一种二硫化钼纳米载药复合物及其制备方法和应用与流程

本发明属于靶向纳米材料技术领域，特别涉及一种二硫化钼纳米载药复合物及其制备方法和应用。

背景技术：

近年来，新型纳米材料和先进的纳米技术促进了有效肿瘤治疗新方案的快速发展。在癌症治疗领域协同疗法正引起越来越多人的关注，光热疗法与化学疗法的结合可以进一步提高癌症治疗的效果。这种联合治疗可以通过刺激响应药物递送系统来传递。作为一种具有最小的非侵入性治疗方案，光热治疗(ptt)由于其渗透到组织中的能力，较少的生物组织吸收和较低的副作用而受到越来越多研究者的关注。光热治疗(ptt)通过光吸收剂将近红外(nir，700-1100nm)光转换成热能导致肿瘤的热消融。

二维纳米材料石墨烯由于其理想的物理和化学性质被广泛用于生物医学领域中疾病诊断和治疗的纳米器件或纳米剂的开发。随着石墨烯的发现，二维(2d)过渡金属二硫化物(tmdcs)纳米材料由于其独特的电子特性，高比表面积和高吸光度而引起了广泛关注。作为tmdc的典型代表，mos2纳米片具有高nir吸光度和低毒性，使其成为下一代光热转换材料的合适候选。特别是，其组成元素mo是细胞中几种酶的必需微量元素，s是一种常见的生物元素。然而，由于其高表面能，几层纳米片往往不可避免地重新堆积和聚集，这极大地限制了其应用。此外，制备的mos2纳米片的胶体稳定性不理想，而这对于其在生物医学领域的应用至关重要。因此，迄今为止基于mos2的靶向递送系统(dds)的研究受到限制。

本研究组之前研究了基于功能化的mos2纳米片以及将化学疗法和光热疗法相组合进行靶向药物递送，但协同治疗的效果并不理想。另外，张等人报道了一种基于黑色素的纳米脂质体治疗诊断纳米系统，具有高生物安全性和良好的治疗特性。更重要的是，制备的lip-mel纳米脂质体具有理想的光热转换效率，可以实现乳腺癌荷瘤小鼠肿瘤的完全根除，并具有显着的光热治疗性能。黑色素是人体内源性生物色素，具有固有的光学吸收能力，主要存在于皮肤，毛囊和眼睛中。最近的研究表明，基于黑色素的纳米粒子可用作光声成像(pai)和磁共振成像(mri)的多功能造影剂，具有理想的生物安全性和较低的副作用。由于其固有的光学性质和令人满意的生物相容性，基于黑色素的纳米平台在诊断成像和光热疗法中显示出巨大的前景。

刘等人报道了用peg修饰的mos2纳米片同时负载化疗药物dox用于肿瘤的化学-光热协同治疗，具有一定的治疗效果，但同时存在药物载体不能很好的被肿瘤细胞摄取的缺陷，此外，通过修饰的mos2纳米片光热效果有所下降(liut,wangc,gux,etal.drugdeliverywithpegylatedmos2nano-sheetsforcombinedphotothermalandchemotherapyofcancer[j].advancedmaterials,2014,26(21):3433-3440.)。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种二硫化钼纳米载药复合物及其制备方法和应用，克服了目前的一些药物载体不能被肿瘤细胞有效摄取以及mos2纳米片基的纳米复合物化学-光热协同治疗效果差的缺陷。

本发明的一种二硫化钼纳米载药复合物，包括二硫化钼mos2纳米片、修饰单元巯基-聚乙二醇sh-peg、靶向单元α-硫辛酸-聚乙烯亚胺连接透明质酸ha-pei-la、阿霉素dox和黑色素mel。

所述mos2纳米片的厚度为1.8-3.0nm。

所述ha的分子量为0.5kda。

所述pei的分子量为1.8kda。

本发明还提供了上述二硫化钼纳米载药复合物的制备方法，包括：

(1)将钼酸钠和硫代乙酰胺分散在水中，超声后搅拌至溶解，反应，离心，得到mos2纳米片；其中，钼酸钠和硫代乙酰胺的质量比为1:0.5-1:3；

(2)将pei溶解在水中，调节ph至7.0-7.5，将α-硫辛酸la溶解在乙腈中，活化处理，然后加入到pei溶液中，搅拌过夜后透析、冷冻干燥得到la-pei，加入到步骤(1)得到的mos2的水溶液中，超声，得到mos2-la-pei；其中，pei和α-la的摩尔比为1:1-1:3；la-pei和mos2的质量比为10:1-15:1；

(3)将步骤(2)得到的mos2-la-pei溶解在水中，加入sh-peg，超声，磁力搅拌反应，得到pei-la-mos2-sh-peg，与ha溶液混合，活化处理，继续搅拌反应，离心，透析，得到ha-pei-la-mos2-sh-peg；其中，mos2-la-pei和sh-peg的质量比为1:7-1:10；pei-la-mos2-sh-peg和ha溶液的用量比为2-3mg:1ml；

(4)将步骤(3)得到的ha-pei-la-mos2-sh-peg和dox在超纯水中混合，磁力搅拌反应，离心，透析，冷冻干燥，得到ha-pei-la-mos2-sh-peg(dox)；其中，ha-pei-la-mos2-sh-peg和dox的质量比为1:1-4:1；

(5)将步骤(4)得到的ha-pei-la-mos2-sh-peg(dox)与光热剂黑色素在超纯水中混合，磁力搅拌反应，离心，透析，冷冻干燥，得到纳米载药复合物ha-pei-la-mos2-sh-peg(dox/mel)；其中，ha-pei-la-mos2-sh-peg(dox)和mel的质量比为5:1-10:1。

所述步骤(1)中超声的时间为5-15min。

所述步骤(1)中反应的工艺参数为：反应温度为180-260℃，反应时间为22-26h。

所述步骤(2)中超声的时间为20-90min。

所述步骤(2)和(3)中活化处理的条件为：采用摩尔比为1:1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐edc和n-羟基丁二酰亚胺nhs进行活化。

所述步骤(3)中超声的时间为20-30min。

所述步骤(3)中搅拌反应的时间为10-14h。

所述步骤(3)中继续搅拌反应的时间为12-24h。

所述步骤(4)中磁力搅拌反应的时间为10-14h。

所述步骤(5)中磁力搅拌反应的时间为10-14h。

本发明还进一步提供了上述二硫化钼纳米载药复合物在肿瘤靶向及协同治疗中的应用。

本发明制得的ha-pei-la-mos2-sh-peg(dox)进行药物释放实验的方法，包括：

(1)配制dox磷酸缓冲溶液及醋酸缓冲溶液，于紫外分光光度计中检测最大吸收值，并拟合两种ph环境下的dox标准曲线；

(2)将ha-pei-la-mos2-sh-peg(dox)载药复合材料溶于缓冲溶液中，置于两个透析袋中，然后分别将透析袋放入两种ph值中振荡一定时间，于不同时间点取样，并补充缓冲液，得到ph响应药物释放曲线。

(3)将ha-pei-la-mos2-sh-peg(dox)载药复合材料溶于醋酸盐缓冲溶液中，置于透析袋中，然后分别用不同功率照射一定时间内，于不同时间点取样，并补充缓冲液，得到近红外光热响应药物释放曲线。

所述步骤(1)中磷酸缓冲溶液的ph值为7-7.5；醋酸缓冲溶液的ph值为5-6。

所述步骤(1)中所述dox标准曲线dox浓度为0.005～0.08mg/ml。

所述步骤(2)中两种ph值分别为：ph值为7-7.4的磷酸缓冲溶液、ph值为5-6的醋酸缓冲溶液；振荡时间为24h-72h，体积均为50ml。

所述步骤(2)中药物释放所需的ha-pei-la-mos2-sh-peg(dox)载药复合材料为1～4mg。

所述步骤(3)中药物释放所需的ha-pei-la-mos2-sh-peg(dox)载药复合材料为1～4mg，醋酸缓冲溶液的ph值为5-6；激光的波长为808nm，照射功率1.0-2.0w/cm²，照射时间为1-5min；振荡时间为24h-72h，体积均为50ml。

本发明通过聚乙二醇修饰二硫化钼，达到增加载药复合物稳定性的作用。通过近红外光的照射，使得载药复合物通过内吞途径进入细胞后，因为光热效应引起的局部加热使内体膜不稳定，从而促进药物及其载体从核内体中逃逸，达到大多数抗癌药物迅速释放到细胞溶质中的效果。从而大大提高药物的疗效。

本发明在peg修饰mos2纳米片的基础上，通过硫辛酸修饰的聚乙烯亚胺作为连接臂接枝靶向分子透明质酸使其具有主动靶向cd44受体高表达的癌细胞的能力提高化疗药物在肿瘤细胞的积累，同时，黑色素作为一种内源性生物色素，可生物降解，并且有文献报道黑色素可以作为良好的光热剂，可用于肿瘤细胞的光热治疗，所以黑色素mel的负载可以一定程度上改善peg修饰的mos2纳米片的光热效果，从而提高对肿瘤细胞的光热治疗效果。

有益效果

(1)本发明的ha-pei-la-mos2-sh-peg(dox)载药复合材料药物装载量高，可达94.43％，且能够长效缓释，且具有ph及近红外光双响应药物释放能力，在较低ph值环境下释放率高，适合肿瘤组织的微环境；且在较低功率的激光照射下产生过高热促进药物释放，具有肿瘤长效缓释的潜力。

(2)本发明的方法简单，反应条件温和，易于操作，具有产业化实施的前景；

(3)本发明得到的纳米颗粒具有较好的水分散性，及生物相容性，具有应用于肿瘤靶向及协同治疗的前景。

(4)本发明的ha-pei-la-mos2-sh-peg(dox/mel)载药复合材料中的ha基团可以实现其对乳腺癌细胞的主动靶向作用，提高化疗药物的疗效。

附图说明

图1为实施例1中合成的二硫化钼纳米片的tem图谱；

图2为实施例2中产物载药前后的紫外(a)以及pei-la-mos2与产物的红外图谱(b)；

图3为实施例3中合成各部分产物的zeta电势变化；

图4为实施例3中ha-pei-la-mos2-sh-peg的水动力学直径变化；

图5为实施例4中负载dox的ha-pei-la-mos2-sh-peg在不同条件的体外释放行为；

图6为实施例5中载上黑色素后在同一激光照射功率不同浓度(a)以及同一浓度不同激光照射功率下(b)的光热效果图；

图7为实施例6中不同浓度梯度下不同处理组材料对mcf-7(右)和l929(左)两种细胞的mtt细胞毒性结果。

图8为实施例1中sh-peg修饰前后的载体在水中的分散效果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

(1)将3g钼酸钠和6g硫代乙酰胺分散在300ml水中，超声10min后搅拌至溶解。在220℃下，反应24h，离心收集黑色沉淀，得到二硫化钼纳米片。

(2)将360mg聚乙烯亚胺溶解在20ml水中，调节ph至7.4，将82.4mgα-硫辛酸溶解在20ml乙腈中，加入191mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐edc/115mg的n-羟基丁二酰亚胺nhs搅拌均匀后，加入到聚乙烯亚胺溶液中搅拌过夜后放入透析袋(mw＝1,000)透析、冷冻干燥得到la-pei。将30mg的la-pei加入到2.5mg步骤(1)得到的二硫化钼的10ml水溶液中，超声30min，得到mos2-la-pei。

(3)将步骤(2)得到的1.5mgmos2-la-pei溶解在3ml水中并加入15mgsh-peg，超声30min，磁力搅拌12h，得到pei-la-mos2-sh-peg；随后将50mg所得产物与透明质酸溶液20ml混合，加入等摩尔比的edc和nhs，搅拌12h，5000rpm离心后放入透析袋(mw＝8,000～14,000)透析后，得到ha-pei-la-mos2-sh-peg。

对本实施例制得的ha-pei-la-mos2-sh-peg进行形貌表征，tem图谱结果如图1所示，可以看出单层二硫化钼的厚度在1.8-3.0nm之间。

本实施例sh-peg修饰前后的载体在水中的分散效果如图8所示，可知本发明得到的纳米颗粒具有较好的水分散性。

实施例2

(1)将6g钼酸钠和12g硫代乙酰胺分散在500ml水中，超声12min后搅拌至溶解。在220℃下，反应26h，离心收集黑色沉淀，得到二硫化钼纳米片。

(2)将300mg聚乙烯亚胺溶解在20ml水中，调节ph至7.2，将80mgα-硫辛酸溶解在18ml乙腈中，加入200mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐edc/100mg的n-羟基丁二酰亚胺nhs搅拌均匀后，加入到聚乙烯亚胺溶液中搅拌过夜后放入透析袋(mw＝1,000)透析、冷冻干燥得到la-pei。将40mg的la-pei加入到3mg步骤(1)得到的二硫化钼的15ml水溶液中，超声20min，得到mos2-la-pei。

(3)将步骤(2)得到的2mgmos2-la-pei溶解在4ml水中并加入15mgsh-peg，超声30min，磁力搅拌12h，得到pei-la-mos2-sh-peg；随后将30mg所得产物与透明质酸溶液15ml混合，加入等摩尔比的edc和nhs，搅拌24h，5000rpm离心后放入透析袋(mw＝8,000～14,000)透析后，得到ha-pei-la-mos2-sh-peg。

(4)将步骤(3)得到的ha-pei-la-mos2-sh-peg和dox按质量比1:1在20ml超纯水中混合，磁力搅拌12h，离心，透析，冷冻干燥，得到ha-pei-la-mos2-sh-peg(dox)。

对本实施例制得的各级产物进行结构确证，ha-pei-la-mos2-sh-peg载体载药前后的紫外图谱如图2a所示，可以证明药物负载到产物载体上。mos2-la-pei和ha-pei-la-mos2-sh-peg的红外图谱如图2b所示，可以证明ha已成功地结合到了pei-la-mos2上。

实施例3

(1)将5g钼酸钠和8g硫代乙酰胺分散在400ml水中，超声8min后搅拌至溶解。在220℃下，反应22h，离心收集黑色沉淀，得到二硫化钼纳米片。

(2)将400mg聚乙烯亚胺溶解在25ml水中，调节ph至7.4，将85mgα-硫辛酸溶解在25ml乙腈中，加入180mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐edc/105mg的n-羟基丁二酰亚胺nhs搅拌均匀后，加入到聚乙烯亚胺溶液中搅拌过夜后放入透析袋(mw＝1,000)透析、冷冻干燥得到la-pei。将25mg的la-pei加入到2mg步骤(1)得到的二硫化钼的10ml水溶液中，超声25min得到mos2-la-pei；

(3)将步骤(2)得到的1mgmos2-la-pei溶解在2ml水中并加入10mgsh-peg，超声25min，磁力搅拌10h，得到pei-la-mos2-sh-peg；随后将80mg所得产物与透明质酸溶液30ml混合，加入等摩尔比的edc和nhs，搅拌14h，6000rpm离心后放入透析袋(mw＝8,000～14,000)透析后，得到ha-pei-la-mos2-sh-peg。

(4)将本发明的ha-pei-la-mos2-sh-peg和dox分别按照质量比1:1、1:2、1:4在超纯水中混合，磁力搅拌反应12h，离心，透析，冷冻干燥，得到不同载药量的ha-pei-la-mos2-sh-peg(dox)。

对本实施例合成产物进行理化性能测试，mos2纳米片、pei-la-mos2、pei-la-mos2-peg、ha和ha-pei-la-mos2-sh-peg的zeta电位变化结果如图3所示，ha-pei-la-mos2-sh-peg的水动力学直径变化结果如图4所示，通过zeta电位和dls的检测可以证明材料已成功合成。

计算本实施例制得的ha-pei-la-mos2-sh-peg(hpmp)的药物负载效率，结果如表1所示，可知本发明的ha-pei-la-mos2-sh-peg(dox)载药复合材料药物装载量较高，最高可达94.43％，高于一般的药物递送载体40％左右。

表1ha-pei-la-mos2-sh-peg(hpmp)的药物负载效率

实施例4

本发明的ha-pei-la-mos2-sh-peg载药体系进行药物释放实验的方法：

(1)配制dox磷酸缓冲溶液及醋酸缓冲溶液，于紫外分光光度计中检测最大吸收值，并拟合两种ph环境下(5.8，7.4)的dox标准曲线；

(2)将3mgha-pei-la-mos2-sh-peg载药复合材料溶于3ml缓冲溶液中，置于两个透析袋中，然后分别将透析袋置于ph5.8和ph7.0的缓冲溶液中振荡，于不同时间点取样，补充新鲜缓冲液，得到ph响应药物释放曲线。

(3)将3mgha-pei-la-mos2-sh-peg载药复合材料分别溶于3ml不同ph缓冲溶液(5.8和7.4)中，置于透析袋中，然后分别用808nm,1w/cm²的激光照射5min，随后置于摇床中振荡，与不同的时间点取样检测，并补充缓冲液，得到近红外光热响应药物释放曲线。

dox在两种ph环境下及有无近红外激光照射条件下的释放曲线如图5所示。可见不同ph下药物释放存在显著差异，且近红外激光照射可显著提高药物的释放，肿瘤组织较正常组织细胞相比其ph要低，该载药材料的释放正好符合这一特性。表明该载药复合材料是一种可以用于肿瘤治疗的ph/光多重刺激响应型药物载体。

实施例5

本发明的ha-pei-la-mos2-sh-peg负载黑色素后材料的光热效果研究：

(1)将载体ha-pei-la-mos2-sh-peg与黑色素按质量比例5：1在20ml超纯水中混合，磁力搅拌12h，离心、透析冷冻干燥得到ha-pei-la-mos2-sh-peg/mel。

(2)将材料配成浓度分别为0.4，0.6，0.8，1.0mg/ml的溶液，然后在1w/cm²的激光照射功率密度下，测试5min时间内不同浓度同一照射功率下溶液的温度变化。

(3)将材料配成浓度为1mg/ml的溶液，然后在不同的激光照射功率下，测试同一浓度不同功率下材料的光热效果。

载上黑色素的纳米复合材料的体外光热效果如图6所示，其中图6a为在同一激光照射功率不同浓度的光热效果图，图6b为同一浓度不同激光照射功率下的光热效果图，可知不同浓度，同一激光照射功率的情况下，浓度越大，5min内溶液的温度升高越快；同一浓度，不同激光照射功率的情况下，激光照射功率越大，5min内温度升高的越快。结果表明，光热剂黑色素的加载显著提高了材料的光热效果，具有应用于肿瘤光热治疗的潜力。

实施例6

将本发明的ha-pei-la-mos2-sh-peg(dox/mel)载药复合材料对两种细胞进行检测，验证其靶向性及化疗光热协同治疗效果：

(1)在96孔细胞培养板中种入mcf-7细胞和l929细胞，每孔细胞密度大约为10,000个，并补足每孔200μl的培养液，在5％co2的条件下于培养箱中培养24h。

(2)第二天倒掉旧培养基，加入含有不同浓度的dox、ha-pei-la-mos2-sh-peg和ha-pei-la-mos2-sh-peg(dox)，ha-pei-la-mos2-sh-peg(mel)+nir，ha-pei-la-mos2-sh-peg(dox)+nir，pei-la-mos2-sh-peg(dox/mel)+nir，ha-pei-la-mos2-sh-peg(dox/mel)+nir的20μl的pbs溶液，并补足180μl新鲜培养基，使每孔总体积仍为200μl，孵育24h。

(3)孵育24h后，每孔加20μl的0.5％的mtt溶液和180μl培养液，置37℃恒温箱中静止4h，吸去孔内培养液，并添加200μldmso，置摇床上避光低速振荡15-20min，使用酶联免疫检测仪570nm处各孔的紫外吸收值。

载药复合物及纯药dox对mcf-7(右)和l929(左)两种细胞的mtt分析结果如图7所示，可知dox浓度在1.5-24μg/ml的情况下均对mcf-7和l929细胞产生了较大的毒性。进一步验证复合载药材料对细胞的杀伤作用与其中的dox浓度有关。此外，在近红外激光照射下，ha-pei-la-mos2-sh-peg(dox/mel)处理的细胞组存活率最低，说明该复合材料具有较好的协同治疗效果。同时对药物载体进行了mtt检测，与载药复合物中dox浓度相同的载体材料均不产生细胞毒性，无论是对于l929还是mcf-7细胞，细胞活力都在95％以上，也验证了材料具有良好的生物相容性，可应用于生物医学领域。对于mcf-7细胞，没有靶向分子的载体处理的细胞活力23％明显高于有靶向分子的载体处理的细胞的细胞活力17％，也证明了本发明的ha-pei-la-mos2-sh-peg(dox/mel)载药复合材料中的ha基团可以实现其对乳腺癌细胞的主动靶向作用，提高化疗药物的疗效。

对比例1

刘等人报道了一种peg修饰的mos2纳米片作为药物载体负载化疗药物阿霉素dox用于肿瘤的化疗-光热协同治疗(liut,wangc,gux,etal.drugdeliverywithpegylatedmos2nano-sheetsforcombinedphotothermalandchemotherapyofcancer[j].advancedmaterials,2014,26(21):3433-3440.)。在808nm1.0w/cm²近红外激光照射下，浓度为0.8mg/ml的该纳米混合物溶液照射五分钟温度仅升高了16℃，而本发明所制备的载体在相同浓度、相同的激光照射条件下温度升高了28℃，说明光热剂黑色素的加载显著提高了该纳米载体的光热效果；此外，通过体外细胞毒性实验对比表明，本发明所制备的纳米复合物(dox浓度为24μg/ml)处理的肿瘤细胞活力17％明显低于刘等人报道的文献中相同dox浓度的纳米复合物处理的肿瘤细胞的细胞活力25％，从而证明本发明具有良好的肿瘤化学-光热协同治疗效果，具有应用于肿瘤治疗的潜力。