PseurotinA在制备防治骨质疏松药物方面的应用的制作方法

本发明属于骨疾病治疗技术领域，尤其涉及pseurotina在制备防治骨质疏松药物方面的应用。

背景技术：

骨骼系统的稳态依赖于骨形成与骨吸收之间的动态平衡，两者独立存在又彼此协同。成骨细胞的骨形成与破骨细胞的骨吸收之间的平衡对于骨稳态具有重要意义。其中，破骨细胞参与的骨吸收过程介导了一些骨代谢疾病的发生，其中较为常见的是骨质疏松症。骨质疏松症是一种表现为破骨细胞骨吸收大于成骨细胞骨形成为特征的骨代谢性疾病，多见于绝经期妇女。雌激素减退所致的破骨细胞过度活跃是导致绝经期妇女骨质疏松的首要原因，雌激素减退导致的氧化应激水平上升也是骨质疏松重要的发病原因。其中，因骨质疏松骨折所带来的高致死率和致残率也给社会和个人带来巨大的负担。

破骨细胞是来源于的单核/巨噬细胞系分化而来的多核细胞。它的形成依赖于核因子受体激活因子κb配体(rankl)和巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)的共同刺激与诱导。nf-κb和mapk(erk/p38/jnk)通路是介导破骨细胞形成和活化的关键通路。rankl是促进破骨细胞分化和活化的重要因子，是破骨细胞分化和活化必不可少的一环。它通过与破骨细胞前体细胞胞膜上的受体rank激活多条下游通路如mapks(p38，jnk和erk)和nf-κb通路并最终导致破骨细胞最重要的转录因子nfatc1激活。nfatc1下游所调控的破骨细胞特征性基因如atp6v0d2和ctsk的表达。目前临床上常用的抗骨松药物治疗都有着各种不同程度的副反应。因此，寻找有效的防治骨质疏松症的药物具有重大意义。因此，能够有效抑制破骨细胞相关通路及氧化应激水平是防治骨质疏松的关键。

pseurotina(以下简称pse)是最早分离于烟曲霉菌(aspergillusfumigatus)的二次代谢产物，分子式为c22h25no8，分子量431.4。pse新近研究报道了该化合物具有良好的抗菌、抗肿瘤及抗氧化作用。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供pseurotina在制备防治骨质疏松药物方面的应用，这为骨质疏松疾病治疗提供了新的方案，也为深入开发天然活性成分开辟了新途径。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

pseurotina在制备防治骨质疏松药物方面的应用。

骨质疏松由破骨细胞过度活跃所致。

破骨细胞过度活跃由雌激素减退引起。

雌激素减退源于卵巢去除。

目前，pseurotina在骨质疏松疾病中的作用还没有被报道。发明人首次发现，pse可以通过抑制rankl诱导的氧化应激及下游的nfatc1信号进而抑制破骨细胞的形成和功能。抗酒石酸酸性染色法表明，pse可以有效抑制破骨细胞的形成，并且呈剂量依赖性；功能鉴定显示，破骨细胞在羟基磷灰石板中骨吸收功能也明显受药物作用而被有效抑制。此外，实时定量pcr检测结果表明破骨细胞特征性的基因如cathepsink(ctsk)和v-atpase-d2(atp6v0d2)均被pse抑制。据此，进一步研究提示，pse通过影响mapks(p38，jnk和erk)通路、nf-κb通路及抗氧化应激作用最终影响nfatc1信号进而影响破骨细胞的形成和功能。此外，在动物实验中，去卵巢诱发了小鼠骨质疏松的发生，而pse有效地抑制了破骨细胞的形成进而防止小鼠的骨量丢失，骨组织冰冻切片氧化应激荧光信号成像也进一步证实了pse在体内的抗氧化作用。因此，pseurotina作为抑制破骨细胞的有效药物在骨质疏松症的治疗中具备极大潜力。

附图说明

图1是pse显著抑制rankl诱导的破骨细胞形成并且具有剂量依赖性的试验结果图，图中：apse的化学结构式，bpse对细胞的毒性测试结果，cpse作用于破骨细胞分化后的抗酒石酸酸性磷酸酶(tracp)染色结果，d图ctracp染色后破骨的定量统计结果。

图2是pse有效抑制破骨细胞的骨吸收功能的试验结果图，图中：apse作用于骨吸收板(羟基磷灰石板)中破骨细胞分化后的tracp染色和骨吸收情况，b骨吸收板中破骨细胞数量的定量计数结果，c平均单个破骨细胞骨吸收区域面积的定量统计结果。

图3是pse有效抑制破骨细胞的特征基因和蛋白表达的试验结果图，图中：a破骨细胞特征性基因nfatc1的表达水平在pse干预后的定量统计结果，b破骨细胞特征性基因atp6v0d2的表达水平在pse干预后的定量统计结果，c破骨细胞特征性基因ctsk的表达水平在pse干预后的定量统计结果，d破骨细胞特征性蛋白nfatc1、cathepsink和v-atpase-d2在pse干预后的蛋白印迹试验结果，enfatc1蛋白印迹条带强度的定量统计结果，fcathepsink蛋白印迹条带强度的定量统计结果，gv-atpase-d2蛋白印迹条带强度的定量统计结果，hpse干预下nfatc1荧光素酶报告基因测定结果

图4是pse通过影响nf-κb通路和mapk通路的试验结果图，图中：apse干预erk\p38\jnk磷酸化蛋白印迹试验结果，biκb-α蛋白印迹条带强度的定量统计结果，c磷酸化p38蛋白印迹条带强度的定量统计结果，d磷酸化erk蛋白印迹条带强度的定量统计结果，e磷酸化jnk蛋白印迹条带强度的定量统计结果，fpse干预下nf-κb荧光素酶报告基因测定结果。

图5是pse有效清除rankl诱导下破骨细胞分化过程中产生的氧自由基的试验结果图，图中：a细胞在rankl诱导后并且在pse干预后胞内氧自由基的荧光信号图，b不同组中随机氧自由基荧光强度的定量统计结果，c不同组中随机视野中荧光信号阳性的细胞数量，d假手术组、ovx组及ovx+pse组胫骨冰冻切片的氧自由基荧光信号图，gp，growthplate(生长板)；tb，trabecularbone(松质骨)；bm，bonemarrow(骨髓)；e三组切片氧自由基信号强度定量统计结果。

图6是pse通过减少体内破骨细胞形成预防雌激素减退导致的骨质疏松结果图，图中：a假手术组、ovx组及ovx+pse组股骨的micro-ct的扫描重建图，bct重建分析后骨量指标bv/tv的数据分析结果，cct重建分析后骨量指标tb.th的数据分析结果，dct重建分析后骨量指标conn.dn的数据分析结果，ect重建分析后骨量指标tb.n的数据分析结果，f股骨石蜡切片tracp染色结果，g组织学分析后骨量指标bv/tv(bonevolume/tissuevolume，骨体积/组织体积)的数据分析结果，h组织学分析后单位面积骨小梁上破骨细胞数量的统计结果。

具体实施方式

一、材料

pseurotina购自上海臻准生物科技有限公司，在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中的浓度为1mmol/l时制备。α-最小必需培养基(α-mem)，胎牛血清(fbs)，破骨细胞f环染剂rhodaminephalloidin，细胞活性氧(ros)探针(fluo-4and2’，7’-dichlorodihydrofluoresceindiacetate，h2dcfda)购自澳大利亚赛默飞世尔科技公司。在体活性氧探针dihydroethidium(dhe)购自美国apex生物科技公司。蛋白印迹(westernblot)实验中的nfatc1、cathepsink、v-atpase-d2、c-fos、iκb-α、erk、磷酸化(p)erk、jnk、磷酸化(p)erk和β-actin等抗体购自美国santacruzbiotechnology。mts试剂盒、荧光素酶检测试剂盒购自promega(悉尼，澳大利亚)。实验所应用重组rankl蛋白的表达和纯化于西澳大学医学院徐家科教授实验室完成。巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)购自r&d公司。

二、方法

1.pse抑制破骨细胞分化实验

将取自c57bl/6小鼠新鲜分离的骨髓巨噬细胞(bmms)以6×10³个细胞/孔的密度种入96孔培养板中。用包含m-csf(50ng/ml)和rankl(100ng/ml)的完整培养基(含α-mem和10％胎牛血清)培养，同时予以用不同梯度浓度(0，2.5，5，7.5，10μmol/l)的pse对细胞进行处理。细胞培养液每2天更换一次直到破骨细胞形成。用4％多聚甲醛固定10min，用pbs洗涤3次，对细胞进行抗酒石酸酸性磷酸酶(tracp)的染色(37℃孵育30分钟)，其中tracp阳性多核细胞(＞3核)鉴定为破骨细胞并对各个不同梯度浓度pse作用下的破骨细胞数量进行计数、比较。

2.pse细胞毒性测试

将bmms以6×10³个/孔接种于96孔板中，留置过夜使细胞贴壁。次日，按上述浓度将pse加入细胞培养基共同孵育48小时。孵育结束后加入20μl/孔的mts溶液，与细胞共孵育2h后在用全自动定量酶标仪(bmg，德国)在490nm分光光度处读读取吸光度。比较吸光度值分析pse对细胞有无毒性作用。

3.pse对破骨细胞骨吸收功能抑制实验

采用羟基磷灰石板吸收法评价破骨细胞骨吸收功能。

首先，将bmms(1×10⁵细胞/孔)在6孔胶原包被板(bdbiocoat，thermofisher，score，澳大利亚)中培养。用50ng/mlrankl和50ng/mlm-csf刺激细胞，直至破骨细胞形成早期阶段(少量多核细胞)。然后，使用细胞解离溶液(sigma-aldrich，symmid，澳大利亚)将细胞轻轻地从平板上分离。将相同数量的成熟破骨细胞接种到羟基磷灰石涂层96孔板中的各个孔中(corning，美国)，继续予m-csf和rankl刺激并予不同浓度(0，5，10μmol/l)pse干预直至对照孔(未加pse组)形成成熟破骨细胞。将每组一半的孔进行tracp以用于破骨细胞计数，其余一般除去细胞以测量羟基磷灰石吸收区域，拍照并用imagej软件分析破骨细胞吸收面积并进行组间比较。

4.pse体外抗氧化试验

将bmms以5×10³细胞/孔接种于96孔板后予以50ng/mlrankl刺激并以不同浓度(0，5，10μmol/l)pse干预24小时后使用细胞内氧自由基探针2’，7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯(h2dcfda，20μmol/l)孵育30分钟后使用hanks平衡盐溶液洗涤细胞3次，通过nikonalsi共聚焦显微镜在488nm的激发波长和538nm的发射波长下测量荧光强度，并进行分析比较不同组别之间的荧光信号强度以比较细胞内氧自由基水平。

5.nf-κb和nfatc1荧光素酶报告基因检测

为了检测nf-κb和nfatc1转录激活情况，使用raw264.7细胞分别稳定转染nf-κb和nfatc1应答荧光素酶报告结构。转染细胞在密度分别为5×10⁴/孔和1.5×10⁵个/孔的48孔板中培养，用不同浓度的pse预处理1h后用rankl(50ng/ml)分别刺激细胞6小时和24小时，最后根据制造商提供的说明书使用荧光素酶报告系统检测荧光素酶活性(promega，澳大利亚悉尼)。

6.实时定量聚合酶链式反应(pcr)分析

将bmms以1×10⁵细胞/孔接种于6孔板，细胞贴壁后用50ng/mlrankl和50ng/mlm-csf刺激细胞加以pse干预，直至成熟破骨细胞形成。使用trizol试剂从细胞中分离出总rna并用1μgrna模板和具有寡核苷酸引物的逆转录酶逆转录单链cdna。

聚合酶链式反应扩增特异性序列采用以下程序：94℃连续5min，94℃30次，40s，60℃40s，72℃40s，72℃最后延伸5min，72℃，最后延伸5min。

破骨细胞相关基因的特异性引物序列如下：

ntatc1

forward：5’-caacgccctgaccaccgatag-3’(seq.id.no.1)，

reverse：5’-ggctgccttccgtctcatagt-3’(seq.id.no.2)；

atp6v0d2

forward：5’-gtgagaccttggaagacctgaa-3’(seq.id.no.3)，

reverse：5’-gagaaatgtgctcaggggct-3’(seq.id.no.4)；

ctsk

forward：5’-gggagaaaaacctgaagc-3’(seq.id.no.5)，

reverse：5’-attctggggactcagagc-3’(seq.id.no.6)；

hprt1

forward：5’-tcagtcaacgggggacataaa-3’(seq.id.no.7)，

reverse：5’-ggggctgtactgcttaaccag-3’(seq.id.no.8)。

使用hprt1归一化法计算相对mrna水平。

7.蛋白质印迹分析试验

用放射免疫沉淀法(ripa)裂解缓冲液溶解细胞提取蛋白。蛋白质经sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转入聚偏氟乙烯(pvdf)膜(gehealthcare，澳大利亚)。在5％脱脂乳中封闭1小时后，在4℃下用各种特异性初级抗体在4℃孵育过夜，然后用辣根过氧化物酶(hrp)结合的次级抗体孵育膜。最后用增强化学发光试剂检测抗体反应性(美国药典生物技术公司)，使用imagequantlas4000(gehealthcare，澳大利亚)成像。

8.卵巢去除(ovariectomized，ovx)小鼠骨质疏松模型

动物实验由浙江大学医学院邵逸夫医院动物伦理委员会批准。将18只11周龄的c57/bl6小鼠随机分成3组：假手术组，ovx组和ovx+pse(5mg/kg)组，每组6只。ovx组和ovx+pse组均进行双侧卵巢切除手术，假手术组仅做简单卵巢暴露后缝合。手术后所有小鼠恢复1周。ovx+pse组小鼠予腹腔注射pse(5mg/kg)，每两天1次，持续6周，另外两组仅予腹腔注射pbs作为对照。在处死前一天通过小鼠尾静脉注射氧化应激探针dhe，剂量为25mg/kg，100μl，6周后，处死所有小鼠并收集股骨放于10％中性福尔马林固定24小时后剔除软组织。将处理后的股骨装入2ml离心管后使用skyscanl176微型ct仪器扫描成像。然后使用nrecon软件重建图像并分析生长板上方0.5mm-1.5mm之间的感兴趣区域。ct分析完成后的股骨进行脱钙、脱水并包埋于石蜡中进行切片和染色。制备连续5μm厚的切片，使用tracp染色评价骨组织中破骨细胞的数量和分布。

胫骨取下后予4％多聚甲醛固定4小时后予以脱钙并包埋于oct(optimumcuttingtemperature)冰冻切片包埋剂。于冰冻切片机中低温进行切片。将切片水化、dapi染液(1∶5000)室温避光孵育30分钟、pbs洗3次后进行封片。封片后于激光共聚焦显微镜下观察骨组织冰冻切片氧化应激荧光信号成像。

9.统计

上述研究数据以平均值±标准偏差(sd)表示，比较采用单因素方差分析(anova)和两两比较检验后确定结果间差异的显著性，检验p值小于0.05认为比较存在显著性差异三、结果

1.pse可以显著抑制rankl诱导的破骨细胞形成并且具有剂量依赖性。

如图1所示，为了确定pse有无细胞毒性作用，将不同浓度(2.5、5、7.5、10μmol/l)的pse加入bmms孵育培养后进行mts试验，结果表明pse在各浓度下均未见毒性作用(图1b)。为了明确pse对破骨细胞分化的影响，pse抑制破骨细胞分化实验中，予rankl和m-csf共同刺激诱导bmms分化破骨细胞的同时加入了不同浓度的pse(2.5、5、7.5、10μmol/l)进行干预，结果显示pse在浓度为2.5μmol/l时即出现对破骨细胞分化的抑制作用，tracp染色后可见加药组多核细胞明显减少，并且该抑制作用呈现剂量依赖性(图1c，d)。

2.pse有效抑制破骨细胞的骨吸收功能。

为了评价pse对破骨细胞的骨吸收功能影响，本发明采用羟基磷灰石板检测破骨细胞的骨吸收活性。如图2所示，在pse的干预下，tracp染色后可见成熟破骨细胞数量较对照组减少(图2a，b)，相应的骨吸收面积也明显减少(图2)并且平均每个破骨细胞的骨吸收区域面积也减少(图2c)。因此，pse在抑制破骨细胞形成和分化的同时也抑制了破骨细胞的骨吸收功能。

3.pse有效抑制破骨细胞的特征基因及蛋白的表达。

为了进一步研究pse在破骨细胞形成和活化过程中对rankl诱导的基因表达的影响。本发明用实时定量聚合酶链式反应rt-pcr方法和蛋白印迹westernblot方法分析了pse对rankl和m-csf作用5天后bmms的基因水平和蛋白表达水平。如图3所示，pse干预后，破骨细胞分化相关基因如nfatc1，atpv0d2，和ctsk的mrna表达水平明显下调(图3a，b，c)。蛋白印迹试验也表明该基因相对应的蛋白表达水平也受到了pse的抑制(图3d)，条带强度的统计学比较结果有显著性差异(图3e，f，g)。进一步，荧光素酶报告基因试验结果也表明破骨细胞分化的主要调控因子nfatc1的转录活性也被pse抑制。该研究结果与pse对破骨细胞分化和骨吸收的抑制作用相一致。

4.pse通过影响nf-κb通路和mapk通路(磷酸化erk/p38/jnk)抑制破骨细胞。

在蛋白印迹试验中，选取rankl刺激bmms的不同时间(0，10，20，30，60分钟)后，裂解后提取蛋白进行分析。如图4所示，结果表明，经过pse预刺激后的实验组中，iκb-α的正常水解受到了抑制(图4a)，在rankl刺激后iκb-α磷酸化而水解，因此表达量随时间先下降后上升，而被pse干预后iκb-α的水解收到了抑制，该抑制作用存在显著性差异(图4b)。相似地，在rankl刺激后，erk，p38和jnk的磷酸化水平随时间上升，而在pse干预后磷酸化水平分别收到不同程度的抑制(图4a)，该抑制作用统计学结果均有显著性差异(图4b，c，d)。在荧光素酶报告基因测定结果中发现，转染了nf-κb荧光酶报告基因的细胞系在受到pse干预后，rankl刺激下的nf-κb转录活性受到抑制(图4f)。

5.pse抑制rankl诱导的破骨细胞分化过程中产生的氧自由基并且可以降低去卵巢小鼠骨环境中的氧化应激水平

rankl诱导bmms过程中产生的氧自由基是重要的破骨细胞分化的信号。pse抗氧化试验显示，rankl诱导产生的氧自由基可以被pse显著抑制(图3a)，表现为随机视野中氧自由基的荧光信号总强度(图3b)和平均单个细胞的氧自由基荧光信号强度(图3c)。此外，在去卵巢(ovx)小鼠骨质疏松模型中，去卵巢小鼠组表现为氧化应激水平升高，而在pse治疗干预后，氧化应激水平得到有效的抑制(图5d)，这种抑制有统计学差异(图5e)。

6.pse有效抑制去卵巢小鼠体内的破骨细胞形成进而预防去卵巢小鼠的骨量丢失

去卵巢后小鼠的股骨的骨量在ct扫描重建分析后可见明显下降，而在pse注射治疗后，骨量丢失得到了有效的防止(图6a)，ct重建分析的骨量指标包括bv/tv(bonevolume/tissuevolume，骨体积/组织体积)，tb.th(trabecularthickness，骨小梁厚度)，conn.dn(connectivitydensity，骨小梁连接紧密度)，tb.n(trabecularnumber，骨小梁数量)分析结果均有统计学结果，f小鼠股骨中的破骨细胞通过石蜡切片的tracp染色进行评估。可以发现去卵巢小鼠组中的破骨细胞数量明显增多，骨量减少(图6f)，g组织学分析后骨量指标bv/tv(bonevolume/tissuevolume，骨体积/组织体积)(图6g)和单位面积骨小梁上破骨细胞数量(图6h)有显著性统计学差异。

序列表

<110>广西医科大学

<120>pseurotina在制备防治骨质疏松药物方面的应用

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

caacgccctgaccaccgatag21

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ggctgccttccgtctcatagt21

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

gtgagaccttggaagacctgaa22

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gagaaatgtgctcaggggct20

<210>5

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

gggagaaaaacctgaagc18

<210>6

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

attctggggactcagagc18

<210>7

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

tcagtcaacgggggacataaa21

<210>8

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

ggggctgtactgcttaaccag21