本发明涉及医用生物材料
技术领域：
，尤其涉及一种可降解人工骨及其制备方法。
背景技术：
：人工合成的骨替代材料即人工骨是近年来研究的热点，其不受供体来源的限制，且材料能够根据不同需要改变。理想的人工骨材料应具有以下特点：①生物向生物相容性好；②可降解，且降解产物对人体无害，材料降解速度与新生骨的功能发挥尽可能相匹配；③同时具有骨传导和骨诱导活性；④良好的可塑形；⑤较高且均匀的孔隙率；⑥一定的力学强度。1992年，法国的lopez首先发现珍珠层具有诱导成骨的作用，此后的大量研究表明，这种材料具有良好的生物相容性，并具有骨诱导和骨传导活性。但是随着研究的深入，人们发现这种材料的降解过程较长，这主要与珍珠层材料的理化性质及形态大小有关。而珍珠层的生物降解主要是建立在非特异性的理化溶解方式上，通过活性细胞介导的吸收方式降解有限。随着材料学的不断发展，纳米技术制备的人工骨随之诞生，有学者采用纳米珍珠层粉制备人工骨，由于纳米粒子所具有的量子尺寸效应、小尺寸效应、表面效应和宏观量子隧道效应的特点，其降解性能得到的相应的提高。汤勇智(2009)等用纳米珍珠层粉和消旋聚乳酸制备复合人工骨，具有良好的生物相容性和降解特性，但是聚乳酸水解后的乳酸有降低周围环境ph值从而导致机体炎症的风险。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种可降解人工骨的制备方法，通过本发明所公开的方法得到的人工骨，具有优良的生物相容性和机械强度，最重要的，具有适宜的降解速率，降解产物在人体内安全无毒。本发明公开的可降解人工骨的制备方法，以纳米珍珠层粉、聚己内酯(pcl)-聚乙烯吡咯烷酮(pvp)共聚物作为主要原料。珍珠层已经被证实具有良好的机械性、生物相容性、骨传导性和成骨特性，并且血管化作用比较肯定，但其降解过程较缓慢，将珍珠层粉纳米化后，能够改善其降解表现。pcl是一种常用的半结晶型、可生物吸收的热塑性生物医药合成材料，具有良好的柔韧性和降解行为，但由于水溶性不好，导致其生物相容性较差，因此，本发明采用pcl与水溶性高分子生物材料pvp共聚，得到的共聚物具有良好的水溶性。本发明以pcl-pvp共聚物与纳米珍珠层粉为原料制备复合人工骨，得到的人工骨具有极好的亲水性，能够进一步促进人工骨的降解。具体的，本发明采取以下的技术方案：一种可降解的人工骨，其原料采用纳米珍珠层粉、聚己内酯(pcl)-聚乙烯吡咯烷酮(pvp)共聚物，所述纳米珍珠层粉与pcl-pvp共聚物的重量比为10：1～1：1。优选的，所述pcl-pvp共聚物由pcl和n-乙烯基吡咯烷酮(nvp)在交联剂的作用下制备而成。优选的，所述的pcl-pvp共聚物的制备方法为，将nvp、pcl溶于二氯甲烷中，加入交联剂，在室温下搅拌至溶液无浑浊；将所得溶液浇铸在平板上，室温下挥干溶剂成膜，35～50℃下真空干燥至恒重，粉碎，即得。进一步优选的，共聚物中pcl的质量分数为5％～25％；进一步优选的，所述交联剂为京尼平、n,n-亚甲基双丙烯酰胺(nmba)、戊二醛(gda)中的一种。优选的，所述人工骨所用纳米珍珠层粉的粒度范围为20～100nm。优选的，所述可降解人工骨的具体制备步骤为：①pcl-pvp共聚物加水溶胀后，搅拌下加入纳米珍珠层粉，继续搅拌10～20min后，加入nh4hco3，转移到水浴中40～70℃保温搅拌10～30min，得浆料；②上述浆料浇铸至模具中，室温下放置成型；③将上述成型后的半成品与模具分离后，置冷冻干燥机中干燥；④将干燥后的固体置去离子水中浸泡1～3d，浸泡期间定时换水，取出晾干后得固态人工骨。进一步优选的，步骤②中nh4hco3的用量为浆料重量的1％～10％。进一步优选的，步骤④中冷冻干燥的参数为：在-40～-85℃预冻5～12h，抽真空，使真空度为0.1～0.2mbar，于-30～-80℃升华干燥10～30h；升温至-10～-40℃，继续干燥4～12h。通过以上技术方案，本发明所取得的有益效果包括：首先，本发明采用纳米珍珠层粉及pcl-pvp共聚物作为人工骨的原料，其中pcl-pvp共聚物中的pvp进一步改善了pcl的亲水性，使得pcl的生物相容性更好；而pcl-pvp共聚物进一步改善了纳米珍珠层粉的表面活性，所得的人工骨有适宜地降解速率，与新生骨的功能发挥得到了尽可能地匹配，并且降解产物不会对机体产生影响。其次，本发明采用气体致孔的方法，以nh4hco3作为致孔剂，相对于其他致孔剂如氯化钠来说，致孔剂去除更加完全，所得到的人工骨的孔隙率更高，且孔径更加均匀。最后，本发明采用冷冻干燥技术制备人工骨，低温条件能够更好的保持原材料的生物活性。具体实施方式下面通过实施例对本发明进一步说明，但这些实施例仅用于解释本发明，并非对本发明的具体限定。以下各实施例中，如无特殊说明，所涉及的试剂均为生化试剂或分析纯试剂，可以通过商品渠道购买得到。以下各实施例中，如无特殊说明，所涉及的实验方法为常规的实验方法，可以在教科书或工具书中查询得到。实施例1可降解人工骨的制备1.制备的pcl-pvp共聚物。按重量比9：1称取pcl、nvp，溶于二氯甲烷中，加入京尼平，在室温下搅拌至溶液无浑浊；将所得溶液浇铸在平板上，室温下挥干溶剂成膜，40℃下真空干燥至恒重，粉碎，即得。2.制备浆料。将步骤1所得的pcl-pvp共聚物加水溶胀，搅拌下加入纳米珍珠层粉(平均粒径50nm)，继续搅拌16min后，加入8％的nh4hco3，转移至水浴中，于56℃保温搅拌16min，得浆料。3.成型。将浆料浇铸至模具中，室温下放置成型。4.冷冻干燥。将成型后的半成品与模具分离，置冷冻干燥机中，-55℃预冻8h，抽真空，使真空度为0.1mbar，于-60℃升华干燥24h；升温至-30℃，继续干燥6h。5.将干燥后的半成品置去离子水中浸泡2d，浸泡期间定时换水，取出晾干后，既得人工骨。实施例2可降解人工骨的制备1.制备的pcl-pvp共聚物。按重量比10：1称取pcl、nvp，溶于二氯甲烷中，加入n,n-亚甲基双丙烯酰胺(nmba)，在室温下搅拌至溶液无浑浊；将所得溶液浇铸在平板上，室温下挥干溶剂成膜，45℃下真空干燥至恒重，粉碎，即得。2.制备浆料。将步骤1所得的pcl-pvp共聚物加水溶胀，搅拌下加入纳米珍珠层粉(平均粒径65nm)，继续搅拌15min后，加入5％的nh4hco3，转移至水浴中，于60℃保温搅拌20min，得浆料。3.成型。将浆料浇铸至模具中，室温下放置成型。4.冷冻干燥。将成型后的半成品与模具分离，置冷冻干燥机中，-50℃预冻7h，抽真空，使真空度为0.15mbar，于-65℃升华干燥20h；升温至-30℃，继续干燥7h。5.将干燥后的半成品置去离子水中浸泡2d，浸泡期间定时换水，取出晾干后，既得人工骨。实施例3可降解人工骨的制备1.制备的pcl-pvp共聚物。按重量比19：1称取pcl、nvp，溶于二氯甲烷中，加入戊二醛，在室温下搅拌至溶液无浑浊；将所得溶液浇铸在平板上，室温下挥干溶剂成膜，50℃下真空干燥至恒重，粉碎，即得。2.制备浆料。将步骤1所得的pcl-pvp共聚物加水溶胀，搅拌下加入纳米珍珠层粉(平均粒径20nm)，继续搅拌20min后，加入10％的nh4hco3，转移至水浴中，于70℃保温搅拌30min，得浆料。3.成型。将浆料浇铸至模具中，室温下放置成型。4.冷冻干燥。将成型后的半成品与模具分离，置冷冻干燥机中，-40℃预冻12h，抽真空，使真空度为0.2mbar，于-30℃升华干燥30h；升温至-10℃，继续干燥12h。5.将干燥后的半成品置去离子水中浸泡3d，浸泡期间定时换水，取出晾干后，既得人工骨。实施例4可降解人工骨的制备1.制备的pcl-pvp共聚物。按重量比3：1称取pcl、nvp，溶于二氯甲烷中，加入n，n-亚甲基双丙烯酰胺(nmba)，在室温下搅拌至溶液无浑浊；将所得溶液浇铸在平板上，室温下挥干溶剂成膜，40℃下真空干燥至恒重，粉碎，即得。2.制备浆料。将步骤1所得的pcl-pvp共聚物加水溶胀，搅拌下加入纳米珍珠层粉(平均粒径100nm)，继续搅拌10min后，加入1％的nh4hco3，转移至水浴中，于40℃保温搅拌10min，得浆料。3.成型。将浆料浇铸至模具中，室温下放置成型。4.冷冻干燥。将成型后的半成品与模具分离，置冷冻干燥机中，-85℃预冻5h，抽真空，使真空度为0.1mbar，于-80℃升华干燥10h；升温至-40℃，继续干燥4h。5.将干燥后的半成品置去离子水中浸泡1d，浸泡期间定时换水，取出晾干后，既得人工骨。实施例5可降解人工骨的制备1.制备的pcl-pvp共聚物。按重量比8：1称取pcl、nvp，溶于二氯甲烷中，加入京尼平，在室温下搅拌至溶液无浑浊；将所得溶液浇铸在平板上，室温下挥干溶剂成膜，45℃下真空干燥至恒重，粉碎，即得。2.制备浆料。将步骤1所得的pcl-pvp共聚物加水溶胀，搅拌下加入纳米珍珠层粉(平均粒径80nm)，继续搅拌15min后，加入6％的nh4hco3，转移至水浴中，于60℃保温搅拌15min，得浆料。3.成型。将浆料浇铸至模具中，室温下放置成型。4.冷冻干燥。将成型后的半成品与模具分离，置冷冻干燥机中，-45℃预冻10h，抽真空，使真空度为0.15mbar，于-65℃升华干燥18h；升温至-40℃，继续干燥8h。5.将干燥后的半成品置去离子水中浸泡1d，浸泡期间定时换水，取出晾干后，既得人工骨。实施例6可降解人工骨的制备1.制备的pcl-pvp共聚物。按重量比16：1称取pcl、nvp，溶于二氯甲烷中，加入京尼平，在室温下搅拌至溶液无浑浊；将所得溶液浇铸在平板上，室温下挥干溶剂成膜，45℃下真空干燥至恒重，粉碎，即得。2.制备浆料。将步骤1所得的pcl-pvp共聚物加水溶胀，搅拌下加入纳米珍珠层粉(平均粒径60nm)，继续搅拌15min后，加入8％的nh4hco3，转移至水浴中，于55℃保温搅拌20min，得浆料。3.成型。将浆料浇铸至模具中，室温下放置成型。4.冷冻干燥。将成型后的半成品与模具分离，置冷冻干燥机中，-80℃预冻6h，抽真空，使真空度为0.15mbar，于-80℃升华干燥12h；升温至-20℃，继续干燥10h。5.将干燥后的半成品置去离子水中浸泡2d，浸泡期间定时换水，取出晾干后，既得人工骨。实施例7可降解人工骨的制备1.制备的pcl-pvp共聚物。按重量比12：1称取pcl、nvp，溶于二氯甲烷中，加入戊二醛，在室温下搅拌至溶液无浑浊；将所得溶液浇铸在平板上，室温下挥干溶剂成膜，40℃下真空干燥至恒重，粉碎，即得。2.制备浆料。将步骤1所得的pcl-pvp共聚物加水溶胀，搅拌下加入纳米珍珠层粉(平均粒径75nm)，继续搅拌16min后，加入8％的nh4hco3，转移至水浴中，于56℃保温搅拌16min，得浆料。3.成型。将浆料浇铸至模具中，室温下放置成型。4.冷冻干燥。将成型后的半成品与模具分离，置冷冻干燥机中，-55℃预冻8h，抽真空，使真空度为0.2mbar，于-60℃升华干燥24h；升温至-30℃，继续干燥6h。5.将干燥后的半成品置去离子水中浸泡3d，浸泡期间定时换水，取出晾干后，既得人工骨。实施例8可降解人工骨的制备1.制备的pcl-pvp共聚物。按重量比10：1称取pcl、nvp，溶于二氯甲烷中，加入n，n-亚甲基双丙烯酰胺(nmba)，在室温下搅拌至溶液无浑浊；将所得溶液浇铸在平板上，室温下挥干溶剂成膜，40℃下真空干燥至恒重，粉碎，即得。2.制备浆料。将步骤1所得的pcl-pvp共聚物加水溶胀，搅拌下加入纳米珍珠层粉(平均粒径30nm)，继续搅拌20min后，加入8％的nh4hco3，转移至水浴中，于56℃保温搅拌20min，得浆料。3.成型。将浆料浇铸至模具中，室温下放置成型。4.冷冻干燥。将成型后的半成品与模具分离，置冷冻干燥机中，-55℃预冻6h，抽真空，使真空度为0.1mbar，于-65℃升华干燥18h；升温至-35℃，继续干燥8h。5.将干燥后的半成品置去离子水中浸泡1d，浸泡期间定时换水，取出晾干后，既得人工骨。实施例9可降解人工骨的制备1.制备的pcl-pvp共聚物。按重量比10：1称取pcl、nvp，溶于二氯甲烷中，加入京尼平，在室温下搅拌至溶液无浑浊；将所得溶液浇铸在平板上，室温下挥干溶剂成膜，45℃下真空干燥至恒重，粉碎，即得。2.制备浆料。将步骤1所得的pcl-pvp共聚物加水溶胀，搅拌下加入纳米珍珠层粉(平均粒径75nm)，继续搅拌15min后，加入9％的nh4hco3，转移至水浴中，于60℃保温搅拌18min，得浆料。3.成型。将浆料浇铸至模具中，室温下放置成型。4.冷冻干燥。将成型后的半成品与模具分离，置冷冻干燥机中，-50℃预冻9h，抽真空，使真空度为0.15mbar，于-70℃升华干燥18h；升温至-40℃，继续干燥8h。5.将干燥后的半成品置去离子水中浸泡2d，浸泡期间定时换水，取出晾干后，既得人工骨。对比例1可降解人工骨的制备1.称取纳米珍珠层粉、氯化钠、消旋聚乳酸，加入到三氯甲烷中，稍作搅拌均匀，密封后，室温下静置24小时。2.打开容器，充分搅拌5min，然后放入37℃烘箱中，挥发三氯甲烷溶剂；取出，再次搅拌5min，再放入37℃烘箱中，挥发溶剂；如此反复进行，直至混合物呈糊状近无法搅拌状态。3.将上述混合物加压注入到人工骨模具中，然后放入37℃烘箱中，干燥约14小时，期间每小时反转模具一次。4.将烘箱温度上升至60℃，干燥1小时后取出，在10mpa压力下热压压紧成型，待温度自然降低后，将成型地人工骨取出，重新放入37℃烘箱中干燥24小时。5.将上述材料放入双蒸水中浸泡48小时，每6～8小时换液一次，用硝酸银溶液滴定，直至最后未见白色絮状物出现，说明其中的致孔剂氯化钠已经完全滤除。6.将上述材料放入37℃烘箱内干燥24小时，即得人工骨成品。对比例2可降解人工骨的制备按照实施例1中步骤2-5的操作方法，不同的在于所用的pvp、pcl与纳米珍珠层粉直接混合，并不包含nvp与pcl共聚的步骤。对比例3可降解人工骨的制备按照实施例1制备人工骨，不同的在于在步骤2中，采用珍珠层粉，而不是纳米珍珠层粉与pcl-pvp共聚物混合。试验例1孔隙大小孔隙率的测定孔隙大小测定方法：取样品制作成高约为3.0mm的圆柱体，在扫描电镜下观察，分别在多个视野中测算其同一方向的孔径大小，计算平均值，即平均孔径(孔隙率大小)孔隙率测定方法：25℃下，选用1个比重瓶，加满无水乙醇并称定质量(w1)；把质量为w0的样品浸入乙醇中，抽真空，使样品中的气体完全被乙醇取代，待比重瓶补满乙醇后称定质量(w2)；将浸透了乙醇的样品取出，称定剩余的乙醇与比重瓶的质量(w3)。按下列公式计算测得材料的孔隙率。分组及样品设置：取实施例1、实施例2得到的人工骨作为样品，以及对比例1～3制备得到的人工骨作为对照。每组分别平行测定5个样，结果取平均值。试验结果见表1.表1三种样品的孔隙率测试结果(，n＝5)分组平均孔径(μm)孔隙率(％)实施例1205.6±12.082.3±1.0实施例2214.9±26.380.4±0.8对比例1265.1±59.576.6±0.7对比例2293.8±62.167.9±1.8对比例3375.3±56.774.8±2.2由表1可见，以本发明提供的方法制备得到的人工骨其平均孔径和孔隙率均有明显的改善，具有较高的孔隙率和更加均匀的平均孔径，满足了良好的人工骨所需要的条件之一。试验例1人工骨力学性能测试取本发明实施例1、实施例2以及对比例1的方法制备的人工骨材料，作为样品，采用三点抗弯法，以万能试验机测定人工骨/支架材料的抗拉强度、抗弯强度和弹性模量，测试指点的跨距为25mm，加载速率为5.00mm/min。结果见表1。表1力学性能测试结果表(n＝10)组别抗拉强度(mpa)抗弯强度(mpa)弹性模量(gpa)实施例165.21±1.02154.63±1.1316.76±1.32实施例264.90±0.89156.85±1.4216.34±1.45对比例156.23±1.12118.30±1.5412.10±1.19由表1可见，本发明公开的方法制备的人工骨有较好的力学性能，并且根据资料，人体骨骼的弹性模量为17-18.9gpa，抗弯强度160mpa，本发明制备的人工骨材料极其接近这个数据，具有良好的机械强度。试验例2亲水性试验取实施例1、实施例2得到的人工骨作为样品，以及对比例1制备得到的人工骨作为对照。利用接触角测试仪测定水与样品及对照的接触角，以评价样品的亲水性结果显示，实施例1、实施例2所得到的人工骨的接触角分别为41.9°和45.8°，对比例1的人工骨材料的接触角测定结果为75.8°。生物材料的亲水性对细胞在材料表面的黏附、增殖、分化能力有重要影响，是体外实验中评价生物相容性的重要指标。接触角又称亲水角，是指在气、液、固三相交点处所作的气-液界面的切线穿过液体与固-液交界线之间的夹角θ，是对材料亲水性能的量度。本试验的结果表明本发明提供的方法所得到的人工骨具有良好的亲水性，即证明了其与对比例1比较具有更好的生物相容性。试验例3体外细胞相容性试验利用小鼠胚胎干细胞检测生物珊瑚人工骨材料的细胞生物相容性。主要试验材料及步骤如下：1.细胞传代培养：取c57小鼠胚胎干细胞(mescs)第2代传代细胞悬浮培养5d，经0.05％胰酶+0.02％edta消化后制成单细胞悬液，备用。2.人工骨材料准备：本发明实施例1、实施例2以及对比例1的方法制备的人工骨或支架，制成厚0.2cm，宽0.5cm的正方形片状，用蒸馏水超声下清洗45min，放入干燥箱干燥24h，高温高压消毒备用。3.将步骤1中的单细胞悬液分为试验组、空白组、对照组，其中试验组与实施例1、实施例2制备的人工骨混合培养，对照组与对比例1制备的人工骨混合培养，空白组继续单纯培养mescs细胞。分别于第2、4、6、8天行mtt法检测细胞增殖活性。选择490nm波长，以酶联免疫检测仪检测光密度值。4.试验结果：培养期内mtt法检测mescs细胞的增殖情况结果见表2。表2mtt法检测mescs细胞的增殖结果()注：*表示与空白组相比，p＜0.05；**表示与空白组比较，p＜0.01。由上表结果可知，实验组、对照组与空白组比较，在粘附培养早期，细胞增殖情况无显著性差异，表明在粘附培养早期本发明的人工骨材料对mescs增殖未产生不良影响；在粘附培养后期，实验组细胞增殖数据明显高于对照组和空白组，表明后期本发明的人工骨材料对mescs增殖具有促进作用。以上结果提示，本发明的人工骨材料具有良好的的细胞生物相容性，对细胞增殖无毒性作用。试验例4体外降解试验分组及样品设置：取实施例1、实施例2得到的人工骨作为样品，以及对比例1～3制备得到的人工骨作为对照，共5组材料。试验方法：将上述5组材料制作的大小统一、重量记为m0的试件分别置于初始ph为7.4的50ml模拟体液中，在37℃恒温箱中降解；每组材料制作10个平行样。分别于2，4，6，8，10，12，14，16周的同一时间，每组取出一份材料，大体观察试件的形态、颜色及光泽变化，测定各组浸泡液的ph值，同时，取试件干燥至恒重称重，记为mt。按照下式计算各组材料的体外降解的失重率。(1)大体观察结果：各组人工骨材料表面粗糙度随时间延长逐渐增加，呈蚕食样改变。以本发明的人工骨材料为观察对象，在第4周时，本发明的人工骨材料表面粗糙、有细颗粒样材料溶出；第10周时，材料的边缘及表面有小片状剥脱；第14周时，材料的边缘及表面剥脱的颗粒增多，并出现少许裂缝；16周时，材料仍可保持原有的形态轮廓，但裂缝变宽，孔隙增大。以对比例2的人工骨材料为观察对象，在第4周时，即出现边缘剥落现象，到第16周，材料已经出现裂缝，甚至部分脱落。以对比例3的人工骨为观察对象，同样在第5周时也出现了边缘脱落现象，至第14周，材料出现宽度较大的裂缝；第16周，出现了部分脱落现象，材料已经难以保持原有的形状了。(2)不同材料在模拟体液中失重率(降解率)的变化见表3。表3不同材料在模拟体液中降解率的变化组别第2周第4周第8周第12周第16周试验例16.51±0.1614.59±0.7819.15±0.3228.77±0.2535.29±0.17试验例26.56±0.1814.68±0.4319.74±0.2829.36±0.2936.77±0.46对比例18.37±0.0318.05±0.8728.35±0.1336.52±0.2342.47±0.08对比例24.79±0.238.05±0.9213.35±0.7218.63±0.8822.58±0.91对比例35.68±0.1615.78±0.8821.34±0.5227.25±0.7630.17±0.22由上表可以看出，随降解时间增加，所有材料的质量不断降低，但降解速度逐渐减慢。其中，对比例1的降解速率明显高于本发明提供的试验例，原因可能是由于聚乳酸分解后产生的酸性物质使人工骨中的纳米珍珠层粉的溶解速度变快；而对比例2的降解速率明显慢，是因为其中的pcl虽然有较好的降解性能，但是其亲水性差，造成整个材料的亲水性变差，较难溶于模拟体液中；对比例3的降解速度较快，但是由于采用的珍珠层粉的物理特性较纳米珍珠层粉而言，对降解的贡献较小，因此，降解速度较试验例慢。综上，本发明提供的人工骨降解速率适宜，能够适应新生骨功能的恢复过程。(3)不同材料在模拟体液中降解液的ph值变化见表4表4不同材料在模拟体液中降解液的ph值变化组别第2周第4周第8周第12周第16周试验例17.38±0.017.38±0.087.36±0.117.36±0.237.35±0.21试验例27.38±0.017.38±0.057.37±0.147.37±0.117.34±0.22对比例17.34±0.027.10±0.036.85±0.026.46±0.046.08±0.03对比例27.36±0.027.35±0.017.31±0.047.26±0.037.26±0.03对比例37.36±0.017.36±0.047.35±0.067.34±0.057.35±0.08注：模拟体液的初始ph值为7.40。由上表可见，对比例1中的材料可以降低局部的ph值，有在体内引发局部炎症的风险，而本发明的实施例在降解过程中，降解液的ph值基本没有发生变化，与体液的ph值相当，从体外试验的角度可以判断本发明提供的人工骨材料对人体的影响较小。当前第1页12