本发明涉及一种羊痘、山羊传染性胸膜肺炎二联灭活疫苗及其生产方法。属于兽用生物制品领域。
背景技术：
养羊业与国民经济的发展和各族人民生活水平的提高关系十分密切，特别是进入21世纪后，我国养羊业得到快速发展，成果显著，养羊业在国民经济中的比重也逐年提高。根据联合国粮农组织(fao)数据，2013年，中国大陆地区的山羊养殖量即达1.83亿头。2014年，中国大陆地区的山羊养殖量为1.88亿头。虽然我国养羊数量位居世界首位，但与养羊业发达的国家相比，疫病防控水平较薄弱，这在一定程度上制约了我国养羊业的发展。
羊痘是世界动物卫生组织(oie)规定的必须报告的传染病之一，羊痘病毒(capripoxviruses)属于痘病毒科山羊痘病毒属。羊痘是由绵羊痘和山羊痘引起的一种接触性传染病，呈流行性。它的特征是在全身皮肤、粘膜上出现典型的痘疹，病羊发热并有较高的死亡率，其中羔羊的发病致死率可高达100％，妊娠母羊常发生流产。本病主要通过呼吸道感染，在冬末春初流行，大多数绵羊山羊生产国均有流行。非洲、亚洲大部分国家报道该病的发生。这些疫病一旦发生，病情迅猛，传播性强，死亡率高，损失极大，国际上始终都对这类烈性疫病高度重视，严加防范。我国近3年的羊痘疫情时有发生，给我国养羊业造成重大损失。
山羊传染性胸膜肺炎(contagiouscaprinepleurpneumonia,ccpp)是由山羊支原体山羊肺炎亚种(m.capricolumsubsp.capripneumoniae,mccp，引起的一种山羊特有的急性或慢性高度接触性传染病，以呈现纤维素性肺炎和胸膜炎为特征,发病率为22％～30％，个别地区高达60％～80％，死亡率15％～30％。该病在非洲、亚洲等数十个国家和地区都有流行，对山羊养殖业带来了较为严重的损失，被世界动物卫生组织列为b类传染病。我国于1947年首发于甘肃,继而在内蒙古、四川、山东、湖北、河北、云南、江西、江苏等地陆续发现。近几年，在湖南、河南、贵州、重庆、内蒙等地区都有ccpp的报道，给山羊养殖业造成了较大的经济损失。
目前，我国羊群中羊痘和山羊传染性胸膜肺炎感染的状况仍非常普遍，疫苗免疫是我国防控羊痘和山羊传染性胸膜肺炎的主要手段。其中，目前我国广泛应用的山羊痘活疫苗，经过长期的临床实践检验，发现还存在如下3项主要不足，一是生产种毒存在一定的残余毒力，易引起羔羊死亡、母羊流产，存在较大的安全隐患；二是需采用原代绵羊睾丸细胞制备疫苗，生产过程中面临绵羊睾丸来源困难的问题，且存在原代细胞携带外源病毒的生物安全风险；三是需皮内免疫，在临床使用过程中难以操作。
本发明提出的羊痘、山羊传染性胸膜肺炎二联灭活疫苗，采用山羊痘病毒av41株和山羊支原体山羊肺炎亚种c87001株分别接种悬浮培养的bhk-21细胞和适宜培养基培养，收获培养物，经浓缩、纯化，分别用bei和硫柳汞灭活后，按一定比例加入适宜佐剂混合乳化制成。用于预防山羊痘和山羊传染性胸膜肺炎。本发明系国际上首次获得羊痘和山羊传染性胸膜肺炎的二联灭活疫苗，可实现一针两防的目的，同时，采用本发明提出的悬浮培养bhk-21细胞生产羊痘灭活疫苗，较原绵羊睾丸细胞制备的活疫苗具有明显的优势，可解决目前羊痘活疫苗生产过程中面临的绵羊睾丸来源困难、易引起羔羊死亡、母羊流产，以及疫苗需皮内免疫，在临床使用过程中难以操作等问题。
技术实现要素：
本发明目的在于制备出一种羊痘、山羊传染性胸膜肺炎二联灭活疫苗，用于预防山羊痘、绵羊痘和山羊传染性胸膜肺炎。
本发明技术方案
1.一种羊痘、山羊传染性胸膜肺炎二联灭活疫苗，其特征在于所述灭活疫苗含有采用悬浮培养bhk-21细胞生产的山羊痘病毒抗原和山羊支原体山羊肺炎亚种抗原。
2.本发明所述羊痘、山羊传染性胸膜肺炎二联灭活疫苗，其特征在于所述羊痘抗原生产毒株为山羊痘病毒av41株。
3.本发明所述二联灭活疫苗，其特征在于所述山羊支原体山羊肺炎亚种抗原生产菌株为c87001株。
4.本发明所述羊痘、山羊传染性胸膜肺炎二联灭活疫苗，其特征在于所述生产用bhk-21细胞采用纯悬浮培养工艺，培养过程中无需添加载体。
5.本发明所述羊痘、山羊传染性胸膜肺炎二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于用所述山羊痘病毒av41株和山羊支原体山羊肺炎亚种c87001株分别接种悬浮培养的bhk-21细胞和适宜培养基培养，收获培养物，经浓缩、纯化，分别用bei和硫柳汞灭活后，按一定比例加入适宜佐剂混合乳化制成二联灭活疫苗。用于预防山羊痘和山羊传染性胸膜肺炎。
本发明具体实施方式
1.二联灭活疫苗的制备
(1)生产和检验用毒种生产用毒种为山羊痘病毒av41株，检验用毒种为山羊痘病毒av40株，均由中国兽医药品监察所制备并提供(请见中国兽医药品监察所、中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著，中国兽医菌种目录(第二版)，中国农业科学技术出版社，2002年，p142)。
(2)生产和检验用菌种山羊支原体山羊肺炎亚种c87001株生产用基础种子，山羊支原体山羊肺炎亚种c87002株为疫苗检验用菌种，由中国兽医药品监察所制备并提供(该菌原分类命名为丝状支原体山羊肺炎亚种(mycoplasmamycoidessuhsp.capriedwardandfreundt)(请见中国兽医药品监察所、中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著，中国兽医菌种目录(第二版)，中国农业科学技术出版社，2002年，p89)。
(3)生产用细胞制备从液氮罐中取出bhk-21细胞(由中国兽医药品监察所制备并提供(请见中国兽医药品监察所、中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著，中国兽医菌种目录，中国农业科学技术出版社，2008年，p147)，迅速置36～37℃水浴解冻，转入装有mem培养液的无菌离心管中，以800r/min离心5min，用含2％血清的mem培养液重悬细胞后转入细胞摇瓶，置37℃恒温振荡培养箱中，以160～200r/min振荡培养，当摇瓶细胞密度达到不低于2×106个/ml时，将摇瓶中细胞按0.5×106个/ml的密度注入到一级反应器，并采用同样方法逐级放大到二级反应器，反应器搅拌速度为60～100r/min，溶氧(do)40％～60％，ph值7.0～7.4，温度为36～37℃，培养48～72小时。
(4)生产用毒种制备当生物反应器细胞密度达2×106个/ml以上、活率90％以上时，按2％～8％的比例接种病毒液，调整反应器搅拌速度为60～100r/min，溶氧(do)40％～60％，ph值7.0～7.4，36～37℃培养，定时取样观察细胞病变，当细胞活率低于20％时收获培养物，注明毒种名称、批号、代次、收获日期，置-20℃以下保存，作为生产用悬浮细胞毒种。
(5)生产用菌种制备取c87001株冻干菌种1支，接种含15％马血清的ezh液体培养基，置37℃培养3～5日，当培养基ph值下降至7.0左右时，作为制苗用一级种子。取一级种子，接种含15％马血清的ezh液体培养基，置37℃培养3～5日，当培养基ph值下降至7.0左右时，作为制苗用二级种子。
(6)制苗用病毒液的制备当生物反应器内细胞密度达到2×106个/ml以上时，按2％～8％的比例接种av41株悬浮细胞毒。接种后，调整反应器搅拌速度为60～100r/min，溶氧(do)40％～60％，ph值7.0～7.4，36～37℃悬浮培养，定时取样观察，若48～72小时内悬浮细胞出现死亡、崩解、破碎，活率低于20％时停止培养，收获培养物。将收获的病毒液经1.0μm的滤芯过滤后，采用30万截留分子量(mw)超滤浓缩系统浓缩10倍(v/v)，用pbs(0.01mol/l，ph值7.2)将浓缩后的病毒液稀释至原体积，即为制苗用病毒液。
(7)制苗用菌体抗原制备制备取合格的二级种子，按培养基总量的2％接种含15％马血清的ezh液体培养基，37℃培养，当培养物ph值下降到7.0左右时，终止培养。取样进行纯粹检验及活菌滴度测定。活菌滴度应≥1×109.0ccu/ml。采用2万截留分子量(mw)超滤浓缩系统浓缩15倍(v/v)。
(8)病毒液灭活将bea粉加入已灭菌的0.2mol/l的氢氧化钠溶液中，充分溶解，使bea浓度为0.2mol/l，置37℃水浴中，每隔10～15min振摇一次，使bea充分环化1小时后，终止环化，产生二乙烯亚胺(bei)，最终浓度为0.2mol/l。向检验合格的羊痘病毒液中加入bei溶液至终浓度为0.004mol/l，升温至30℃时开始计算灭活时间，温度保持在30±1℃，灭活28小时，其间2～4小时搅拌一次，每次10～15min。灭活结束后，立即在灭活病毒液中加入过滤除菌的50％硫代硫酸钠溶液，使终浓度为1％，充分搅拌均匀，置2～8℃保存备用。
(9)支原体菌体灭活按浓缩抗原总量的0.01％加入硫柳汞，充分混匀，在15～25℃作用10小时，期间搅拌数次。灭活结束后，2～8℃保存，应不超过30日，取样进行半成品检验。
(6)疫苗配制根据灭活前山羊支原体活菌滴度测定结果，用pbs(0.01mol/l，ph值7.2)将浓缩后的山羊支原体抗原稀释至每1ml含3×109.0ccu菌体，再与山羊痘病毒av41株灭活病毒液按1:1(v/v)的比例混匀，制成混合抗原，即为水相。将水相和油相分别预热到相同温度，再按质量比(水相:油相＝1:1)真空进料至乳化罐中，加入1％硫柳汞溶液，使硫柳汞终浓度为0.005％，进完料后循环搅拌至水相与油相充分混合，再通过均质机乳化成双相油乳剂疫苗。无菌定量分装，加盖、贴签。
2.二联灭活疫苗的检验
(1)性状
外观淡粉红色或乳白色略带粘滞性乳状液。
剂型水包油包水型(w/0/w)。取一清洁吸管，吸取少许疫苗滴于清洁冷水表面，应呈云雾状扩散。
稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15min，管底析出的水相应不超过0.5ml。
黏度按现行《中国兽药典》(中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典，二〇一五年版三部，中国农业出版社，2015，以下称《中国兽药典》)附录进行检验，应符合规定。
(2)装量检查按《中国兽药典》附录进行检查，应符合规定。
(3)无菌检验按《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
(4)安全检验用3～6月龄的健康易感山羊2只，各颈部两侧肌肉注射疫苗4.0ml，每侧2.0ml，连续观察14日，应不出现由疫苗引起的局部或全身不良反应。
(5)效力检验
羊痘部分：选取健康易感山羊7只，其中5只各颈部皮下或肌肉注射疫苗2.0ml，另2只不接种作为对照。免疫后21日，所有山羊各胸腹侧皮内分两点注射山羊痘强毒av40株病毒液1.0ml(含103.0id50)，0.5ml/点，连续观察15日。对照山羊应全部发病，免疫山羊应至少保护4只。
山羊传染性胸膜肺炎部分：用体重至少为20kg、1～3岁的健康易感山羊5只，各颈部皮下或肌肉注射疫苗2.0ml。21日后连同对照山羊2只，各气管注射山羊支原体山羊肺炎亚种强毒c87002株肺组织乳剂4.0ml，观察30日。对照山羊应全部发病，免疫山羊应至少保护4只。
(6)汞类防腐剂残留量测定按《中国兽药典》附录进行测定，应符合规定。
本发明涉及生物材料资源信息
山羊痘病毒av41株为生产用毒种，山羊痘病毒为av40株检验用毒种，均由中国兽医药品监察所制备并提供(请见中国兽医药品监察所、中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著，中国兽医菌种目录(第二版)，中国农业科学技术出版社，2002年，p142)。
山羊支原体山羊肺炎亚种(m.capricolumsubsp.capripneumoniae,mccp)c87001株生产用基础种子，山羊支原体山羊肺炎亚种c87002株为疫苗检验用菌种，该类菌原分类命名为丝状支原体山羊肺炎亚种(mycoplasmamycoidessuhsp.capriedwardandfreundt)c87001株和c87002株，均由中国兽医药品监察所制备并提供(请见中国兽医药品监察所、中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著，中国兽医菌种目录(第二版)，中国农业科学技术出版社，2002年，p89)。
本发明的积极意义
本发明涉及一种羊痘、山羊传染性胸膜肺炎二联灭活疫苗及其制备方法。本发明采用山羊痘病毒av41株和山羊支原体山羊肺炎亚种c87001株分别接种悬浮培养的bhk-21细胞和适宜培养基培养，收获培养物，经浓缩、纯化，分别用bei和硫柳汞灭活后，按一定比例加入适宜佐剂混合乳化制成。用于预防山羊痘和山羊传染性胸膜肺炎。本发明系国际上首次获得羊痘和山羊传染性胸膜肺炎的二联灭活疫苗，可实现一针两防的目的，同时，采用本发明提出的悬浮培养bhk-21细胞生产羊痘灭活疫苗，较原绵羊睾丸细胞制备的活疫苗具有明显的优势，可解决目前羊痘活疫苗生产过程中面临的绵羊睾丸来源困难、易引起羔羊死亡、母羊流产，以及疫苗需皮内免疫，在临床使用过程中难以操作等问题。
实施例
以下实施例为进一步说明本发明，不对本发明要求保护的技术方案构成限制。
实施例1
——疫苗制备及检验
按照确定的生产工艺，制备了3批羊痘、山羊传染性胸膜肺炎二联灭活疫苗，现将结果报告如下。
1.材料
(1)细胞生产用细胞为bhk-21悬浮细胞。
(2)病毒羊痘病毒av41株和av40株。
(3)菌种生产用菌种：山羊传染性胸膜肺炎支原体c87001株，f8代，活菌滴度为1×109.0ccu/ml；检验用菌种：山羊传染性胸膜肺炎c87002株组织冻干毒，代号87002，代次：52代，规格：1.0g/支，由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应。
(3)油佐剂montanideisa201佐剂，法国seppic公司生产。
(4)实验动物3月龄和1岁龄健康易感内蒙古绒山羊，无传染病、皮肤病和寄生虫感染。免疫前采血测定羊痘病毒中和抗体效价，选取中和抗体效价≤1:4的羊用于试验。
(5)主要设备celligen310生物反应器购自美国nbs公司；小型0.45μm、1.0μm过滤系统购自美国pall公司；jmcdwf100型超滤系统，为北京紫荆嘉地贸易有限公司产品；xd-101型倒置生物显微镜购自德国leica公司；乳化器购自上海弗鲁克科技发展有限公司。pellicon2盒式滤器，采用biomax2万截留分子量，改良聚醚砜材料，0.5m2膜面积膜堆；
2.羊痘抗原制备
(1)细胞制备
从液氮罐中取出bhk-21细胞，迅速置36～37℃水浴解冻，转入装有无血清培养基的无菌离心管中，以800r/min离心5min，用无血清培养液重悬细胞后转入细胞摇瓶，置37℃恒温振荡培养箱中，以160～200r/min振荡培养，当摇瓶细胞密度达到不低于2×106个/ml时，将摇瓶中细胞按0.5×106个/ml的密度注入到一级反应器，并采用同样方法逐级放大到二级反应器，反应器搅拌速度为60～100r/min，溶氧(do)40％～60％，ph值7.0～7.4，温度为36～37℃，培养72～96小时。
(2)病毒繁殖
当生物反应器细胞密度达2×106/ml以上、活率90％以上时，按2％～10％的比例接种病毒液，调整反应器搅拌速度为60～100r/min，溶氧(do)40％～60％，ph值7.0～7.4，36～37℃培养，定时取样观察细胞病变，当细胞病变达到80％以上时收获培养物，注明毒种名称、批号、代次、收获日期，置-20℃以下保存，作为生产用悬浮细胞毒种。
当生物反应器内细胞密度达到2×106/ml以上时，按2％～8％的比例接种av41株悬浮细胞毒。接种后，36～37℃悬浮培养，定时取样观察，若48～72小时内悬浮细胞出现死亡、崩解、破碎，活率小于20％时停止培养，收获培养物，取样进行无菌检验和病毒含量测定。收获细胞培养物，经1.0μm的滤芯过滤后，采用30万截留分子量(mw)超滤浓缩系统浓缩10倍(v/v)，用pbs(0.01mol/l，ph值7.2)将浓缩后的病毒液稀释至原体积，即为制苗用病毒液。
(3)抗原检验
1)无菌检验取少量收获的病毒液，进行无菌检验，应无菌生长。
2)毒价测定取少量收获的病毒液，用mem营养液作10倍系列稀释，取取10-3、10-4、10-53个稀释度，加至96孔细胞培养板，每孔100μl，每个稀释度接8孔。每孔加入含10％小牛血清mem培养液的mdbk细胞悬液100μl(由中国兽医药品监察所制备并提供(请见中国兽医药品监察所、中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著，中国兽医菌种目录，中国农业科学技术出版社，2008年，p155)，同时设正常细胞对照8孔，置37℃含5％co2的培养箱中培养3～4日，观察细胞病变，记录细胞病变孔数，按reed-muench法计算tcid50。每毫升病毒含量应≥105.0tcid50。
(4)灭活
将bea粉加入已灭菌的0.2mol/l的氢氧化钠溶液中，充分溶解，使bea浓度为0.2mol/l，置37℃水浴中，每隔10～15min振摇一次，使bea充分环化1小时后，终止环化，产生二乙烯亚胺(bei)，最终浓度为0.2mol/l。向检验合格的羊痘病毒液中加入bei溶液至终浓度为0.004mol/l，升温至30℃时开始计算灭活时间，温度保持在30±1℃，灭活28小时，其间2～4小时搅拌一次，每次10～15min。灭活结束后，立即在灭活病毒液中加入过滤除菌的50％硫代硫酸钠溶液，使终浓度为1％，充分搅拌均匀，置2～8℃保存备用。
(5)半成品检验
将制备的3批半成品抗原液，分别检测进行灭活前病毒含量检验、无菌检验、灭活检验，结果表明，3批次制备的半成品病毒滴度均大于在105.0tcid50，无菌检验均合格(表1)。
表1羊痘病毒抗原制备及检验结果
3.山羊支原体抗原制备与检验
(1)将山羊传染性胸膜肺炎支原体c87001株生产种子按培养基总量2％的比例接种含15％的马血清ezh液体培养基中，于37℃培养，待培养物ph值下降至7.0左右，收获培养物，收获菌液。采用此方法连续制备3批菌液，同时抽样进行纯粹检验、活菌滴度测定。
(2)抗原检验
1)纯粹检验按《中国兽药典》附录方法检验，均纯粹。
2)活菌滴度测定将待测样品用含15％马血清的ezh液体培养基进行10倍系列稀释至10-12，同时设未加菌液的含15％马血清ezh液体培养基作为阴性对照。置37℃培养7日，培养基颜色改变的最高稀释度即为待测样品的滴度。用3份样品的平均滴度，作为菌液滴度(ccu/ml)。检验结果见表2。
表2实验室3批制品培养菌液的纯粹检验和活菌滴度检验结果
注：“-”表示纯粹检验结果为纯粹。
从表2可以看出，实验室3批制品均纯粹，浓缩前菌液活菌滴度达5×109.0～9×109.0ccu/ml。
(3)制苗抗原的浓缩
将3批检验合格的抗原培养物，分别以2万分子量内压式超滤膜堆浓缩超滤15倍，浓缩后抗原量为原液量的1/30。
(4)菌液的灭活
按0.01％比例将硫柳汞加入浓缩菌液，充分混匀，分别在室温20℃灭活10小时，期间搅拌5次。灭活后，2～8℃保存，并无菌抽样进行半成品检验。
(5)半成品检验
1)无菌检验每批灭活抗原按现行《中国兽药典》附录方法进行检验，均无细菌及霉菌生长。
2)灭活检验取灭活抗原接种含15％马血清的ezh液体培养基2支，每支0.2ml，置37℃培养5日，均无支原体生长。检验结果见表3。
表33批制品的半成品检验结果
注：“-”表示无细、菌霉菌生长。
从表2可以看出，实验室3批制品的抗原灭活完全。
4.疫苗配制
根据灭活前山羊支原体活菌滴度测定结果，用pbs(0.01mol/l，ph值7.2)将浓缩后的山羊支原体抗原稀释至每1ml含3×109.0ccu菌体，再与山羊痘病毒av41株灭活病毒液按1:1(v/v)的比例混匀，制成混合抗原，即为水相。将水相和油相分别预热到相同温度，再按质量比(水相:油相＝1:1)真空进料至乳化罐中，加入1％硫柳汞溶液，使硫柳汞终浓度为0.005％，进完料后循环搅拌至水相与油相充分混合，再通过均质机乳化成双相油乳剂疫苗。乳化后取样进行检验，合格后分装。
5.成品检验
3批经bei完全灭活后的抗原制备成疫苗后，经性状检验呈乳白色略带粘滞性乳状液，剂型为水包油包水型，稳定性和粘度均符合规定；，装量检查均符合规定；无菌检验结果表明，3批疫苗均无菌生长，产品符合标准(表4、表5)。汞类防腐剂残留量均符合兽用生物制品检验的一般规定。
表43批二联灭活疫苗实验室制品性状检验结果
表53批二联灭活疫苗实验室制品装量检查和无菌检验结果
将实验室试制的3批疫苗进行安全性和效力检验，其中安检山羊为3月龄的健康易感山羊。用羊进行的效力检验，采用1岁龄健康易感山羊。结果显示，3批疫苗均安全。用羊进行效力检验，无论是羊痘部分，还是山传部分，对照羊均2/2发病，免疫羊均5/5保护(见表6)，表明疫苗符合成品效力检验标准。
表63批羊痘灭活疫苗(av41株，悬浮培养)实验室制品安全检验和效力检验结果