一种香菇菌丝的转色菌丝菌皮醇提取物的制备方法及用途与流程

本发明属于生物医药领域，涉及一种香菇，具体来说是一种香菇菌丝的转色菌丝和菌皮的乙醇提取物的制备方法及用途。

背景技术：

抗菌药物是临床应用最广的一类药物，但是目前这类药物的应用存在着许多问题，如耐药性、毒副作用等。尤其是细菌的耐药性发展比较快，使得对这类菌所致的严重感染没有有效的药物可以使用，对人类健康造成较大威胁。因此，目前人们从天然资源中发展新的抗菌药物作为抗菌药物研究的一个重点。

香菇[lentinulaedodes(berk.)pegler.]，俗称冬菇，是世界第二大食用菌，其栽培始源于中国，至今已有800年以上的历史。在1989年，中国香菇总产量首次超过日本，一跃成为世界香菇生产第一大国。香菇防治癌症的范围广泛，已用于临床治疗。香菇还含有多种维生素、矿物质，对促进人体新陈代谢，提高机体适应力有很大作用。实际生产过程中，香菇栽培周期至少可以分为四个重要阶段，分别为营养菌丝生长阶段、菌丝后熟与转色形成阶段、原基形成阶段、子实体生长发育阶段。迄今，香菇菌丝后熟与转色形成阶段的菌棒表层的转色菌皮具体功效包括体外抑菌活性方面未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种香菇菌丝的转色菌皮醇提取物的制备方法及用途，所述的这种香菇菌丝的转色菌皮的醇提取物的制备方法及用途要解决现有技术中用于治疗肿瘤的药物具有毒副作用，同时香菇菌丝的转色菌皮没有得到有效利用的技术问题。

本发明提供了一种香菇菌丝的转色菌丝菌皮醇提取物的制备方法，包括如下步骤：

1)将香菇菌丝的转色菌丝和菌皮从香菇菌包上取下，然后进行干燥，干燥后粉碎过40-200目筛；

2)称取转色菌丝菌皮粉，按质量比为l：20～50的比例加入质量百分比浓度为60～70％的乙醇，80～100℃的水浴条件下提取2～8小时，重复提取3～6次，合并滤液，然后进行抽滤，获得提取液；

3)将提取液置于-90～-50℃的条件下冷冻12-24小时，然后用真空冷冻干燥机干燥，浓缩，得到得香菇菌丝的转色菌丝菌皮醇提取物。

本发明还提供了通过上述的方法获得的香菇菌丝的转色菌丝菌皮醇提取物。

本发明还提供了上述的香菇菌丝的转色菌丝菌皮醇提取物在制备抗肿瘤药物、抗肿瘤试剂、抗肿瘤食品或者抗肿瘤保健制品中的应用。

进一步的，所述的肿瘤细胞为人肺癌细胞spca-1或者腺癌人类肺泡基底上皮细胞a549。

本发明还提供了一种药物组合物，含有上述的香菇菌丝的转色菌丝菌皮醇提取物。

本发明以废弃的香菇栽培菌包的转色菌丝菌皮为原料，经过刮取粉碎、热水提取、减压浓缩(抽滤)、干燥等步骤，得到一种具有高抗肿瘤活性作用的香菇菌丝转色菌皮的乙醇提取物。以人肺癌细胞spca-1和腺癌人类肺泡基底上皮细胞a549为受试肿瘤细胞，采用体外抑制肿瘤生长和杀死肿瘤细胞方法对其抗肿瘤效果进行了检测，结果显示，香菇菌丝的转色菌皮的乙醇提取物具有较强的抗人肺癌细胞spca-1和腺癌人类肺泡基底上皮细胞a549作用。其抗肿瘤细胞效果与香菇菌丝的非转色的菌丝和菌皮的乙醇提取物进行比较，具有显著抑制肿瘤细胞的效果。本发明的香菇菌棒的转色菌皮提取物可作为提高免疫力和抗肿瘤类药物制剂的原料，制成片剂、胶囊、复方制剂等，应用于食品、药品等行业。

本发明和已有技术相比，其技术效果是积极和明显的。本发明以香菇菌丝的转色菌丝和菌皮为原料，进行抗肿瘤提取物的研制，可以作为天然的食品和药品抗肿瘤剂，实现香菇的转色菌丝和菌皮的综合利用。

附图说明

图1显示了香菇菌丝转色菌皮与未转色菌丝醇提取物作用下肿瘤细胞a549存活率和致死速率的比较效果。

图2显示了香菇菌丝转色菌皮与未转色菌丝醇提取物作用下肿瘤细胞spca-1存活率和致死速率的比较效果。

具体实施方式

以下通过抑制肿瘤细胞活性实验来进一步证明本发明的有益效果：

实施例1

1)将香菇菌丝的转色菌丝和菌皮从香菇菌包上取下，然后进行干燥，干燥后粉碎过40-200目筛；

2)称取20g转色菌丝菌皮粉，加入1000ml的质量百分比浓度为70％的乙醇，80～100℃的水浴条件下提取4小时，重复提取5次，合并滤液，然后进行抽滤，获得提取液；

3)将提取液置于-90～-50℃的条件下冷冻12小时，然后用真空冷冻干燥机干燥24小时，浓缩，得到得香菇菌丝的转色菌丝菌皮醇提取物。

采用mtt法测定香菇菌丝的转色菌丝菌皮醇提取物对肿瘤细胞的抑制作用。其中转色菌丝菌皮的乙醇提取物，以及作为对照的未转色的菌丝菌皮的乙醇提取物的设定梯度为10、100、1000μg/ml。

步骤如下：

1)收集对数期细胞，细胞长到密度约为80-90％的时候，将其消化离心收集，去掉上清液，加入2ml培养基，使其混合均匀；

2)调整细胞悬液浓度(细胞浓度为5-10×10⁴个/ml)，每孔加入100ul(96孔板边缘32孔用无菌的pbs填充，因为边缘的孔中水分蒸发很快，药物易被浓缩，对实验影响大)；

3)5％co2，37℃孵育24小时，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)；

4)先吸去孔中培养液，再加入浓度梯度的香菇菌丝菌皮的乙醇提取物，提取物的浓度梯度：0μg、10μg、100μg、1000μg每个浓度设置三个重复，5％co2，37℃孵育24小时，倒置显微镜下观察；(加样品蛋白之前，蛋白要进行过滤除菌)

5)每孔加入10ulmtt溶液(5mg/ml，即0.5％mtt)，继续培养4h；

6)终止培养，小心吸去孔内培养液；

7)每孔加入150ulmtt，置摇床上低速振荡3min，使结晶物充分溶解；

8)在酶联免疫检测仪od570nm和od630nm处测量各孔的吸光值。

实验结果如下：

抑制肿瘤细胞a549的测试结果，肿瘤细胞的存活率和致死速率作用分别如表1和图1所示。抑制肿瘤细胞spca-1的测试结果，肿瘤细胞的存活率和致死速率作用分别如表2和图2所示。

表1香菇菌丝转色菌皮与未转色菌丝醇提取物对肿瘤细胞a549存活率比较

由表1和图1可知，相对未转色菌丝的醇提取物，香菇菌棒转色菌皮的醇提取物对肿瘤细胞a549有较好的抗肿瘤效果，其对对肿瘤细胞a549的较好浓度为1000ug/ml。

表2香菇菌丝转色菌皮与未转色菌丝醇提取物对肿瘤细胞spca-1存活率比较

由表2和图2可知，相对未转色菌丝的醇提取物，香菇菌棒转色菌皮的醇提取物对肿瘤细胞spca-1有较好的抗肿瘤效果，其对对肿瘤细胞spca-1的较好浓度为1000ug/ml。