提供一种含有自体子宫内膜间充质干细胞外泌体的制剂，该注射制剂利用干细胞分泌的外泌体为治疗子宫内膜损伤等疾病提供了安全、有效、使用方便的治疗药物。

如图所示，本发明是通过以下技术方案予以实现：一种含有自体子宫内膜间充质干细胞外泌体的制剂，按照体积份数比，包括5份间充质干细胞外泌体以及95份基质溶液，按照体积份数比，基质溶液包括95-99份复方电解质注射液以及1-5份药用人血白蛋白，间充质干细胞外泌体通过自体子宫内膜间充质干细胞饥饿培养所得，饥饿培养时间为12-24小时，自体子宫内膜间充质干细胞提取自人子宫内膜的间充质干细胞，按照正常培养的方法进行培养得到，培养时间为48-72小时。

根据上述技术方案，优选地，基质溶液的ph值为6.0-8.0。

根据上述技术方案，优选地，复方电解质注射液为复方电解质葡萄糖mg3注射液。

根据上述技术方案，优选地，药用人血白蛋白为奥地利百特公司所生产。

根据上述技术方案，优选地，其用于治疗子宫内膜损伤等用途。

一种含有自体子宫内膜间充质干细胞外泌体的制剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)自体子宫内膜间充质干细胞的培养：从细胞库中选取自人子宫内膜的间充质干细胞进行复苏，用无酚红dmem/df12和体积比浓度为10％胎牛血清做完全培养基，放入t75细胞培养瓶在37℃、5％co2条件下进行培养；

(2)间充质干细胞外泌体的制备：待细胞生长程度达到70％-80％，使用生理盐水清洗细胞2-4次，用复方电解质注射液进行饥饿培养12-24小时，待细胞生长程度达到90％-95％后，收取细胞培养上清液，并采用外泌体提取试剂盒对间充质干细胞外泌体进行提取，按照质量体积比2-4％加入人血清白蛋白，混合均匀后待用；

(3)基质溶液的制备：按配比，将药用人血白蛋白，按照质量体积比2-4％溶于复方电解质注射液中，配制成均一的基质溶液待用；

(4)制备腔内注射制剂：按照体积份数比，选取95份基质溶液以及5份间充质干细胞外泌体，进行充分混合搅拌，待混合均匀后，分装到无菌保存管中，放入-80℃冰箱中冷冻待用。

本发明的有益效果是：将间充质干细胞外泌体混合到基质溶液中，使得外泌体的活性及功能得到了保存和利用，而且存活的时间可以更长，可达到长时间促进表皮细胞增长，消除炎症，快速修复内膜损伤重建，从而实现子宫内膜结构和功能的恢复。

附图说明

图1示出了根据本发明的实施例的不同培养方法提取的外泌体数量图。

图2示出了根据本发明的实施例的不同实验组子宫内膜三种细胞因子的基因表达差异图。

图3示出了根据本发明的实施例的动物子宫内膜损伤面积统计图。

具体实施方式

为了使本技术领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。

本发明提供了一种含有自体子宫内膜间充质干细胞外泌体的制剂，按照体积份数比，包括5份间充质干细胞外泌体以及95份基质溶液，按照体积份数比，基质溶液包括95-99份复方电解质注射液以及1-5份药用人血白蛋白，间充质干细胞外泌体通过自体子宫内膜间充质干细胞饥饿培养所得，饥饿培养时间为12-24小时，自体子宫内膜间充质干细胞提取自人子宫内膜的间充质干细胞，按照正常培养的方法进行培养得到，培养时间为48-72小时。

根据上述实施例，优选地，基质溶液的ph值为6.0-8.0。

根据上述实施例，优选地，复方电解质注射液为复方电解质葡萄糖mg3注射液。

根据上述实施例，优选地，药用人血白蛋白为奥地利百特公司所生产。

根据上述实施例，优选地，其用于治疗子宫内膜损伤等用途。

一种含有自体子宫内膜间充质干细胞外泌体的制剂的制备方法，包括以下步骤：

实施例1：

(1)自体子宫内膜间充质干细胞的培养：从细胞库中选取自人子宫内膜的间充质干细胞进行复苏，用无酚红dmem/df12和体积比浓度为10％胎牛血清做完全培养基，放入t75细胞培养瓶在37℃、5％co2条件下进行培养；

(2)间充质干细胞外泌体的制备：待细胞生长程度达到70％-80％，使用生理盐水清洗细胞2-4次，用复方电解质注射液进行饥饿培养12小时，待细胞生长程度达到90％后，收取细胞培养上清液，并采用外泌体提取试剂盒对间充质干细胞外泌体进行提取，按照质量体积比2％加入人血清白蛋白，混合均匀后待用；

(3)基质溶液的制备：按配比，将药用人血白蛋白，按照质量体积比2％溶于复方电解质注射液中，配制成均一的基质溶液待用；

(4)制备腔内注射制剂：按照体积份数比，选取95份基质溶液以及5份间充质干细胞外泌体，进行充分混合搅拌，待混合均匀后，分装到无菌保存管中，放入-80℃冰箱中冷冻待用。

实施例2：

(1)自体子宫内膜间充质干细胞的培养：从细胞库中选取自人子宫内膜的间充质干细胞进行复苏，用无酚红dmem/df12和体积比浓度为10％胎牛血清做完全培养基，放入t75细胞培养瓶在37℃、5％co2条件下进行培养；

(2)间充质干细胞外泌体的制备：待细胞生长程度达到70％-80％，使用生理盐水清洗细胞2-4次，用复方电解质注射液进行饥饿培养16小时，待细胞生长程度达到90％后，收取细胞培养上清液，并采用外泌体提取试剂盒对间充质干细胞外泌体进行提取，按照质量体积比3％加入人血清白蛋白，混合均匀后待用；

(3)基质溶液的制备：按配比，将药用人血白蛋白，按照质量体积比3％溶于复方电解质注射液中，配制成均一的基质溶液待用；

(4)制备腔内注射制剂：按照体积份数比，选取95份基质溶液以及5份间充质干细胞外泌体，进行充分混合搅拌，待混合均匀后，分装到无菌保存管中，放入-80℃冰箱中冷冻待用。

实施例3：

(1)自体子宫内膜间充质干细胞的培养：从细胞库中选取自人子宫内膜的间充质干细胞进行复苏，用无酚红dmem/df12和体积比浓度为10％胎牛血清做完全培养基，放入t75细胞培养瓶在37℃、5％co2条件下进行培养；

(2)间充质干细胞外泌体的制备：待细胞生长程度达到70％-80％，使用生理盐水清洗细胞2-4次，用复方电解质注射液进行饥饿培养24小时，待细胞生长程度达到90％后，收取细胞培养上清液，并采用外泌体提取试剂盒对间充质干细胞外泌体进行提取，按照质量体积比4％加入人血清白蛋白，混合均匀后待用；

(3)基质溶液的制备：按配比，将药用人血白蛋白，按照质量体积比4％溶于复方电解质注射液中，配制成均一的基质溶液待用；

(4)制备腔内注射制剂：按照体积份数比，选取95份基质溶液以及5份间充质干细胞外泌体，进行充分混合搅拌，待混合均匀后，分装到无菌保存管中，放入-80℃冰箱中冷冻待用。

实施例4

(1)选取7周龄的sd大鼠12只，平均分为3组，①空白组；②阴性对照组；③实验组制备大鼠子宫内膜损伤模型。

(2)造模成功后，按照①空白组在子宫内膜腔内注射生理盐水；②阴性对照组在子宫内膜腔内注射基质溶液；③实验组在子宫内膜腔内注射间充质干细胞外泌体注射液进行治疗，分别在给药后的第1、3、5、7、9、天进行数据测量，并统计。

(3)数据分析，分析各实验组伤口愈合的时间差异。

外泌体是由细胞分泌的直径为30～150nm的小囊泡，内含来源于细胞相关的蛋白质与核苷酸等生物分子，在细胞交流间起重要作用。

外泌体是细胞分泌的小生物膜囊泡。与间充质干细胞相比，外泌体体积更小、复杂性更低，易于生产和存储，质干细胞外泌体富含生物活性分子，如蛋白质和rna；存在于外泌体中的许多蛋白质都属于酶类，具有催化活性，间充质干细胞外泌体没有细胞的活性，并且不存在形成肿瘤的风险；此外，由于膜结合蛋白含量较低，外泌体的免疫原性低于间充质干细胞；间充质干细胞外泌体对维持细胞内稳态以及对外界刺激作出反应起到了重要的作用；当组织微环境稳态因疾病或损伤而遭到破坏时，这种作用就显得更加重要了；目前间充质干细胞分泌的外泌体的治疗效果越来越得到认可，且外泌体的使用比干细胞更方便且成本更低，相对于细胞的使用外泌体的接受度也更大。

本发明的有益效果是：将间充质干细胞外泌体混合到基质溶液中，使得外泌体的活性及功能得到了保存和利用，而且存活的时间可以更长，可达到长时间促进表皮细胞增长，消除炎症，快速修复内膜损伤重建，从而实现子宫内膜结构和功能的恢复。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。