本发明涉及中药，特别是一种从葫芦巴中提取葫芦巴提取物的方法及应用。
背景技术
葫芦巴，为豆科植物戎芦巴-的种子。果实成熟时割取全草，打下种子，晒干。生用或微炒用。功能主治为：温肾，祛寒，止痛。传统用药中，用于肾脏虚冷、小腹冷痛、小肠疝气、寒湿脚气。随着科技的发展，药物研究领域不断出现新的技术和方法，且植物药与化学药相比具有天然、低毒的优势，从而渐渐成为专家和学者的研究热点；葫芦巴的更多药用价值逐渐被挖掘，以期能够广泛的将这药用植物应用于生产或生活；围绝经期综合征是指妇女绝经前后出现性激素波动或减少所致的一系列以自主神经系统功能紊乱为主，伴有神经心理症状的一组症候群；最典型的症状是潮热、潮红。多发生于45～55岁，主要症状为：月经改变；月经周期改变是围绝经期出现最早的临床症状，分为3种类型：(1)月经周期延长，经量减少，最后绝经。(2)月经周期不规则，经期延长，经量增多，甚至大出血或出血淋漓不断，然后逐渐减少而停止。(3)月经突然停止，较少见。由于卵巢无排卵，雌激素水平波动，易发生子宫内膜癌。对于异常出血者，应行诊断性刮宫，排除恶变。血管舒缩症状：临床表现为潮热、出汗，是血管舒缩功能不稳定的表现，是围绝经期综合征最突出的特征性症状。潮热起自前胸，涌向头颈部，然后波及全身，少数妇女仅局限在头、颈和乳房。在潮红的区域患者感到灼热，皮肤发红，紧接着爆发性出汗。持续数秒至数分钟不等，发作频率每天数次至30～50次。夜间或应激状态易促发。此种血管功能不稳定可历时1年，有时长达5年或更长。那么如何从葫芦巴中提取新的有效成分，并实现对围绝经期综合征的治疗药物中的应用是需要解决的技术问题，但至今未见有公开报导。
技术实现要素：
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的是提供一种从葫芦巴中提取葫芦巴提取物的方法及应用，可有效解决从葫芦巴中提取葫芦巴提取物及治疗围绝经期综合征的用药问题。
本发明解决的技术方案是，一种从葫芦巴中提取葫芦巴提取物的方法，具体是：将葫芦巴粉碎成过20-30目筛的粗粉，先加葫芦巴10倍重量体积的石油醚，重量体积是指，固体以g计，液体用ml计，30-60℃下回流提取1h，脱脂，弃去石油醚；药渣挥干石油醚，加葫芦巴10倍重量体积的、质量浓度80％乙醇浸泡0.5h，回流提取1h，过滤，得第一次滤液；药渣再加葫芦巴10倍重量体积的、质量浓度80％乙醇，回流提取1h，过滤，得第二次滤液，合并两次滤液，减压回收乙醇至无醇味，加蒸馏水分散至相当于含生药0.3g/ml的分散液，分散液上ab-8型大孔吸附树脂，先用2倍柱体积蒸馏水洗脱，弃去水相；再用4倍柱体积的、质量浓度10％乙醇洗脱，弃去洗脱液；药渣再用6倍柱体积的、质量浓度80％乙醇洗脱，收集80％乙醇洗脱液，减压回收乙醇至无醇味，冷冻干燥，粉碎，得提取物葫芦巴提取物。
上述所得到的提取物葫芦巴提取物具有治疗围绝经期综合征不适症状的作用，实现葫芦巴提取物葫芦巴提取物在制备治疗围绝经期综合征药物中的应用。
本发明原料丰富，制备方法科学，易操作，可有效解决从从葫芦巴中提取葫芦巴提取物，开拓了葫芦巴的药用价值和商业价值，经济和社会效益显著。
具体实施方式
以下结合具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中，一种从葫芦巴中提取葫芦巴提取物的方法及应用，其方法是：将3000g葫芦巴粉碎成过20-30目筛的粗粉，先加30000ml的石油醚，30-60℃下回流提取1h，脱脂，弃去石油醚；药渣挥干石油醚，加30000ml质量浓度80％乙醇浸泡0.5h，回流提取1h，过滤，得第一次滤液；药渣再加30000ml质量浓度80％乙醇，回流提取1h，过滤，得第二次滤液，合并两次滤液，减压回收乙醇至无醇味，加蒸馏水分散至相当于含生药0.3g/ml的分散液，分散液上ab-8型大孔吸附树脂，先用2倍柱体积蒸馏水洗脱，弃去水相；再用4倍柱体积的、质量浓度10％乙醇洗脱，弃去洗脱液；再用6倍柱体积的、质量浓度80％乙醇洗脱，收集80％乙醇洗脱液，减压回收乙醇至无醇味，冷冻干燥，粉碎，得提取物葫芦巴提取物。
按上述方法还可以对其他不同重量的葫芦巴进行提取，均得到了相同和相近似的结果，这里不再一一累述，上述制备的化合物均有减轻围绝经期综合征症状的作用，有效用于治疗围绝经期综合征，并经试验取得了非常好的有益技术效果；
有关资料如下：
一、动物试验
实验1葫芦巴提取物对小鼠围绝经期模型的影响
1实验材料
1.1实验动物
km小鼠，spf级；性别：雌性；体重：23-25g，提供单位：山东鲁抗医药股份有限公司；动物合格证号：37005400000020；实验伦理编号：dwll16020050；河南中医学院动物实验中心许可证号：syxk(豫)2015-0005；科研实验中心培训上岗证编号：201302006。
1.2实验药物
本发明葫芦巴提取物
更年安胶囊，山西黄河中药有限公司生产(每粒装0.3g。用法用量：口服，一次3粒，一日3次)，生产批号150102；大豆异黄酮维e软胶囊，威海紫光生物科技开发有限公司生产(每100g含大豆异黄酮(以金雀异黄素计)55.2mg、维生素e608.5mg。每日2次，每次1粒，温水送服。规格：500mg×100粒)，生产批号14100301。
1.3实验试剂
水合氯醛，天津市科密欧化学制剂开发中心，批号20140807；羧甲基纤维素钠，天津市恒兴化学试剂制造有限公司，批号20140728；注射用青霉素钠，华北制药股份有限公司，批号f4046509；0.9％氯化钠注射液，河南科伦药业有限分司，批号：c2015041601-1；甲醛溶液(分析纯)，烟台市双双化工有限公司，批号20150401；酒精，新乡市三伟消毒制剂有限公司，批号20140905；小鼠e2elisa检测试剂盒，r&d公司，批号20151001a；小鼠telisa检测试剂盒，r&d公司，批号20151001a；小鼠lhelisa检测试剂盒，r&d公司，批号20151001a；小鼠fshelisa检测试剂盒，r&d公司，批号20151001a；小鼠il-2elisa检测试剂盒，r&d公司，批号20151001a。
1.4实验仪器
电子称，上海民桥医疗器械有限公司，型号jy601；电子分析天平，奥豪斯(上海)公司，型号ar1140/c；高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂，型号tgl-168；电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司，型号hws12；小鼠自主活动测试仪，成都泰盟科技有限公司，型号zz-6；小鼠避暗仪，成都泰盟科技有限公司，型号ba-200；高速冷冻离心机，科大创新股份有限公司中佳分公司，型号kdc-160hr；可调式移液器，上海雷勃分析仪器有限公司；酶标仪，美国bio-rad公司，型号680；电动显微镜，日本olympus公司，型号bx61。
2实验方法
2.1造模与给药
造模方法：取体重23～25g雌性昆明小鼠84只，随机选出10只作为空白，做假手术处理，其余小鼠造围绝经期模型。小鼠称重后腹腔注射10％水合氯醛(0.03ml/10g)麻醉后腹位固定，然后从小鼠背部最末肋骨下，在腋中线和距脊柱外侧约1cm交叉处剪毛，消毒后切开皮肤和背肌约0.5～1cm，切口视野中可见一乳白色发亮的脂肪团，卵巢即包埋其中。用小镊子轻轻夹住脂肪团拉出切口外，分离脂肪团，即可见到一团细线状不规则呈黄红色的卵巢。剪取时先将卵巢下输卵管(包括脂肪)用细线结扎，再摘除卵巢，术后顺势将子宫角放回腹腔中，缝合肌肉及皮肤，同法摘除双侧卵巢。术后精心饲养，肌肉注射青霉素25万u/kg(每只0.02ml)以防感染，连续3d，每天1次。手术5d后开始逐只进行小鼠阴道涂片检查，每天1次，连续5d，以确定卵巢是否完全切除。涂片呈现动情反应的小鼠弃去不用，选择60只去势完全的小鼠随机均匀分为6组供实验用，分别为模型组，更年安胶囊组，大豆异黄酮软胶囊组，大、中、小剂量葫芦巴提取物组。
配药：0.5％cmc配制方法：称取羧甲基纤维素钠4g，用蒸馏水配成800ml。
(1)大、中、小剂量葫芦巴提取物组给药剂量分别为300mg·kg-1、150mg·kg-1、75mg·kg-1(相当于临床用量的30、15、7.5倍，给药体积0.1ml/10g)。配置方法：分别取葫芦巴提取物4粒、2粒、1粒，先混悬于少量的0.5％cmc溶液，然后再定容到40ml，混匀，即为所需葫芦巴提取物大、中、小剂量混悬液。
更年安胶囊(675mg·kg-1，浓度67.5mg·ml-1，相当于临床用量的15倍)；配置方法：取更年安胶囊9粒，先混悬于少量的0.5％cmc溶液，然后再定容到40ml，混匀，即为所需更年安胶囊混悬液。
大豆异黄酮维e软胶囊(250mg·kg-1，浓度25mg·ml-1，相当于临床用量的15倍)；配置方法：取大豆异黄酮胶囊2粒，先混悬于少量的0.5％cmc溶液，然后再定容到40ml，混匀，即为所需大豆异黄酮混悬液。
储存方法：冷藏，用时隔水温热
给药方法：各组动物于手术后第10天给予相应药物。更年安胶囊组灌服更年安胶囊混悬液675mg·kg-1，大豆异黄酮软胶囊组灌服大豆异黄酮软胶囊混悬液250mg·kg-1，大、中、小剂量葫芦巴提取物组分别组别灌服大、中、小剂量葫芦巴提取物300mg·kg-1、150mg·kg-1、75mg·kg-1。空白组和模型组分别灌服同体积蒸馏水，每日灌胃给药1次，连续给药21d。
2.2观察项目及检测方法
各组小鼠于给药18d时测定5min内自主活动次数，于给药19～20d时测定小鼠首次进入暗室的潜伏期及5min内进入暗室遭电击的次数。于末次给药后2h(禁食不禁水12h)，小鼠称重后摘眼球取血，分离血清，测定血清中e2、t、lh、fsh、il-2的含量；然后脱颈椎处死小鼠，解剖小鼠，摘除胸腺、脾脏、子宫组织，称量其湿重并计算脏器指数(脏器指数＝脏器湿重mg/小鼠体重g)，然后取脑；将胸腺、脾脏、子宫、脑组织固定于10％甲醛溶液中，石蜡包埋，切片，he染色，光镜下观察各组的组织形态学变化。
2.2.1自主活动次数测试
将各组小鼠放入自主活动仪中，先适应环境1min，然后测定5min内自主活动次数。
2.2.2避暗法测试
将各组小鼠尾部对着进入暗室的小口放入测定盒中，进行训练，24h后重新测定小鼠首次进入暗室的潜伏期及5min内进入暗室遭电击的次数。
2.2.3试剂盒测定
小鼠雌二醇(e2)、睾酮(t)、黄体生成素(lh)、促卵泡素(fsh)、白细胞介素2(il-2)elisa检测试剂盒测定方法详见说明书。
2.3统计学处理
数据分析用spss17.0医用统计包进行数据资料的统计学处理，计量资料用平均数±标准差
结果
1.对围绝经期模型小鼠自主活动的影响
实验各组小鼠自主活动测试结果，见表1。
表1葫芦巴提取物对围绝经期模型小鼠自主活动的影响
注：与模型组比较，*p<0.05，**p<0.01
由表1可看出，与空白组比，模型组小鼠的活动、站立次数均显著减少(p<0.01)，反映了围绝经期模型小鼠对新鲜环境的好奇程度降低。与模型组比，大豆异黄酮软胶囊组、更年安胶囊组、大、中、小剂量葫芦巴提取物组均可显著提高小鼠的活动次数(p<0.01)。
2.对围绝经期模型小鼠避暗法潜伏期和受电击次数的影响
实验各组小鼠避暗法测试结果，见表2
表2葫芦巴提取物对围绝经期模型小鼠暗室潜伏期和受电击次数的影响
注：与模型组比较，*p<0.05，**p<0.01
由表2可知，与空白组比，模型组小鼠的受电击次数显著增加(p<0.01)，反映了围绝经期模型小鼠记忆力降低。与模型组比，大豆异黄酮软胶囊组、更年安胶囊组、大、中、小剂量葫芦巴提取物组均可显著延长暗室潜伏期，减少小鼠受电击次数(p<0.01)。
3.对围绝经期模型小鼠脏器指数的影响
实验各组小鼠胸腺、脾脏、子宫指数
表3葫芦巴提取物对围绝经期模型小鼠胸腺、脾脏、子宫指数的影响
注：δδp<0.01，表示与空白组比较；*p<0.05，**p<0.01，表示与模型组比较
由表3可知，与空白组比，模型组小鼠的子宫指数显著降低(p<0.01)，说明摘除卵巢导致围绝经期模型小鼠子宫萎缩。与模型组比，大豆异黄酮软胶囊组、更年安胶囊组、大、中剂量葫芦巴提取物组均可显著提高胸腺脾脏指数(p<0.01)。
4.对围绝经期模型小鼠血清性激素含量的影响
各组小鼠血清中e2、t、fsh、lh含量
表4葫芦巴提取物对围绝经期模型小鼠血清中e2、t含量的影响
注：δδp<0.01，表示与空白组比较；*p<0.05，**p<0.01，表示与模型组比较
表5葫芦巴提取物对围绝经期模型小鼠血清中fsh、lh含量的影响
注：δδp<0.01，表示与空白组比较；*p<0.05，**p<0.01，表示与模型组比较
由表4、表5可以看出，与空白组比，模型组小鼠血清中e2、t水平显著下降(p<0.01)，lh、fsh水平均显著升高(p<0.01)，说明小鼠血清中的性激素水平紊乱，围绝经期小鼠模型复制成功。与模型组比，大剂量葫芦巴提取物组均可显著升高血清e2、t水平(p<0.01)，显著降低升高的lh、fsh水平(p<0.01)。
5.对围绝经期模型小鼠血清中il-2含量的影响
表6葫芦巴提取物对围绝经期模型小鼠血清中il-2含量的影响
注:δδp<0.01，表示与空白组比较；*p<0.05，**p<0.01，表示与模型组比较
由表6可知，与空白组比，模型组小鼠血清中il-2水平显著下降(p<0.01)，说明完全摘除卵巢所致围绝经期小鼠模型机体免疫力有所降低。与模型组比，各给药组均可显著升高血清il-2水平(p<0.01)。
6.对围绝经期模型小鼠器官组织形态的影响
实验各组小鼠子宫、胸腺、脾脏、垂体的病理组织学观察结果如下，病理照片见附录1中围绝经期型小鼠病理照片。
6.1对围绝经期模型小鼠子宫组织形态的影响
采用测微尺，测定实验各组每只小鼠子宫内膜的厚度。
表7葫芦巴提取物对围绝经期模型小鼠子宫内膜厚度的影响
注:δδp<0.01，表示与空白组比较；*p<0.05，**p<0.01，表示与模型组比较
由表7可知，与空白组比，模型组小鼠子宫内膜厚度显著下降(p<0.01)，说明完全摘除卵巢所致围绝经期小鼠模型显著子宫萎缩。与模型组比，大豆异黄酮软胶囊组、更年安胶囊组，大剂量葫芦巴提取物胶囊组均可显著升高子宫内膜的厚度(p<0.01)。
6.2对围绝经期模型小鼠胸腺、脾脏组织形态的影响
采用测微尺，对实验各组每只小鼠胸腺皮质最厚处和最窄处测定其厚度求得均数；然后用测微尺的基线测得压在基线上的胸腺皮质最厚处和最窄处的淋巴细胞数求得均数；
采用测微尺的基线落在脾小结上，以中央动脉为中心分别测定两侧的脾小结厚度大小，求均数；同时计算落在基线上两侧的淋巴细胞数的个数，求均数；
表8葫芦巴提取物对围绝经期模型小鼠胸腺的影响
注：δδp<0.01，表示与空白组比较；*p<0.05，**p<0.01，表示与模型组比较
从表8可知，与空白组比，模型组小鼠胸腺皮质厚度、脾小结体积显著减少(p<0.01)，说明小鼠造围绝经期模型后胸腺、脾脏体积萎缩。与模型组比，大豆异黄酮胶囊、更年安胶囊、大、中剂量葫芦巴提取物组可显著增厚胸腺皮质和脾小结体积(p<0.01)。
6.3对小鼠围绝经期模型垂体组织形态的影响
采用测微尺测量对角线上腺垂体的数量并求得平均值，测量结果见表10
表10葫芦巴提取物对围绝经期模型小鼠腺垂体数量的影响
注:δδp<0.01，表示与空白组比较；*p<0.05，**p<0.01，表示与模型组比较
从表10可知，与空白组比，模型组腺垂体的数量显著减少(p<0.01)，说明小鼠造围绝经期模型后分泌促性激素的细胞源减少。与模型组比，大、中剂量葫芦巴提取物组可显著增加腺垂体的数量体积(p<0.01)。
实验2葫芦巴提取物对大鼠围绝经期模型的影响
1实验材料
1.1实验动物
wistar大鼠，spf级，雌性，250-270g，提供单位：山东鲁抗医药股份有限公司；动物合格证号37005400000027；实验伦理编号dwll16020050；河南中医学院动物实验中心许可证号syxk(豫)2015-0005；科研实验中心培训上岗证编号201302006。
1.2实验药物
同实验一。
1.3实验试剂
水合氯醛，天津市科密欧化学制剂开发中心，批号20140807；羧甲基纤维素钠，天津市恒兴化学试剂制造有限公司，批号20140728；注射用青霉素钠，华北制药股份有限公司，400万单位，批号f4046509；0.9％氯化钠注射液，河南科伦药业有限分司，批号c2015041601-1；甲醛溶液(分析纯)，烟台市双双化工有限公司，批号20150401；酒精，新乡市三伟消毒制剂有限公司，批号20140905；抗er多克隆抗体，美国abcam公司，批号gr134998-6；抗ar多克隆抗体，美国abcam公司，批号gr223770-2；兔-igg免疫组化试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司，批号10108a；大鼠e2elisa检测试剂盒，r&d公司，批号20150101a；大鼠telisa检测试剂盒，r&d公司，批号20150101a；大鼠lhelisa检测试剂盒，r&d公司，批号20150101a；大鼠fshelisa检测试剂盒，r&d公司，批号20150101a；大鼠gnrhelisa检测试剂盒，r&d公司，批号20150101a；大鼠bgpelisa检测试剂盒，r&d公司，批号20150101a；大鼠β-epelisa检测试剂盒，r&d公司，批号20150101a。
1.4实验仪器
电子称，上海民桥医疗器械有限公司，型号jy601；电子分析天平，奥豪斯(上海)公司，型号ar1140/c；高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂，型号tgl-168；开场活动试验箱，成都泰盟软件有限公司，型号oft-100；电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司，型号hws12；电动显微镜，日本olympus公司，型号bx61；酶标仪，美国bio-rad公司，型号680；可调式移液器，上海雷勃分析仪器有限公司；x3r高速冷冻离心机，美国赛默飞世尔科技有限公司；real-time检测仪：abi(abi-7300)公司产品。
2实验方法
2.1造模与给药
造模方法：取体重250～270g雌性wistar大鼠84只，随机取10只作为空白组外，做假手术处理，其余大鼠造围绝经期模型。大鼠称重后腹腔注射10％水合氯醛(0.3ml/100g)麻醉后腹位固定，然后从大鼠背部最末肋骨下，在腋中线和距脊柱外侧约2cm交叉处去毛(用动物专用推子去毛)，碘酒消毒后切开皮肤和背肌约1cm，切口视野中可见一乳白色发亮的脂肪团，卵巢即包埋其中。用小镊子轻轻夹住脂肪团拉出切口外，分离脂肪团，即可见到一团细线状不规则呈黄红色的卵巢。剪取时先将卵巢下输卵管(包括脂肪)用细线结扎，完全摘除左侧卵巢，右侧摘除80％。术后用生理盐水棉球擦拭后将子宫角放回腹腔中，缝合肌肉及皮肤。术后精心饲养，肌肉注射青霉素20万u/kg(每只0.1ml)以防感染，连续3d，每天1次。选择60只状态良好的大鼠随机均匀分为6组供实验用，分别为模型组，更年安胶囊组，大豆异黄酮软胶囊组，大、中、小剂量葫芦巴提取物组。
配药：0.5％cmc配制方法：称取羧甲基纤维素钠4g，用蒸馏水配成800ml。
(1)大、中、小剂量葫芦巴提取物组给药剂量分别为200mg·kg-1、100mg·kg-1、50mg·kg-1(相当于临床用量的20、10、5倍，给药体积1ml/100g)。配置方法：分别取葫芦巴提取物8粒、4粒、2粒，先混悬于少量的0.5％cmc溶液，然后再定容到120ml，混匀，即为所需葫芦巴提取物大、中、小剂量混悬液。
(2)更年安胶囊(450mg·kg-1，浓度45mg·ml-1，相当于临床用量的10倍)；配置方法：取更年安胶囊15粒，先混悬于少量的0.5％cmc溶液，然后再定容到100ml，混匀，即为所需更年安胶囊混悬液。
(3)大豆异黄酮维e软胶囊(167mg·kg-1，配成16.7mg·ml-1，相当于临床用量的10倍)；配置方法：取大豆异黄酮胶囊4粒，先混悬于少量的0.5％cmc溶液，然后再定容到120ml，混匀，即为所需大豆异黄酮混悬液。
储存方法：冷藏，用时隔水温热
给药方法：各组动物于手术后第10天给予相应药物。更年安胶囊组灌服更年安胶囊混悬液450mg·kg-1，大豆异黄酮软胶囊组灌服大豆异黄酮软胶囊混悬液167mg·kg-1，大、中、小剂量葫芦巴提取物组分别组别灌服大、中、小剂量葫芦巴提取物200mg·kg-1、100mg·kg-1、50mg·kg-1。空白组和模型组分别灌服同体积蒸馏水，每日灌胃给药1次，连续给药30d。
2.2观察项目及检测方法
2.2.1观察项目
各组大鼠于给药第29天时测定大鼠开场活动(openfield)。末次灌胃后2h，取血，测定血清中e2、t、lh、fsh、gnrh、bgp的含量，血浆β-ep含量；处死大鼠后，摘除胸腺、脾脏、子宫，称量其湿重并计算脏器指数，然后取脑，将左侧下丘脑、垂体、子宫固定于10％福尔马林溶液中，用免疫组化法测下丘脑、垂体、子宫中er表达，下丘脑、垂体中ar表达。
2.2.2检测方法
(1)openfield法测试
各组大鼠于给药29天时测定大鼠开场活动(openfield)，观察大鼠3min内站立次数和水平活动距离。
(2)试剂盒测定方法：
血清标本的获取：使用不含热原和内毒素的试管，取血过程中避免任何刺激，防止溶血；收集血液后，3000转离心10分钟后，将血清和红细胞迅速小心的分离。
血浆标本的获取：肝素抗凝管抗凝。3000转离心30分钟取上清。
试剂盒的测定：大鼠雌二醇(e2)、黄体生成素(lh)、促卵泡素(fsh)、促性腺激素释放激素(gnrh)、骨钙素(bgp/ocn)、β-内啡肽(β-ep)elisa检测试剂盒测定方法，详见说明书。
2.3统计学处理
实验结果用spss17.0统计软件进行数据资料的统计学处理，计量资料用平均数±标准差
结果
1.对围绝经期大鼠大鼠旷场活动的影响
表11葫芦巴提取物对围绝经期大鼠旷场活动的影响
注:δδp<0.01，表示与空白组比较；*p<0.05，**p<0.01，表示与模型组比较
由表11可知，与空白组相比，模型组大鼠的活动距离和站立次数都显著减少(p<0.01)；反映了大鼠对新鲜环境的好奇程度降低。与模型组比较，大剂量葫芦巴提取物组与更年安胶囊、大豆异黄酮软胶囊均能使大鼠活动距离和站立次数显著增加(p<0.01)。
2.对围绝经期大鼠脏器指数的影响
对围绝经期模型大鼠胸腺、脾脏、子宫指数的影响，见表12
表12葫芦巴提取物对围绝经期大鼠胸腺、脾脏、子宫、肾上腺指数的影响
注：δδp<0.01，表示与空白组比较；*p<0.05，**p<0.01，表示与模型组比较
由表12可看出，与空白组比，模型组大鼠的胸腺指数、脾脏指数、子宫指数显著下降(p<0.01)，说明不完全摘除卵巢所致围绝经期大鼠模型出现胸腺、脾脏和子宫萎缩。与模型组比，大、中、小剂量葫芦巴提取物组与更年安胶囊、大豆异黄酮软胶囊可显著提高围绝经期模型大鼠胸腺指数、脾脏指数、子宫指数、肾上腺指数(p<0.01)。
3.对血清生化指标的影响
对围绝经期模型大鼠e2、t、lh、fsh的影响见表13、14。
表13葫芦巴提取物对围绝经期大鼠e2、lh、fsh的影响
注:δδp<0.01，表示与空白组比较；*p<0.05，**p<0.01，表示与模型组比较
表14葫芦巴提取物对围绝经期大鼠fsh、lh的影响
注:δδp<0.01，表示与空白组比较；*p<0.05，**p<0.01，表示与模型组比较
由表13、表14可知，与空白组比，模型组大鼠的血清e2、t水平显著下降(p<0.01)，lh、fsh水平显著升高(p<0.01)，说明不完全摘除卵巢致围绝经期大鼠模型性激素紊乱，围绝经期大鼠模型复制成功。与模型组比，更年安胶囊、大豆异黄酮软胶囊、大剂量葫芦巴提取物组可以显著的升高e2、t的水平和降低fsh、lh的水平。
表15葫芦巴提取物对围绝经期大鼠gnrh、β-ep的影响
注:δδp<0.01，表示与空白组比较；*p<0.05，**p<0.01，表示与模型组比较
由表15可知，与空白组比，模型组大鼠的血清gnrh水平显著升高、血浆β-ep水平显著下降(p<0.01)，说明不完全摘除卵巢致围绝经期大鼠模型性激素紊乱，因负反馈调节导致下丘脑分泌的相关激素也发生紊乱。与模型组比，大、中剂量葫芦巴提取物组、大豆异黄酮软胶囊组、更年安胶囊组gnrh水平可显著升高(p<0.01)。各用药组β-ep水平可显著降低(p<0.01)。
表16葫芦巴提取物对围绝经期大鼠bgp的影响
注:δδp<0.01，表示与空白组比较；*p<0.05，**p<0.01，表示与模型组比较
由表16可知，与空白组比，模型组大鼠的血清bgp水平均显著降低(p<0.01)，说明不完全摘除卵巢所致围绝经期大鼠模型骨钙质有所降低。与模型组比，大、中、小剂量葫芦巴提取物组、大豆异黄酮软胶囊组、更年安组bgp水平可显著升高(p<0.01)。
4.对免疫组化指标的影响
对围绝经期模型大鼠子宫、垂体、下丘脑中er的表达以及垂体、下丘脑中ar的影响
表17葫芦巴提取物对围绝经期大鼠垂体、下丘脑、子宫(er)表达的影响(平均光密度)
注：δδp<0.01，表示与空白组比较；*p<0.05，**p<0.01，表示与模型组比较
表18葫芦巴提取物对围绝经期大鼠垂体、下丘脑(ar)表达的影响(平均光密度)
注:δδp<0.01，表示与空白组比较；*p<0.05，**p<0.01，表示与模型组比较
由表17、表18可知，与空白组比较，模型大鼠各组织er、ar的表达均显著降低(p<0.01)，说明不完全摘除降低了雌雄激素的生物效应。与模型组比较，大剂量葫芦巴提取物、更年安胶囊和大豆异黄酮软胶囊能够显著升高er在子宫、垂体、下丘脑的表达(p<0.01)，显著升高ar在垂体、下丘脑的表达(p<0.01)。
二、临床试验：
在动物试验确保安全的基础上，经临床应用效果非常好，而且用药安全，疗效稳定可靠，有关试验资料是：
1、选择病例的标准：
围绝经期综合征是指妇女绝经前后出现性激素波动或减少所致的一系列以自主神经系统功能紊乱为主，伴有神经心理症状的一组症候群；最典型的症状是潮热、潮红。多发生于45～55岁，主要症状为：
月经改变；月经周期改变是围绝经期出现最早的临床症状，分为3种类型：(1)月经周期延长，经量减少，最后绝经。(2)月经周期不规则，经期延长，经量增多，甚至大出血或出血淋漓不断，然后逐渐减少而停止。(3)月经突然停止，较少见。由于卵巢无排卵，雌激素水平波动，易发生子宫内膜癌。对于异常出血者，应行诊断性刮宫，排除恶变。
血管舒缩症状：临床表现为潮热、出汗，是血管舒缩功能不稳定的表现，是围绝经期综合征最突出的特征性症状。潮热起自前胸，涌向头颈部，然后波及全身，少数妇女仅局限在头、颈和乳房。在潮红的区域患者感到灼热，皮肤发红，紧接着爆发性出汗。持续数秒至数分钟不等，发作频率每天数次至30～50次。夜间或应激状态易促发。此种血管功能不稳定可历时1年，有时长达5年或更长。
凡具有上述症状者，均作为选择病例的标准。
2、诊断标准：凡在临床上具有1症状者，并经检查即可确诊患有围绝经期综合征。
3、纳入标准：年龄45-55岁；自愿参与到实验中；配合后期跟踪随访。
4、排除标准：有精神疾病史者；合并有严重疾病的患者；不能配合此次观察的患者。
5、治疗方案：对照组不给予药物，积极进行护理干预:心理疏导，加强运动、安排好生活与休息，鼓励参加音乐、书法、绘画及舞蹈等娱乐活动；本发明组在对照组的基础上加用本发明提取物葫芦巴提取物，1.2g/d，3个月后统计疗效。
6、疗效评定标准：
治愈：自觉症状消失，停药三月以上无再复发者；有效：症状大部分缓解，但需继续治疗，或三月内复发者；无效：基本症状无缓解者，甚至有加重之趋势。
7、统计学处理：
对确诊的40例患者，随机分为本发明组和对照组，本发明组(20例)，患者年龄最小46岁，年龄最大54岁，平均(50.1±1.8)岁，病程最长3年，平均2.5年，所有患者均已绝经或月经渐稀少、潮热汗出、心烦易怒、焦虑健忘、腰酸肢软、面浮肢肿、疲乏无力、头晕眼花、失眠多梦等症。体检时血检fsh、lh均达绝经期水平，e2水平明显低于正常，其他各项相应理化检查未见器质性病变，明确为绝经期综合征，相对症状较轻，不愿应用化药者。
对照组(20例)，患者年龄最小的45岁，年龄最大的53岁，平均(49.3±1.6)岁。本发明组与对照组在一般资料的比较上差异无统计学意义(p＞0.05)。
按上述治疗方案，经治疗后，其中，本发明组治愈11例，有效7例，无效2例，总有效率为90％；对照组治愈2例，有效8例，无效10例，总有效率为50％；本发明组明显优于对照组，效果之好是未曾料到的。
试验表明，本发明原料丰富，制备方法科学，易操作，可有效从葫芦巴中提取葫芦巴提取物，本发明提取物葫芦巴提取物是治疗围绝经期综合征的有效药物，具有很强的临床应用价值，开拓了治疗围绝经期综合征的新途径，是治疗围绝经期综合征药物上的一大创新，经济和社会效益显著。