本发明属于养殖鱼类的疫苗及使用的技术领域，具体涉及一种鱼源副溶血弧菌缓释口服疫苗及制备和使用方法。
背景技术：
我国海水养殖鱼类的病害呈逐年增加的趋势，尤其是弧菌病最为常见，造成了巨大的经济损失。目前国内治疗鱼类细菌性疾病主要是通过使用抗生素类药物，而预防细菌性疾病主要是采用消毒剂、水质改良剂、微生态制剂等方法改善养殖水体生态环境，疫苗的应用并不多见，主要原因是获得正式批文的水产疫苗很少，而且目前国内获得正式批文的疫苗都是注射型疫苗，尽管该类疫苗效果较好，但在免疫实施过程中，工作量大，操作繁琐，易对鱼体产生应激。
长期以来，使用抗生素治疗鱼类病害，使得致病菌耐药性增强，并且造成环境污染以及药物残留等水产品质量安全问题。国家对养殖废水排放加大了监管力度，超标排放养殖废水的企业将面临巨额罚款或关停的风险。国家已经命令禁止使用危害严重的药物，为了有效保护水域生态安全和提高水产品质量，水产养殖生产中应尽量减少药物的使用。
利用疫苗预防疾病在畜禽动物养殖上已经应用广泛，但在水产养殖中规模较小，这与鱼类生活在水中的特殊性有关。目前，国内市售的渔用疫苗都为注射疫苗，渔用注射疫苗存在操作困难、过程繁琐、工作量大、伤口容易感染等问题。口服免疫具备安全易行、操作方便、使用量小、不受鱼类个体大小限制等优势，适宜在生产上推广应用。但口服疫苗面临一个重要的问题，即在口服免疫过程中免疫原容易被胃酸和消化酶破坏以及在前肠被分解吸收导致其免疫效果不佳。
关于副溶血弧菌口服疫苗的研究，现有技术主要有两方面的报道
(1)采用药用淀粉为载体、以丙烯酸树脂为包膜材料制备了副溶血弧菌、溶藻弧菌和迟缓爱德华氏菌三联口服疫苗，免疫大菱鲆保护率达50％。
(2)采用乳化、离子交联法以壳聚糖和海藻酸钠为包被材料制备了副溶血弧菌外膜蛋白k微球口服疫苗，口服免疫大黄鱼免疫保护率达60％；采用乳化—溶剂挥发法以丙烯酸树脂、卵磷脂和液体石蜡为乳化剂制备副溶血弧菌的外膜蛋白k和鞭毛蛋白a的融合蛋白微球口服疫苗，免疫黑石斑鱼，保护率达到50％。
上述两个方法存在的不足是：方法(1)采用药用淀粉为载体、以丙烯酸树脂为包膜材料制备了副溶血弧菌、溶藻弧菌和迟缓爱德华氏菌三联口服疫苗，诱食效果比较差；方法(2)需要提取外膜蛋白，而外膜蛋白含量低，提取较为困难，采用乳化法制备外膜蛋白的微球疫苗工艺复杂、耗时耗力，生产成本较高，难以大规模推广应用。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，鱼源副溶血弧菌缓释口服疫苗及制备和使用方法。
本发明实现目的的技术方案如下：
一种鱼源副溶血弧菌缓释口服疫苗及制备，该缓释口服疫苗由商品化饲料、浓度为6×1010cfu/ml的副溶血弧菌菌液、缓释剂按比例10:1:3，单位为：克:ml:ml配制而成。
而且，所述副溶血弧菌菌液经过了0.5％的甲醛灭活。
鱼源副溶血弧菌缓释口服疫苗及制备，其特征在于：该制备过程的方法如下：
⑴灭活：使用0.5％的甲醛对副溶血弧菌菌液进行灭活；
⑵疫苗制备：
按商品化饲料:浓度为6×1010cfu/ml的副溶血弧菌比例为：10:1，单位为：克:ml，将商品化饲料放入包衣机中，启动转盘，包衣机采用400转/分钟的转速，将灭活副溶血弧菌疫苗缓慢滴入转盘的中央，靠中央转盘的离心力将疫苗喷到饲料上，制备成疫苗饲料，疫苗有效浓度约为6×109cfu/g饲料，放入烘箱37℃烘干备用。
⑶缓释层包衣制备：
①缓释剂制备：羟丙基甲基纤维素(hpmc)：乙基纤维素水分散体(ec含量为25-30％)：柠檬酸三乙酯(tec)：灭菌水的比例为：1.25:20:1:80，单位为克:ml:ml:ml。磁力搅拌过夜，制成缓释剂。
②使用包衣机将缓释剂均匀喷涂于疫苗饲料的表面；疫苗饲料：缓释剂的比例为：10:1，单位为：克:ml，37℃烘干后，重复上述步骤2次。
③缓释效果测定：分别加入饲料总重量的疫苗饲料：缓释剂的比例为：10:3，利用荧光定量pcr法检测副溶血弧菌gyrb基因的拷贝数，判断口服疫苗中副溶血弧菌的释放速度，评价口服疫苗的缓释效果。
挑取疫苗饲料：缓释剂的比例为：10:3的口服疫苗10g放置于含50ml无菌水的三角瓶中，同时取疫苗饲料：缓释剂的比例为：10:0的口服疫苗作为对照。置于摇床中50r/min进行混匀，在2min、5min、10min、15min、30min、60min和120min7个不同时间点进行采集样品，利用荧光定量pcr检测技术测定所取水样中副溶血弧菌gyrb基因的拷贝数，判断口服疫苗中副溶血弧菌的释放速度，评价口服疫苗的缓释效果；同时采用浓度为1×109cfu/ml的副溶血弧菌菌液作模板，进行定量pcr测定，以此判断对照组和疫苗组的疫苗最大释放量。
表1副溶血弧菌口服疫苗缓释效果测定结果(拷贝/μl)
包被组在2min、5min、10min、15min、30min、60min和120min其疫苗的释放量分别为对照组的17.36％、16.17％、22.95％、27.46％、60.16％、88.89％和91.77％，表明该口服疫苗具有较好的缓释作用，且120min时包被组疫苗释放量基本接近对照组。浓度为1×109cfu/ml的副溶血弧菌菌液直接进行实时荧光定量pcr测定时，gyrb基因的拷贝数可达到2.3×106拷贝/μl，经过换算，对照组在120min时疫苗释放量达到总含量的69.62％，包被组在120min时疫苗释放量达到总含量的63.64％。
而且，所述步骤⑵所述制备成的微丸的有效疫苗含量为6×109cfu/g量级水平。
鱼源副溶血弧菌缓释口服疫苗的使用方法，其特征在于：该方法的步骤如下：
⑴首次免疫：将缓释口服疫苗饲料投喂鱼，投喂量与正常饲料相同，每天2次，连续7天；
⑵加强免疫；在首次免疫后的第14-21天开始与首次免疫方法相同的加强免疫。
本发明的优点和效果是：
1、本发明与现有鱼类疫苗制备方法相比，本发明首次制备了副溶血弧菌缓释口服疫苗，并采用投喂接种的方法，操作简单、工作量小，适合大规模接种。
2、本发明采用具有缓释功能的材料进行包衣，延缓了疫苗的释放时间，可有效保护疫苗，可以有足够的时间到达后肠，与后肠黏膜接触，激发免疫应答，获得免疫效果，克服了直接口服免疫效果不佳的问题。
3、本发明充分考虑到鱼的特殊性、生活环境、捕食习性等特点，在配方比例上反复进行实验，科学取值，针对性很强，使用方便，效果非常显著，有很高的市场应用价值。
具体实施方式
下面结合具体实施方案对本发明进一步说明，其具体实施方案应该理解为仅为举例说明，不是限定性的，不能以下述举例说明来限定本发明的保护范围。
一种鱼源副溶血弧菌缓释口服疫苗，该缓释口服疫苗由商品化饲料、浓度为6×1010cfu/ml的副溶血弧菌菌液、缓释剂按比例10:1:3，单位为：克:ml:ml配制而成。
在本发明的具体实施中，所述副溶血弧菌菌液在使用前要经过0.5％的甲醛灭活。
鱼源副溶血弧菌缓释口服疫苗的制备，该制备过程的方法如下：
⑴灭活：使用0.5％的甲醛对副溶血弧菌菌液进行灭活；
⑵疫苗制备：
按商品化饲料:浓度为6×1010cfu/ml的副溶血弧菌比例为：10:1，单位为：克:ml，将商品化饲料放入包衣机中，启动转盘，微丸机采用400转/分钟的转速，将灭活副溶血弧菌疫苗缓慢滴入转盘的中央，靠中央转盘的离心力将疫苗喷到饲料上，制备成疫苗饲料，疫苗有效浓度约为6×109cfu/g饲料，放入烘箱37℃烘干备用。
⑶缓释层包衣制备：
①缓释剂制备：羟丙基甲基纤维素(hpmc)：乙基纤维素水分散体(ec含量为25-30％)：柠檬酸三乙酯(tec):灭菌水的比例为：1.25:20:1:80，单位为克:ml:ml:ml。磁力搅拌过夜，制成缓释剂。
②使用包衣机将缓释剂均匀喷涂于疫苗饲料的表面；疫苗饲料：缓释剂的比例为：10:1，单位为：克:ml，37℃烘干后，重复上述步骤1-2次。
鱼源副溶血弧菌缓释口服疫苗的使用方法，其特征在于：该方法的步骤如下：
⑴首次免疫：每天将缓释口服疫苗饲料投喂鱼，投喂量与正常饲料相同，每天2次，连续7天；
⑵加强免疫；在首次免疫后的第14-21天开始与首次免疫方法相同的加强免疫。
副溶血弧菌缓释口服疫苗及其制备实例
鱼源副溶血弧菌缓释口服疫苗的制备，该缓释口服疫苗制剂的配方如下：1000g商品化饲料放入包衣机中，将100ml经过0.5％的甲醛灭活的副溶血弧菌(浓度为6×1010cfu/ml)，缓慢喷涂于饲料上，自然晾干或低温烘干，疫苗有效含量为6×109cfu/g。将1.3g羟丙基甲基纤维素、20ml乙基纤维素水分散体(ec含量为25％-30％)、1ml柠檬酸三乙酯(tec)、80ml灭菌水混合，搅拌过夜，制备出100ml缓释剂。将100ml缓释剂使用包衣机均匀喷涂于疫苗微丸的表面，自然晾干或低温烘干，重复包缓释剂2次。
副溶血弧菌缓释口服疫苗的使用方法实例1
将上述制备的疫苗饲料免疫大菱鲆，大菱鲆规格为102±11.2克。投喂量与正常饵料投喂量相同正常饵料，连续投喂7天，间隔14天加强免疫7天。
水族箱小水体免疫大菱鲆实验，设计两个组，对照组和缓释口服免疫组，每组3个重复。缓释口服免疫组每天投喂制备的缓释口服疫苗2次，连续投喂7天，然后投喂正常饵料；对照组投喂正常颗粒饵料。间隔7天采血一次，每组采3尾鱼，采用酶联免疫吸附试验(elisa)测定血清中的抗体水平。28天后，试验鱼和对照鱼进行副溶血弧菌(菌液浓度为3×108cfu/ml)进行人工感染，每尾鱼注射0.2ml，14天后统计两组鱼的死亡率，并计算免疫保护率。结果见表2。
表2口服免疫后大菱鲆血清中抗体效价均区间
缓释口服免疫组血清中的副溶血弧菌的抗体效价在28天时达到最大值，抗体水平都明显高于对照组。缓释口服免疫组鱼的人工感染试验，相对免疫保护率达到57.12％。结果证明投喂本发明的副溶血弧菌缓释口服疫苗可以明显提高大菱鲆对副溶血弧菌的抵抗力。
副溶血弧菌缓释口服疫苗的使用方法实例2
车间养殖试验：
养殖模式：工厂化养殖；养殖鱼类：牙鲆，大小为89±15.2克；共6个试验池，其中试验池3个，对照池3个。首次免疫：每天投喂2次，连续投喂7天；加强免疫：首次免疫21天后，每天投喂2次，投喂7天。对照池投喂普通饵料，其它养殖及管理方法相同。2个月后每个池采集5尾鱼血清，采用凝集法测定抗体效价，并取50尾牙鲆进行副溶血性弧菌(菌液浓度为3×108cfu/ml)人工感染实验，每尾鱼注射0.2ml，统计14天内死亡率，计算免疫保护率。试验结果见表3。
表3牙鲆的血清抗体效价及免疫保护率
实验池副溶血弧菌效价区间为128-256，远高于对照池的8-16；攻毒试验显示免疫保护率达到55.56％。结果证明，养殖效果缓释口服疫苗免疫实验池效果明显优于对照池。工厂化养殖投喂本发明的副溶血弧菌缓释口服疫苗可有效地预防牙鲆感染副溶血弧菌病，提高养殖成活率。