一种治疗急性冠脉综合征的中药组合物及其制备方法与流程

本发明涉及急性冠脉综合征治疗技术领域，尤其涉及一种治疗急性冠脉综合征的中药组合物及其制备方法。

背景技术：

急性冠状动脉综合征(acs)是以冠状动脉粥样硬化斑块破裂或侵袭，继发完全或不完全闭塞性血栓形成为病理基础的一组临床综合征，包括急性st段抬高性心肌梗死、急性非st段抬高性心肌梗死和不稳定型心绞痛(ua)。

acs是一种常见的严重的心血管疾病，是冠心病的一种严重类型。常见于老年、男性及绝经后女性、吸烟、高血压、糖尿病、高脂血症、腹型肥胖及有早发冠心病家族史的患者。acs患者常常表现为发作性胸痛、胸闷等症状，可导致心律失常、心力衰竭、甚至猝死，严重影响患者的生活质量和寿命。如及时采取恰当的治疗方式，则可大大降低病死率，并减少并发症，改善患者的预后。

现阶段，针对急性冠状动脉综合征的治疗主要包括溶栓治疗、经皮冠状动脉介入(pci)治疗以及通过服用西药类药物进行抗栓治疗和抗心肌缺血治疗等。但是仍有一部分人群，因介入时间窗和经济条件的原因，需要具有临床效果的中药产品。而目前已知的中药产品大部分局限于冠心病心绞痛这一亚型的治疗，而没有用于包括冠心病不稳定性心绞痛、非st段抬高型心肌梗死以及血液重建后冠心病在内的急性冠脉综合征的全面治疗的中药产品。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种治疗急性冠脉综合征的中药组合物及其制备方法，该中药组合物能够用于冠心病不稳定性心绞痛、非st段抬高型心肌梗死以及血液重建后冠心病的治疗，以及st段抬高型心肌梗死的辅助治疗。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种治疗急性冠脉综合征的中药组合物，包括以下重量份的原料：金银花20～50份、红景天20～50份、水蛭5～20份、瓜蒌10～50份、玄参10～30份、当归20～40份、甘松10～30份、丹参20～40份和甘草5～10份。

优选的，所述中药组合物包括以下重量份的原料：金银花30～40份、红景天30～40份、水蛭10～15份、瓜蒌20～40份、玄参15～25份、当归25～35份、甘松15～25份、丹参25～35份和甘草6～9份。

本发明提供了上述方案所述的中药组合物的制备方法，包括以下步骤：

1)将丹参与乙醇水溶液混合，进行回流提取，过滤，收集滤液浓缩，得到第一稠膏，收集滤渣为第一药渣；

2)将金银花、当归和甘松与水混合，进行第一水提取，收集得到挥发油、提取液和第二药渣；

3)将步骤1)所述第一药渣、步骤2)所述第二药渣与红景天、瓜蒌、水蛭、玄参、甘草和水混合，进行第二水提取，过滤、浓缩过滤液得到溶膏；

4)将步骤3)所述溶膏与乙醇水溶液混合后静置，进行提取，过滤、浓缩过滤液得到第二稠膏；

5)将步骤1)所述第一稠膏、步骤4)所述第二稠膏和步骤2)所述提取液混合后静置，过滤、干燥过滤液，干燥物粉碎得到药粉；

6)将步骤2)中所述挥发油用β-环糊精包合，得到包合物；

7)将步骤6)中所述包合物与步骤5)中所述药粉混合，得到中药组合物。

步骤5)和步骤6)并没有时间上的限制关系。

优选的，所述步骤1)中丹参与乙醇水溶液的质量比为1：(7～9)。

优选的，所述步骤1)中乙醇水溶液中乙醇的体积百分比为80％～95％。

优选的，所述步骤1)中的回流提取的温度为60～80℃；所述回流提取的次数为2～4次。

优选的，所述步骤2)中金银花、当归和甘松的总质量与水的质量比为1：(9～11)。

优选的，所述步骤3)中第二水提取的温度为80～100℃；所述第二水提取的次数为2～4次；每次提取的时间为1～3h。

优选的，所述步骤5)中静置的温度为1～5℃；所述静置的时间为18～30h。优选的，所述步骤5)中药粉的粒径为80～100目。

本发明的有益效果：本发明提供了一种治疗急性冠脉综合征的中药组合物及其制备方法，该中药组合物包括以下重量份的原料：金银花20～50份、红景天20～50份、水蛭5～20份、瓜蒌10～50份、玄参10～30份、当归20～40份、甘松10～30份、丹参20～40份和甘草5～10份；该中药组合物以解毒活血，通络止痛为治疗法则。其中，金银花，性甘寒，善于清热解毒，故重用为主药；当归其味甘而重，善活血散瘀；玄参其味甘、苦寒，具有泻火解毒之功；丹参，苦微寒，活血散瘀；甘草气味甘平，具有清解百毒之效，配金银花以加强清热解毒之力，共为辅佐。全方配伍，清而不燥、寒而不凝、润而不腻、滋而能通，共奏解毒活血，通络止痛之功。加用丹参等药物使其全方解毒活血作用更强。本发明的中药组合物主要用于冠心病不稳定性心绞痛、非st段抬高型心肌梗死、血液重建后冠心病的治疗，临床前药效学研究证实该中药组合物能够改善实验性心肌缺血大鼠模型的心肌缺血状态，具有抗氧化应激作用，能够改善心肌酶及心肌损伤标志物的指标，通过对其作用机制研究表明，该中药组合物能改善血管内皮功能，具有抗炎、稳定斑块等作用。

附图说明：

图1表示中药颗粒剂的制备方法流程图；

图2表示实施例4的实验一中心肌酶及心肌标志物表达的情况；

图3表示实施例4的实验二中造模前和造模后心电图的变化情况；

图4表示实施例4的实验二中不同实验组的心梗面积；

图5表示实施例4的实验二中心肌酶及心肌标志物表达的情况；

图6表示实施例4的实验二中不同实验组的心肌病理形态，其中图6-a为假手术组心肌病理形态；图6-b为模型组心肌病理形态；图6-c为低剂量组心肌病理形态；图6-d为中剂量组心肌病理形态；图6-e为高剂量组心肌病理形态；6-f为阳性药组心肌病理形态；

图7表示实施例4的实验三中crp、il-6和tnf-α的表达的情况；

图8表示实施例4的实验三中txa2和pgi2表达的情况；

图9表示实施例4的实验三中不同实验组大鼠心肌细胞内nf-kb免疫组化阳性表达的情况；其中图9-a为假手术组；图9-为模型组；图9-c为低剂量组；图9-d为中剂量组；图9-e为高剂量组；9-f为阳性药组。

具体实施方式

本发明提供了一种治疗急性冠脉综合征的中药组合物，包括以下重量份的原料：金银花(忍冬科植物忍冬lonicerajaponicathunb.的干燥花蕾或带初开的花)20～50份、红景天(景天科植物花景天rhodiolacrenulata(hook.f.etthoms.)h.ohba的干燥根和根茎)20～50份、水蛭(水蛭科动物蚂蝗whitmaniapigrawhitman、水蛭hirudonipponicawhitman或柳叶蚂蝗whitmaniaacranulatawhitman的干燥全体)5～20份、瓜蒌(葫芦科植物栝楼trichosantheskiriloxviimaxim.或双边栝楼trichosanthesrosthorniiharms的干燥成熟果实)10～50份、玄参(玄参科植物玄参scrophularianingpoensishemsl.的干燥根)10～30份、当归(伞形科植物当归angelicasinensis(oliv.)diels的干燥根)20～40份、甘松(败酱科植物甘松nardostachysjatamansidc.的干燥根及根茎)10～30份、丹参(唇形科植物丹参salviamiltiorrhizabge.的干燥根和根茎)20～40份和甘草(豆科植物甘草glycyrrhizauralensisfisch.、胀果甘草glycyrrhizainflatabat.或光果甘草glycyrrhizaglabral.的干燥根和根茎)5～10份。

本发明所述中药组合物包括金银花20～50份，优选为30～40份，更优选为32～38份；所述金银花中有机酸与过氧自由基迅速反应，保护血管内皮细胞损伤，避免血小板活化，从而阻断血小板的聚集。

本发明所述中药组合物包括玄参10～30份，优选为15～25份，更优选为18～22份；所述玄参可抑制心肌纤维化，延缓左室重构的发展过程；并且玄参醇浸膏水溶液能明显增加冠脉血流量；玄参中具有类似β受体阻滞剂作用，对心率、心脏收缩力有轻度抑制作用；除此之外，玄参还具有抗血小板聚集的作用。

本发明所述中药组合物包括当归20～40份，优选为25～35份，更优选为28～32份；所述当归可增加冠脉血流量，减少心梗范围，增强抗缺氧能力，抑制血小板聚集。

本发明所述中药组合物包括丹参20～40份，优选为25～35份，更优选为28～32份，所述丹参具有扩张冠状动脉和外周血管，增加冠脉血流量，减慢心率，减轻心肌缺血性损伤程度；能促进纤维蛋白溶解并有抗凝作用；此外，丹参具有清楚缺血部位的自由基，增强心肌收缩力，提高耐缺氧能力，缩小心梗面积的作用。

本发明所述中药组合物包括甘草5～10份，优选为6～9份，更优选为7～8份；所述甘草提取物中的甘草甜素可降低血液中胆固醇和游离脂肪酸的含量，减少甘油三酯的堆积；并且甘草的提取物可延长血小板性血栓形成时间，增强纤维蛋白溶解活性。

本发明所述中药组合物包括红景天20～50份，优选为30～40份，更优选为32～38份；所述红景天的作用是益气活血，通脉平喘。

本发明所述中药组合物包括水蛭5～20份，优选为10～15份，更优选为12～14份；所述水蛭的作用是破血通经，逐瘀消癥。

本发明中所述中药组合物包括瓜蒌10～50份，优选为20～40份，更优选25～35份；所述瓜蒌的作用是清热涤痰，宽胸散结，润燥滑肠。

本发明中所述中药组合物包括甘松10～30份，优选为15～25份，更优选18～22份；所述甘松的作用是理气止痛，开郁醒脾。

在本发明中，所述中药组合物具有解毒通络，化瘀生新的功效。

本发明提供了上述方案所述的中药组合物的制备方法，包括以下步骤：

1)将丹参与乙醇水溶液混合，进行回流提取，过滤，收集滤液浓缩，得到第一稠膏，收集滤渣为第一药渣；

2)将金银花、当归和甘松与水混合，进行第一水提取，收集得到挥发油、提取液和第二药渣；

3)将步骤1)所述第一药渣、步骤2)所述第二药渣与红景天、瓜蒌、水蛭、玄参、甘草和水混合，进行第二水提取，过滤、浓缩过滤液得到溶膏；

4)将步骤3)所述溶膏与乙醇水溶液混合后静置，进行提取，过滤、浓缩过滤液得到第二稠膏；

5)将步骤1)所述第一稠膏、步骤4)所述第二稠膏和步骤2)所述提取液混合后静置，过滤、干燥过滤液，干燥物粉碎得到药粉；

6)将步骤2)中所述挥发油用β-环糊精包合，得到包合物；

7)将步骤6)中所述包合物与步骤5)中所述药粉混合，得到中药组合物。

在本发明所述制备方法前，优选的对原料金银花、红景天、水蛭、瓜蒌、玄参、当归、甘松、丹参和甘草进行挑选、除杂、淋洗和烘干预处理；所述挑选、除杂、淋洗和烘干预处理采用本领域常规手段和标准进行。

本发明在对中药原料进行预处理后，将丹参与乙醇水溶液混合，进行回流提取，过滤，收集滤液浓缩，得到第一稠膏，收集滤渣为第一药渣；所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分比为80％～95％，优选为85％～90％；所述丹参与乙醇水溶液的质量比为1：(7～9)，优选为1:8；

本发明中，所述回流提取的温度为60～80℃，优选为65～75℃，更优选为70℃；所述回流提取的次数为2～4次，优选为3次；所述每次回流提取的时间优选为1～3h，更优选为2h；所述过滤的方式优选为滤膜过滤；所述滤膜的孔径优选为80～120目，更优选为100目；所述浓缩的方式优选为减压浓缩；所述减压浓缩的压力优选为0.08～0.09mpa；所述减压浓缩的温度优选为45～55℃，更优选为50℃；所述减压浓缩的时间优选为2～5h，更优选为3～4h；所述第一稠膏的相对密度优选为1.10～1.15。

在本发明中，将金银花、当归和甘松与水混合，进行第一水提取，收集得到挥发油、提取液和第二药渣；所述金银花、当归和甘松的总质量与水的质量比为1：(9～11)，优选为1:10；所述第一水提取的时间优选为5～7h，更优选为6h；所述第一水提取的次数优选为1次；所述第一水提取的温度优选为80～100℃，更优选为90℃；所述第一水提取的设备优选为中药提取罐。

本发明中在得到第一药渣和第二药渣后，将第一药渣、第二药渣与红景天、瓜蒌、水蛭、玄参、甘草和水混合，进行第二水提取，过滤、浓缩过滤液得到溶膏；所述第一药渣、第二药渣、红景天、瓜蒌、水蛭、玄参和甘草的总质量与水的质量比优选为1：(5～7)，优选为1:6。

本发明中，所述第二水提取的设备优选为中药提取罐；所述第二水提取的温度为80～100℃，优选为85～95℃，更优选为90℃；所述第二水提取的次数为2～4次，优选为3次；每次提取的时间为1～3h，优选为2h；所述过滤的方式优选为滤膜过滤；所述滤膜的孔径优选为80～120目，更优选为100目；所述浓缩的方式优选为减压浓缩；所述减压浓缩的压力优选为0.08～0.09mpa；所述减压浓缩的温度优选为45～55℃，更优选为50℃；所述减压浓缩的时间优选为2～5h，更优选为3～4h；所述溶膏的相对密度优选为1.10～1.15。

本发明在得到溶膏后，将溶膏与乙醇水溶液混合，进行提取，过滤、浓缩过滤液得到第二稠膏；所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分比优选为75％～85％，更优选为80％；所述乙醇水溶液与溶膏的质量比优选为5～7:3～5，更优选为6:4。

本发明中，所述静置的温度优选为1～5℃，更优选为4℃；所述静置的时间优选为18～30h，更优选为24h；所述过滤的方式优选为滤膜过滤；所述滤膜的孔径优选为80～120目，更优选为100目；所述浓缩的方式优选为减压浓缩；所述减压浓缩的压力优选为0.08～0.09mpa；所述减压浓缩的温度优选为45～55℃，更优选为50℃；所述减压浓缩的时间优选为2～5h，更优选为3～4h；所述第二稠膏的相对密度优选为1.10～1.15。

本发明在得到第一稠膏、第二稠膏以及提取液后，将第一稠膏、第二稠膏和提取液混合后静置，过滤、干燥过滤液，干燥物粉碎得到药粉；所述静置的温度为1～5℃，优选为4℃；所述静置的时间为18～30h，优选为24h；所述干燥的方式优选为减压干燥；所述减压干燥的温度优选为60～80℃，更优选为70℃；所述减压干燥的时间优选为48～96h，更优选为72h；所述药粉的粒径为80～100目，优选为90目。

本发明在得到挥发油后，将所述挥发油用β-环糊精包合，得到包合物。

本发明提供了所述包合物的制备方法，包括以下步骤：

a)将所述挥发油与无水乙醇溶液混合，得到挥发油的无水乙醇溶液；

b)将步骤a)所述挥发油的无水乙醇溶液、β-环糊精和水混合，得到β-环糊精饱和水溶液，进行包合处理，冷藏、抽滤，洗涤滤渣、干燥得到包合物。

在本发明中，将所述挥发油与无水乙醇溶液混合，得到挥发油的无水乙醇溶液；所述挥发油与无水乙醇溶液的体积比优选为4～6:4～6，更优选为1:1。

本发明在得到挥发油的无水乙醇溶液后，将所述挥发油无水乙醇溶液、β-环糊精和水混合，得到β-环糊精饱和水溶液，进行包合处理，冷藏、抽滤，洗涤滤渣、干燥得到包合物；所述所述挥发油无水乙醇溶液中的挥发油与环糊精的体积质量比优选为1ml：6～10g，更优选为1ml:7～9g；所述包合处理的设备优选为磁力搅拌器；所述包合处理的温度优选为40～60℃，更优选为50℃；所述包合处理的时间优选为1～3h，更优选为2h；所述冷藏处理的温度优选为1～5℃，更优选为4℃；所述冷藏处理的时间优选为18～30h，更优选为24h；所述抽滤方式优选为滤纸抽滤；所述洗涤的溶剂优选为石油醚；所述石油醚与挥发油的无水乙醇溶液的体积比优选为1：(9～11)，更优选为1:10；所述石油醚的温度优选为60～90℃，更优选为79～80℃；所述洗涤的次数优选为2～4次，更优选为3次；所述干燥的设备优选为真空干燥箱；所述干燥的温度优选为40～60℃，更优选为50℃；所述干燥的时间优选为3～5h，更优选为4h。

本发明在得到包合物和药粉后，将包合物与药粉混合，得到中药组合物。

本发明提供了包含上述方案中所述中药组合物的中药颗粒剂的制备方法，步骤如下：将中药组合物、糊精和乙醇水溶液混合后，进行制粒、干燥得到中药颗粒剂；所述乙醇水溶液为湿润剂。其中，所述中药颗粒剂的制备方法流程图见图1。

本发明中，所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分比优选为70％～80％，更优选为75％；所述中药组合物与糊精的质量比优选为1：0.5～2，更优选为1:1～1.5；所述干燥的温度优选为70～90℃，更优选为80℃；所述干燥的时间优选为12～36h，更优选为24h；所述中药颗粒剂的含水量优选为≤8％；所述中药颗粒剂的粒径优选为10～80目，更优选为30～50目。

下面结合实施例对本发明提供的一种治疗急性冠脉综合征的中药组合物及其制备方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1一种治疗急性冠脉综合征的中药颗粒剂

1.预处理：取金银花200g、红景天200g、水蛭50g、瓜蒌100g、玄参100g、当归200g、甘松100g、丹参200g和甘草50g，并将各味药挑杂，淋洗，烘干；

2.取预处理过的原料丹参，加8倍于丹参质量的体积百分数为80％乙醇水溶液，采用回流提取工艺提取，60℃，提取3次，每次1h，100目滤膜过滤，药渣备用；合并滤液，得到乙醇提取液和第一药渣；

3.步骤2中乙醇提取液在50℃条件下减压浓缩(压力0.08mpa)2h，得到相对密度1.10的第一稠膏；

4.取预处理过的原料金银花、当归和甘松，加10倍于金银花、当归和甘松质量的水，采用水提取工艺提取挥发油1次，时间为6h，提取得到挥发油；过滤，得提取液和第二药渣。

5.将第一药渣、第二药渣和预处理后的原料红景天、瓜蒌、水蛭、玄参和甘草混合，加6倍于上述混合物质量的水提取80℃，3次，每次1h，100目滤膜过滤，滤液50℃条件下浓缩得到相对密度为1.10的溶膏；

6.将步骤5中溶膏加入80％的乙醇，至乙醇质量占总重量的60％，搅拌均匀，4℃静置24h得乙醇液；采用100目滤膜将上述混合物过滤，减压回收并浓缩得到相对密度为1.10的第二稠膏；

7.将步骤3中的第一稠膏倒入步骤6的第二稠膏中，混合均匀，加入步骤4中的提取液，混合，4℃静置24h，过滤、70℃减压干燥，将干燥物粉碎得到粒径为80目药粉；

8.将步骤4中挥发油用β-环糊精包合：取1ml50％挥发油无水乙醇溶液(50％挥发油无水乙醇溶液为将挥发油与无水乙醇以体积比为1:1进行混合得到的溶液)，按照挥发油与环糊精体积重量比为1ml：6g的量配制成饱和水溶液中，置于磁力搅拌器内，设定包合温度为40℃、恒温搅拌1h，冷却至室温，4℃冷藏24h，滤纸抽滤，弃去滤液，滤渣用60℃石油醚洗涤3次，每次10ml，弃去石油醚洗液，滤渣置50℃真空干燥箱中4h，取出，得到包含物；

9、包含物与步骤7中药粉混合，按照混合药粉与糊精1:0.5的重量比例、75％乙醇水溶液为润湿剂，制粒，颗粒大小为80目，80℃常温干燥12h，得到中药颗粒剂。

实施例2一种治疗急性冠脉综合征的中药颗粒剂

1.预处理：取金银花500g、红景天500g、水蛭200g、瓜蒌500g、玄参300g、当归400g、甘松300g、丹参400g和甘草100g，并将将各味药挑杂，淋洗，烘干；

2.取预处理过的原料丹参，加9倍于丹参质量的体积百分数为85％乙醇水溶液，采用回流提取工艺提取，80℃，提取3次，每次2h，100目滤膜过滤，药渣备用；合并滤液，得到乙醇提取液和第一药渣；

3.步骤2中乙醇提取液在50℃、压力0.09mpa的条件下减压浓缩2h，得到相对密度为1.15的第一稠膏；

4.取预处理过的原料金银花、当归和甘松，加10倍于金银花、当归和甘松质量的水，采用水提取工艺提取挥发油1次，时间为6h，提取得到挥发油；过滤，得提取液和第二药渣。

5.将第一药渣、第二药渣和预处理后的原料红景天、瓜蒌、水蛭、玄参和甘草混合，加6倍于上述混合物质量的水提取90℃，3次，每次2h，100目滤膜过滤，滤液50℃条件下浓缩得到相对密度为1.15的溶膏；

6.将步骤5中溶膏加入80％的乙醇，至乙醇质量占总重量的60％，搅拌均匀，4℃静置24h得乙醇液；采用100目滤膜将上述混合物过滤，减压回收并浓缩得到相对密度为1.10的第二稠膏；

7.将步骤3中的第一稠膏倒入步骤6的第二稠膏中，混合均匀，加入步骤4中的提取液，混合，4℃静置24h，过滤、70℃减压干燥，将干燥物粉碎得到粒径为80目药粉；

8.将步骤4中挥发油用β-环糊精包合：取1ml50％挥发油无水乙醇溶液(50％挥发油无水乙醇溶液为将挥发油与无水乙醇以体积比为1:1进行混合得到的溶液)，按照挥发油与环糊精体积质量比为1ml：6g的量配制成饱和水溶液中，置于磁力搅拌器内，设定包合温度为40℃、恒温搅拌1h，冷却至室温，4℃冷藏24h，滤纸抽滤，弃去滤液，滤渣用60℃石油醚洗涤3次，每次10ml，弃去石油醚洗液，滤渣置50℃真空干燥箱中4h，取出，得到包含物；

9、包含物与步骤7中药粉混合，按照混合药粉与糊精1:0.5的(w:w)比例、75％乙醇水溶液为润湿剂，制粒，颗粒大小为80目，80℃常温干燥36h，得到中药颗粒剂。

实施例3一种治疗急性冠脉综合征的中药颗粒剂

1.预处理：取金银花300g、红景天400g、水蛭100g、瓜蒌300g、玄参200g、当归300g、甘松200g、丹参300g和甘草75g，并将将各味药挑杂，淋洗，烘干；

2.取预处理过的原料丹参，加10倍于丹参质量的体积百分数为90％乙醇水溶液，采用回流提取工艺提取，80℃，提取3次，每次3h，100目滤膜过滤，药渣备用；合并滤液，得到乙醇提取液和第一药渣；

3.步骤2中乙醇提取液在50℃、压力0.09mpa的条件下减压浓缩2h，得到相对密度为1.15的第一稠膏；

4.取预处理过的原料金银花、当归和甘松，加10倍于金银花、当归和甘松质量的水，采用水提取工艺提取挥发油1次，时间为6h，提取得到挥发油；过滤，得提取液和第二药渣。

5.将第一药渣、第二药渣和预处理后的原料红景天、瓜蒌、水蛭、玄参和甘草混合，加6倍于上述混合物质量的水提取100℃，3次，每次3h，100目滤膜过滤，滤液50℃条件下浓缩得到相对密度为1.15的溶膏；

6.将步骤5中溶膏加入80％的乙醇，至乙醇质量占总重量的60％，搅拌均匀，4℃静置24h得乙醇液；采用100目滤膜将上述混合物过滤，减压回收并浓缩得到相对密度为1.10的第二稠膏；

7.将步骤3中的第一稠膏倒入步骤6的第二稠膏中，混合均匀，加入步骤4中的提取液，混合，4℃静置24h，过滤、70℃减压干燥，将干燥物粉碎得到粒径为80目药粉；

8.将步骤4中挥发油用β-环糊精包合：取1ml50％挥发油无水乙醇溶液(50％挥发油无水乙醇溶液为将挥发油与无水乙醇以体积比为1:1进行混合得到的溶液)，按照挥发油与环糊精体积质量比为1ml：6g的量配制成饱和水溶液中，置于磁力搅拌器内，设定包合温度为40℃、恒温搅拌1h，冷却至室温，4℃冷藏24h，滤纸抽滤，弃去滤液，滤渣用60℃石油醚洗涤3次，每次10ml，弃去石油醚洗液，滤渣置50℃真空干燥箱中4h，取出，得到包含物；

9、包含物与步骤7中药粉混合，按照混合药粉与糊精1:0.5的(w:w)比例、75％乙醇水溶液为润湿剂，制粒，颗粒大小为80目，80℃常温干燥36h，得到中药颗粒剂。

实施例4实施例3的中药颗粒剂对冠状动脉结扎所致非st段抬高型心肌梗死大鼠的影响

实验一大鼠急性心肌缺血模型建立与评价

wistar大鼠40只，雌雄各半，体重(230±10)g，由吉林大学基础医学院动物实验中心提供。许可证号：fcxk(吉)-2011-0004。大鼠喂养于标准动物房，大鼠适应性喂养1周开始实验。将上述40只wistar大鼠，按随机数字表法分为假手术组、模型组，每组10只，雌雄各半。

1建立大鼠急性心肌缺血模型，方法如下：

1)术前24小时禁食，给予适量的水；2)乙醚麻醉后仰位固定于手术台上；3)正中剃毛，以10号线做荷包缝合，以手术刀正中切开，用止血钳剥离肋间肌肉，自左侧3～4肋间开胸，暴露心脏；4)于肺动脉圆锥及左心房间找出冠脉左前降支，假手术组仅穿线不结扎外，模型组以0号线立即结扎左前降支；将心脏送回胸腔，挤出胸腔内空气后迅速扎紧荷包缝线关闭胸腔。

2造模24小时后采集各项指标

2.1心电图记录

冠脉结扎术前，乙醚麻醉后记录正常状态下标准肢体ii导联心电图。将三个针形电极按规定位置(黄——右上肢，黑——右下肢，红——左下肢)插入大鼠四肢皮层下。术后24小时，以20％乌拉坦(1.0g/kg)腹腔麻醉后，再次记录标准肢体ii导联心电图。计算各标测点st段变化毫伏数。

2.2心梗面积的测定

取出心脏，用生理盐水冲洗，滤纸吸干，将心室横切5片，置氯化硝基四氮唑蓝(nb-t)磷酸缓冲液中，于37℃恒温水浴染色完全后取出。数码相机拍照后，使用形态学图像分析系统软件1.0测量相关区域面积，梗死面积(％)＝左心室组织切片梗死面积/左心室组织切片总面积×100％。

2.3血清酶学检测

腹主动脉采血5ml，置于试管中，以3000rpm/min，离心10min后，吸取上清液作，放置于超低温冰箱，-20℃保存，待检测谷草转氨酶(ast)、乳酸脱氢酶(ldh)、肌酸酶同工酶(ck-mb)、肌钙蛋白i(ctn-i)。每只取0.5ml血清，于日立7600全自动生化分析仪检测ast、ldh、ck-mb。每只取10ul血清，采用双抗夹心elisa酶联免疫吸附方法，测定ctn-i。严格按照试剂盒操作方法进行检测。

3统计分析

采用spss16.0软件进行统计学处理。计量资料以均数±标准差表示，组间均数的比较采用单因素方差分析，p<0.05为差异有统计学意义。统计结果如下：

1)心电图变化：模型组造模后24小时，∑st变化较假手术组明显(p＜0.05)，参见表2。

2)心梗面积比较：与假手术组比较模型组心梗面积显著增加(p＜0.05)，参见表2。

表2造模前和造模后心电图st段改变及心梗面积测定

*与模型组比较p＝0.000；#与模型组比较p＝0.000

3)血清酶学检测结果：模型组ast、ldh、ck-mb、tn-i浓度高于假手术组，具有统计学意义(p＜0.05)。见表1-2和图2，图2为心肌酶及心肌标志物表达的情况。

表1-2心肌酶及心肌标志物表达的情况

*与假手术组比较p＝0.008；**与假手术组比较p＝0.008；

#与假手术组比较p＝0.001；@与假手术组比较p＝0.000。

从两组造模前后心电图st段变化、心梗面积、血清酶学比较结果，充分说明本实验成功复制出急性心肌缺血的动物模型。

实验二实施例3的中药颗粒剂对急性心肌缺血大鼠的保护作用的验证实验

wistar大鼠120只，雌雄各半，体重(230±10)g，由吉林大学基础医学院动物实验中心提供。许可证号：fcxk(吉)-2011-0004。大鼠喂养于标准动物房，大鼠适应性喂养1周开始实验。实验用药：实施例3的中药颗粒剂以及通心络胶囊(由石家庄以岭药业有限公司提供，产品批号：110919)。

1.造模120只wistar大鼠按照随机数字表法分为假手术组、模型组、中药颗粒剂大、中、小剂量组、通心络组。假手术组与模型组灌胃灭菌蒸馏水2ml/d·只；中药颗粒剂大、中、小剂量组分别灌胃1.528g/kg、3.055g/kg、6.11g/kg；通心络组灌胃0.24g/kg。连续灌胃14天后按照上述实验一中的造模方法进行造模。假手术组仅穿线不结扎外，其余各组均以0号线立即结扎左前降支。

2.观察指标观察指标为；造模前后心电图st段变化；心梗面积测定；血清酶学(ast、ldh、ck-mb、ctni)；心肌形态变化。除心肌形态学变化外，其余取材与检测方法同实验一。

心肌病理形态变化取材与观察方法：取出心脏，在距离心尖1cm处，取厚度为0.5cm的横断心肌组织块，浸泡于10％福尔马林溶液24小时，常规石蜡包埋，切片，待he染色。

he染色步骤：

(1)10min二甲苯i→10min二甲苯ii→3min95％乙醇i→3min95％乙醇ii→1min80％乙醇→1min水化

(2)苏木素染色5min，自来水冲洗

(3)1％盐酸乙醇分化30s

(4)自来水浸泡10min

(5)置伊红液1min，自来谁冲洗

(6)80％乙醇10s→3min95％乙醇i→3min95％乙醇ii→2min二甲苯i→2min二甲苯ii→中性树脂封片

(7)拍照

3.统计分析采用spss16.0软件进行统计学处理。计量资料以均数±标准差表示，组间均数的比较采用单因素方差分析，p<0.05为差异有统计学意义。结果显示：

1)造模前后心电图st段变化比较：各组间造模前与造模后24h，∑st变化比较结果说明，与模型组相比，治疗组∑st变化不明显(p＜0.05)，其中高剂量组与通心络组效果明显。见表3，图3，其中图3表示造模前和造模后心电图的变化情况。

表3造模前和造模后心电图的变化情况

*与假手术组比较p值依次为0.001、0.012、0.034、0.018

△与模型组比较p值依次为0.001、0.000、0.000、0.000

2)心梗面积比较：各组间心梗面积比较结果表明，低剂量组与模型组比较，心梗面积未见明显减少(p＞0.05)；其余治疗组较模型组显著减少心梗面积(p＜0.05)，尤以高剂量组明显；高剂量组与通心络组减少心梗面积效果大致一样。见表4、图4，其中图4表示不同实验组的心梗面积。

表4对心梗面积的影响

△与模型组比较p值依次为0.330、0.001、0.001、0.001

3)心肌酶及心肌标志物的表达比较

实验结果表明，高剂量组与通心络组较模型组均显著降低ast、ldh、ck-mb、ctn-i的浓度(p＜0.05)；低剂量组与中剂量组较模型组比较，可降低ck-mb、ctni的浓度(p＜0.05)，但ast、ldh浓度无明显差异(p＞0.05)。见表5、图5，图5表示心肌酶及心肌标志物表达的情况。

表5对心肌酶及心肌标志物表达的影响

*与假手术组比较p＝0.008；△与模型组比较p值依次为0.290、0.076、0.039、0.045；

**与假手术组比较p＝0.008；△△与模型组比较p值依次为0.348、0.314、0.011、0.003；

#与假手术组比较p＝0.001；@与模型组比较p值依次为0.017、0.010、0.010、0.005；

##与假手术组比较p＝0.000；@@与模型组比较p值依次为0.000、0.000、0.000、0.000；

he染色，显微镜(×100)下观察心肌病理形态，结果见图6，图6表示不同实验组的心肌病理形态，其中图6-a为假手术组心肌病理形态；图6-b为模型组心肌病理形态；图6-c为低剂量组心肌病理形态；图6-d为中剂量组心肌病理形态；图6-e为高剂量组心肌病理形态；6-f为阳性药组心肌病理形态。结果显示：假手术组：大鼠心脏的心肌形态正常，结构清晰，肌纤维横纹、闰盘及细胞核染色清晰，肌纤维间无纤维细胞聚集增生现象；模型组大鼠心脏梗死区范围内呈无结构状态，心肌细胞核固缩、碎裂或溶解消失，部分心肌呈灶状与片状坏死，心肌纤维紊乱、断裂明显，肌质凝聚，横纹不清或消失，细胞间可见红细胞，伴有弥漫的中性多形核炎细胞浸润，并有部分心肌纤维样变性。梗死未累及心室壁全层，梗死周围区和远离梗死区的组织形态基本同正常心肌；各治疗组大鼠心肌坏死程度减轻，炎性细胞浸润减少，心肌纤维化程度减轻，以高剂量治疗组最为显著。各治疗组的心肌细胞损伤程度均较模型组轻，证明实施例3的中药颗粒剂具有减轻大鼠心肌缺血性损伤的作用。

实验结果显示：模型组大鼠心脏梗死区范围内呈无结构状态，心肌细胞核固缩、碎裂或溶解消失，部分心肌呈灶状与片状坏死，心肌纤维紊乱、断裂明显，肌质凝聚，横纹不清或消失，细胞间可见红细胞，伴有弥漫的中性多形核炎细胞浸润，并有部分心肌纤维样变性。而实施例3的中药颗粒剂高、中、低剂量组及阳性对照组大鼠心肌坏死程度减轻，炎性细胞浸润减少，心肌纤维化程度减轻，以高剂量治疗组最为显著。说明实施例3的中药颗粒剂具有减轻缺血心肌损伤作用。

由上述实验结果可知，本发明实施例3的中药颗粒剂能够明显减少st段变化，显著缩小大鼠心梗面积，并且能够明显降低ast、ldh、ck-mb及ctni活性，减轻大鼠心肌缺血性损伤。

实验三本发明实施例3的中药颗粒剂对急性心肌缺血大鼠炎性机制的研究

wistar大鼠120只，雌雄各半，体重(230±10)g，由吉林大学基础医学院动物实验中心提供。许可证号：fcxk(吉)-2011-0004。大鼠喂养于标准动物房，大鼠适应性喂养1周开始实验。

1.实验用药同实验二。分组、给药及造模方法同实验二。观察指标为：大鼠血清中c反应蛋白、血栓素、前列环素、白介素-6浓度；心肌细胞中nf-kbp65表达。

2.检测方法

1)c反应蛋白、血栓素、前列环素和白介素-6均采用双抗夹心elisa酶联免疫吸附方法，严格按照试剂盒操作方法进行检测。

2)检测nf-kbp65表达采用sabc免疫组化法。具体操作步骤如下：

①石蜡标本常规4um连续切片后，置于经多聚赖氨酸处理的防脱破片中，放于60℃烤箱过夜。

②脱蜡和水化：组织切片置于二甲苯i、ii中脱蜡各15min→无水乙醇i5min→无水乙醇ii3min→95％乙醇3min→80％乙醇3min→70％乙醇3min→水化5min。

③抗原修复：高压热修复

在高压锅中加入0.01m枸橼酸钠缓冲液(ph6.0)。使液面没过染色架上玻片组织。盖上不锈钢高压锅的盖子，缓慢加热(约5min)，小阀门将会升起来。1～2min后，离开热源，待降至室温打开盖子(避免过冷过热，以防脱片)。

④染色：sabc法

3％h2o2室温中孵育10min(如有脱皮，用0.3％h2o2)；pbs冲洗，5min×3次；滴加5％bsa封闭液，室温湿盒内孵育30min，倾去，勿洗；滴加一抗40ul：兔抗大鼠nf-kbp65单克隆抗体(1：100)，4℃过夜；pbs冲洗，5min×3次；滴加二抗工作液，室温湿盒内孵育30min；pbs冲洗，5min×3次；滴加试剂sabc，室温湿盒内孵育30min；pbs冲洗，5min×3次；dab显色:镜下掌握显色程度；蒸馏水冲洗；苏木素复染5min，清水冲洗；盐酸酒精、氨水分化；脱水：70％乙醇5min→80％乙醇5min→95％乙醇5min→无水乙醇ii5min→无水乙醇i5min；透明：二甲苯ii3min→二甲苯i3min；中性树胶封片；镜检。

3.免疫组化结果判定免疫组化评分(immunohistochemicalscores，his)以细胞膜、细胞质、细胞核中出现淡黄色或棕黄色颗粒为阳性表达，染色强度高于背景的非特异性染色判定为阳性细胞。每张组织切片随机选取5个低倍(×100)视野，采用二次加权法计算阳性总评分，即阳性总评分＝染色强度评分×染色阳性细胞率评分。

染色强度评分分级：不着色为0分，淡黄色为1分，褐色或棕褐色为2分，棕色或棕黑色为3分。

染色阳性细胞率评分：占0-9％为0分，10-24％为1分，25-49％为2分，50-100％为3分。

阳性总评分0分为-；1-3分为+；4-6分为++；7-9分为+++。

4.统计分析

采用spss16.0软件进行统计学处理。计量资料以均数±标准差表示，组间均数的比较采用单因素方差分析，p<0.05为差异有统计学意义。等级资料用ridit分析，检测组的ridit值的95％可信区间不包括0.5，p<0.05，差别有统计学意义。统计结果如下：

1)实施例3的中药颗粒剂对c反应蛋白表达的影响

模型组c反应蛋白较假手术组明显增高(p＜0.05)；实施例3的中药颗粒剂各治疗组与通心络治疗组较模型组明显减少c反应蛋白表达(p＜0.05)。见表7、图7，图7表示crp、il-6和tnf-α的表达的情况。

表7对c反应蛋白表达的影响

*与假手术组比较p＝0.000；△与模型组比较p值依次为0.05、0.003、0.004、0.000

2)实施例3的中药颗粒剂对il-6、tnf-α表达的影响

模型组较假手术组il-6、tnf-α浓度显著增高(p＜0.05)，实施例3的中药颗粒剂各剂量组较模型组显著降低il-6、tnf-α浓度(p＜0.05)，与通心络组比较无明显差异。见表8、图7。

表8对il-6、tnf-a表达的影响

*与假手术组比较p＝0.000；△与模型组比较p值依次为0.000、0.000、0.000、0.001；#与假手术组比较p＝0.016；@与模型组比较p值依次为0.009、0.013、0.002、0.035。

3)实施例3的中药颗粒剂对txa2、pgi2表达的影响

与假手术组比较，模型组pgi2水平明显降低；txa2水平明显升高(p＜0.05)。实施例3的中药颗粒剂各剂量组与通心络组较模型组均显著增加pgi2水平；降低txa2水平(p＜0.05)。见表9、图8，图8表示txa2和pgi2表达的情况。

表9对txa2、pgi2表达的影响

*与假手术组比较p＝0.000；△与模型组比较p值依次为0.034、0.008、0.008、0.000；#与假手术组比较p＝0.000；@与模型组比较p值依次为0.000、0.000、0.000、0.000

4)实施例3的中药颗粒剂对心肌细胞nf-kbp65表达影响

dab染色，显微镜(×100)下观察大鼠心肌细胞内nf-kb免疫组化阳性表达情况。结果显示：实施例3的模型组心肌细胞内的nf-kb阳性表达较假手术组明显增加，阳性积分经ridit分析比较差异显著(p＜0.05)，中药颗粒剂低、中、高剂量组及通心络组阳性表达明显减弱，阳性积分与模型组比较有显著差异(p＜0.05)。实验结果见表3-4、图9，表3-4和图9表示不同实验组大鼠心肌细胞内nf-kb免疫组化阳性表达的情况；其中图9-a为假手术组；图9-为模型组；图9-c为低剂量组；图9-d为中剂量组；图9-e为高剂量组；9-f为阳性药组。

表3-4对大鼠心肌细胞内nf-kb免疫组化阳性表达的影响

*与假手术组比较，模型组ridit值的95％可信区间(0.8392，1.0501)；低剂量组ridit值的95％可信区间(0.7279，0.9388)；中剂量组ridit值的95％可信区间(0.5962，0.8071)；高剂量组ridit值的95％可信区间(0.5235，0.7343)；通心络组ridit值的95％可信区间(0.6257，0.8365)，以上均不包括0.5，p＜0.05。

#与模型组比较，低剂量组ridit值的95％可信区间(0.2046，0.4154)；中剂量组ridit值的95％可信区间(0.2211，0.4319)；高剂量组ridit值的95％可信区间(0.1471，0.3580)；通心络组ridit值的95％可信区间(0.1849，0.3958)，以上均不包括0.5，p＜0.05。

本实验通过免疫组化观察到模型组心肌nf-kb表达显著与假手术组，实施例3的中药颗粒剂及通心络组均能抑制nf-kb表达。实施例3的中药颗粒剂可能是通过抑制nf-kb细胞外的正反馈激活途径，从而实现保护心肌作用。由上述内容可知，本申请实施例3的中药颗粒剂可显著降低c反应蛋白含量，从而减少血管内皮损伤及心肌缺血程度；也可降低血清il-6、tnf-α水平，提示具有抑制炎症反应作用，可能对防止斑块的形成、破裂，防止心肌内皮细胞损伤具有一定的作用；还可降低txa2浓度，增加pgi2浓度，从而能缓解血管痉挛、减少血栓的形成，起到保护心肌细胞的作用；此外，还能抑制心肌细胞nf-kb表达，可能是通过抑制nf-kb细胞外的正反馈激活途径，从而实现保护心肌作用。

由上述实施例可知，实施例3的中药颗粒剂能明显减轻急性心肌缺血大鼠的心电图变化程度，缩小心肌梗死面积，降低血清ck-mb、ldh、ast及ctni活性，组织形态学的变化与心肌酶学的改变相一致，表明实施例3的中药颗粒剂对缺血心肌具有保护作用。其次，实施例3的中药颗粒剂可显著降低c反应蛋白、il-6、tnf-α含量，提示具有抑制炎症反应作用，对防止斑块的形成、破裂；防止心肌内皮细胞损伤具有一定的作用。再次，实施例3的中药颗粒剂可降低txa2浓度，增加pgi2浓度，表明其可明显抑制体内缩血管物质的增加，保持pgi2/txa2生理平衡，从而能缓解血管痉挛、减少血栓的形成，起到增加心肌供血，保护心肌细胞的作用。另外，实施例3的中药颗粒剂可能通过抑制nf-kb细胞外的正反馈激活途径，减少心肌细胞nf-kb活化，从而减少炎症因子的基因转录。综上可知，本发明经实施例3的中药颗粒剂具有良好的抗心肌缺血作用，并且作用机制与其抑制调控血管内皮炎症通路相关。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。