一种硒化葫芦巴多糖的合成及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属生物高分子及化学合成技术领域，涉及一种硒化萌芦巴多糖的合成方 法;本发明同时还涉及硒化萌芦巴多糖的医药用途一一作为HepG2肝癌细胞的抑制剂应用 于制备抗癌药物中。
【背景技术】
[0002] 硒(Se)是人体必不可少的微量元素，在生命免疫机能的提高、抗癌、抗氧化、防止营养 性肝坏死等诸多方面发挥着重要作用。在生物代谢中，硒也是谷胱甘肽过氧化物酶的活性 成分，因此，硒对人体的作用极为重要。但是，硒元素在地球分布不均匀，在中国大约有五分 之三的地区缺硒，而普通食品中硒含量都是极低的，一般达不到补充硒的效果。在自然界， 硒的存在形式主要包括无机硒和有机硒两种。与无机硒相比，有机硒是更安全、活性更高的 含硒物质，在激发免疫反应上比无机硒更加显著。有机硒的主要来源是天然富硒生物和人 工合成，在众多富含有机硒物质中，硒多糖受到了极大关注。硒多糖作为一种有机硒化合 物，拥有硒与多糖二者的活性。硒多糖的生物活性普遍高于多糖和硒，毒性更小，且硒化后 的多糖更易于被有机体吸收和利用。
[0003]硒多糖的制备方法包括天然含硒植物多糖，微生物富集培养代谢硒多糖和人工合 成硒多糖。人工合成硒多糖是比较方便且可控的方法，目前国内外文献和专利主要采用以 下三种方法制备硒多糖:温和条件下使用单体硒、亚硒酸或亚硒酸钠对多糖进行硒化修饰； 利用化学性质活泼，具有酰氯结构的中间体作为硒化试剂进行修饰;将含硒的功能基因接 枝到多糖分子上。梁淑轩等采用冰醋酸催化下硒酸钠与枸杞多糖反应，所得硒化枸杞多糖 硒含量在606-3762 yg/g(食品研究与开发，2011，3,160-164);李志洲等利用化学合成法， 以猪苓多糖和亚硒酸钠为原料制备猪苓硒多糖，采用连续或超声波辅助化学合成工艺(食 品与机械，2013，1，31-35，未报道硒含量）。专利CN 1560088A公开了 一种了硒化葡甘聚糖 的制备方法，将硒单质在氧化剂作用下氧化成Se6+，在Se6+离子的水溶液中加入乙醇和盐 酸，得到硒化反应液，将硒化反应液与葡甘聚糖进行反应，制成硒化葡甘聚糖，所得硒化葡 甘聚糖硒含量比较低，为125.4-197.3 yg/g，且衍生物中硒为Se6+;专利ZL 88103347公开 了一种硒化卡拉胶的制法，以硒粉为原料，用硝酸将其溶解制备成硒液，加入Kappa-角叉菜 胶溶液进行硒化反应，但该方法所得产物硒含量较低(2500-15000 ppm)，且副产物硒化氢 有毒。专利CN102653566A公开了一种有机法制备硒化黄芪多糖的方法，该方法将黄芪多糖 粗品在酶降解作用下合成纯品黄芪多糖，再与氯化亚硒酰反应，得硒化的黄芪多糖含硒量 为14305-24864 yg/g，但该方法硒化时间长（12-48h)，反应物氯化亚硒酰不易制备，毒性 大，不适合大规模的工业化生产。专利ZL 200910162003.4公开了一种有机法制备硒化沙蒿 多糖或蕨麻多糖的方法，将蕨麻多糖或沙蒿多糖与亚硒酰氯反应得硒化的沙蒿多糖或蕨麻 多糖，硒含量12000-26000 yg/g。但该方法使用的亚硒酰氯合成困难且亚硒酰氯具有毒性， 反应过程中，加入亚硒酰氯时暴露在空气中，亚硒酰氯会被氧化，得到的亚硒酰氯中可能含 有硒酰氯等杂质。
[0004] 以上专利和文献中提到的多糖硒化修饰技术普遍存在含硒中间体制备复杂且毒 性大、反应时间长、硒化多糖硒含量和收率低、副反应多、生物学效应不明等缺点。离子液体 以其热稳定性好、效率高、环境友好且可回收重复利用等优点而广泛应用在各类有机合成 反应中。通过查阅国内外文献及专利，均未报道以萌芦巴多糖为原料，离子液体作为催化剂 合成高硒含量硒化萌芦巴多糖的方法及应用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种硒化萌芦巴多糖的合成方法。
[0006] 本发明的另一目的在于提供一种硒化萌芦巴多糖作为HepG2肝癌细胞的抑制剂用 于制备抗癌药物。
[0007] 一、硒化萌芦巴多糖的合成 1.萌芦巴多糖甲酰胺溶液的制备： 将萌芦巴多糖在60°080°C下300~500 rpm的转速下搅拌2~5 h溶解于甲酰胺中，得萌 芦巴多糖的甲酰胺溶液。
[0008] 上述萌芦巴多糖的重均分子量为2.303 X 106 Da，总糖含量为87.2%。萌芦巴多糖与 甲酰胺的质量体积比为2.5~4 mg/mL。
[0009] 2.离子液体的制备 将浓硫酸在_1〇°〇0°C下以50~80滴/min的速度滴加到N-甲基吡咯烷酮中，300~800 rpm搅拌反应10~18 h，反应完毕后室温下用乙酸乙酯洗涤2~3遍，收集下层粘稠液体，真空 干燥得离子液体。
[0010]其中：N-甲基吡咯烷酮与浓硫酸的体积比为2:1~2.5:1，乙酸乙酯和离子液体的体 积比为0.5:1~1:1，真空干燥条件为真空度0.06~0.08 MPa，干燥温度50~70°C，时间6~12 h。 [0011] 3.离子液体对亚硒酸的活化 在60~80°C和N2保护的条件下，将亚硒酸加入到上述离子液体中反应1~3 h得活化后的 亚硒酸。
[0012] 上述亚硒酸和离子液体的质量体积比为0.125~0.2 g/mL。
[0013] 4.硒化萌芦巴多糖的合成 将萌芦巴多糖的甲酰胺溶液用滴液漏斗以30~60滴/min的速度滴加到离子液体活化好 的亚硒酸中，在60~80°C和N2保护的条件下反应2~4 h，待反应完毕后在隔绝空气的条件下 加入丙酮洗涤10~15次，将沉淀物装入截留分子量8000~14000 Da的透析袋中流水透析24~ 48 h，去离子水透析12~24 h，透析完毕后袋内物减压浓缩至原体积的1/20~1/30,在浓缩液 中加入无水乙醇（乙醇含量占总体积的70~80%)沉淀，离心收集下层沉淀物，冷冻干燥，得硒 化萌芦巴多糖。
[0014]其中：萌芦巴多糖的甲酰胺溶液和活化的亚硒酸的体积比为10~25,搅拌条件为 300~800 rpm，丙酮和反应液的体积比为2~3(v/v)，减压浓缩温度为55~65°C、真空度0.06~ 0.08 MPa，离心转速为400CK5000 rpm/min、离心时间10~15 min，冷冻干燥条件为温度-60 一50°C，真空度5~20 Pa，干燥时间24~48 h。
[0015]二、硒化萌芦巴多糖体外对HepG2肝癌细胞的抑制作用 取对数生长期的HepG-2细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，并用含15%新生牛血清的DMEM培 养基制成浓度3 X 105个/mL的单细胞悬液，不断摇动细胞悬液使细胞数均匀，以0.2 ml/孔 接种于96孔培养板(板边缘封无菌水，空白组加3孔不含细胞的培养基），置C02培养箱内在 37 °C、饱和湿度、5%C02条件下培养。
[0016]培养24 h后细胞贴壁，换含药培养基，每孔加190 yL培养基和10 yL样品液(空白 组和对照组加10^1?83液），药物终浓度为20,50，100,200,500，1000,5000吨/11^，每浓度 重复6孔，并设不加样品的对照组和空白调零组。置C0 2培养箱内，在37°C、饱和湿度、5%0)2条 件下培养。
[0017] 样品处理48 h后，每孔加入MTT溶液20 yL，37°C下继续培养4 h。小心弃去孔内上 清液，并加入150 yL DMS0,振荡10 min，使紫色结晶完全溶解。用酶标仪在490 nm处测吸光 值，对照组以空白组调零，并按下列公式计算抑制率，并根据不同浓度样品的抑制率计算半 数抑制浓度(IC 5〇): 抑制率(％)=(1-实验组平均0D值/对照组平均0D值）X 100% 对他口62肝癌细胞的1(：5()为527.4~1230.8邱/1^，具有显著的体外抑制他?62细胞的作 用，可作为H印G2肝癌细胞的抑制剂，用于开发抗癌药物。
[0018] 本发明的有益效果： 1、本发明以萌芦巴多糖为原料，采用离子液体催化亚硒酸合成硒化萌芦巴多糖，离子 液体无毒、环保、制备简单，无需使用有毒的含硒中间体，无废液排放，有效缩短了反应所需 时间，在温和的条件下得到高硒含量的硒化多糖。
[0019] 2、制备了具有显著的体外抑制HepG2细胞活性的硒化萌芦巴多糖，拓展了萌芦巴 多糖作为天然活性物质的应用范围； 3、 本发明制备的硒化萌芦巴多糖的硒含量可以通过反应条件调节优化，以满足不同领 域要求； 4、 本发明不需要特殊设备，简单可控，成本低，适合推广应用。
【附图说明】
[0020] 图1萌芦巴多糖及其硒化萌芦巴多糖的红外光谱图。
[0021] 图2萌芦巴多糖及硒化萌芦巴多糖的X射线光电子能谱(XPS)图。
【具体实施方式】
[0022] 下面通过具体实施例对本发明硒化萌芦巴多糖的合成方法作进一步的说明。
[0023] 实施例1 (1)萌芦巴多糖甲酰胺溶液的制备:将200 mg萌芦巴多糖在70°C下以500 rpm的转速下 搅拌2 h溶解于60 mL甲酰胺中，得萌芦巴多糖的甲酰胺溶液。
[0024] (2)离子液体的制备:将5 mL浓硫酸在-10°C下以60滴/min的速度滴加到10 mL的 N-甲基吡咯烷酮中，800 rpm搅拌反应12 h，反应完毕后室温下用15 mL乙酸乙酯洗涤2遍， 收集下层粘稠液体，在真空度0.07 MPa、60°C下真空干燥6 h得离子液体。
[0025] (3)离子液体对亚硒酸的活化:在80°(：和犯保护的条件下，将0.6 g亚硒酸加入到4 mL离子液体中反应3 h得活化后的亚硒酸。
[0026] (4)硒化萌芦巴多糖的合成：将60 mL萌芦巴多糖的甲酰胺溶液用滴液漏斗以40 滴/min的速度滴加到4 mL离子液体活化好的亚硒酸中，在70°(：和犯保护的条件下反应4 h， 待反应完毕后在隔绝空气的条件下加入128 mL丙酮，室温下洗涤10次，将沉淀物装入截留 分子量8000~14000 Da的透析袋中流水透析24 h，去离子水透析18 h，透析完毕后袋内物在 0.08 MPa、60 °C下减压浓缩至原体积的1 /30，在浓缩液中加入无水乙醇（乙醇含量占总体积 的70%)沉淀，5000 rpm下离心10 min收集下层沉淀物，在5 Pa、-55°C下冷冻干燥36 h，得硒 化萌芦巴多糖。
[0027]该硒化萌芦巴多糖为暗红色无定形粉末，总糖含量80.3%，在水中溶解度为 18 ? 5mg/mL( 25 °C )，硒含量为28128 yg/g，分子量为2 ? 376 X 106 Da，对HepG2肝癌细胞的体 外ICso 值为 591.1 yg/mL。
[0028] 下面通过硒含量测定、红外光谱图、X射线光电子能谱分析(XPS)、分子量测定对本 实施例1合成的硒化萌芦巴多糖的结构、活性进行分析，并作以说明： 1.硒含量的测定:采用荧光光度法对样品进行硒含量测定。
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