银杏内酯B纳米脂质体及其制备方法与流程

本发明涉及医药制剂，具体涉及一种具有脑主动靶向功能的银杏内酯b纳米脂质体及其制备方法。
背景技术：
：心脑血管疾病是一种严重威胁人类，特别是50岁以上中老年人健康的常见病，即使应用目前最先进、完善的治疗手段，仍可有50％以上的脑血管意外幸存者生活不能完全自理。全世界每年死于心脑血管疾病的人数高达1500万人，居各种死因首位。缺血性脑血管疾病是最为常见，危害最大的心脑血管疾病，主要体现为脑卒中、缺血-再灌注损伤、神经损伤。银杏叶提取物(gbe)是临床治疗脑血管疾病的一线药物，疗效得到国内外医学界充分肯定。银杏内酯b(gb)是gbe中重要的活性成分之一，是一种具有高度专属性的血小板活化因子受体拮抗剂，它可减轻脑缺血/再灌注介导的脑组织脂质过氧化反应，提高自由基清除系统酶的活性，对脑损伤有明显保护作用。银杏内酯的剂型研究目前大都停留在传统的注射液方面，目前市面上有成都百裕制药生产的银杏内酯注射液，有效成份为多种银杏内酯，辅料为甘油、乙醇。银杏内酯b作为银杏二萜内酯中最强的血小板活化因子抑制剂，目前还没有原料药仅为gb的制剂上市销售。并且银杏内酯b在血液中的半衰期短，传统的银杏内酯注射液在给药后药物循环时间短，难以在脑部蓄积，更难以透过血脑屏障，药物不易到达病灶。因此传统的注射液存在着给药量大，生物利用度低，辅料副作用大，缺乏靶向性等问题。近几年越来越多的患者受到脑血管疾病困扰，并且有向年轻化发展的趋势，所以开发一种具有高生物利用度，靶向性的银杏内酯b制剂迫在眉睫。脂质体是以磷脂为主要材料构成的双分子层囊泡，最早由英国科学家发现，其结构类似生物膜。上世纪70年代脂质体开始成为药物载体，由于其生物相容性、生物可降解性、无毒和无免疫原性优点，脂质体作为药物新剂型迅速发展，目前已有十余种脂质体制剂上市。制备脂质体的主要材料为各种天然磷脂和合成磷脂(包括蛋黄卵磷脂，大豆卵磷脂，氢化大豆卵磷脂，二硬脂酰基磷脂酰胆碱，二棕榈酰基卵磷脂，二肉豆蔻酰基卵磷脂等)，适量能调整磷脂双分子层流动性和通透性的胆固醇，以及一定量的抗氧化剂(如α-生育酚)。脂质体被用作药物载体后，其缺点便很快被发现，传统组分的脂质体很快离开血流，蓄积于肝脏的kupffer细胞和脾脏的巨噬细胞中。经过多年的发展，研究人员制备了长循环脂质体，其最常用的方法是在脂质体表面包覆线型聚乙二醇，即peg。因此将适量peg化磷脂(常用dspeg-peg2000)加入到脂质体配方中可以制备得到长循环脂质体，其peg长链能帮助脂质体躲避巨噬细胞的识别与吞噬，有效延长了脂质体药物在体内的循环时间。因为血脑屏障的存在，长循环脂质体药物也难以到达脑实质与脑神经内的病灶，目前最主要的脑靶向递药策略是通过受体介导入脑，经研究表明，血脑屏障上有许多受体，包括转铁蛋白受体、胰岛素受体、低密度脂蛋白受体相关蛋白(lrp)受体等。本申请就此进行了深入研究。技术实现要素：发明目的：针对银杏内酯b现有剂型存在的水溶性差、半衰期短和毒副作用大等技术问题，本申请提供了一种具有脑主动靶向功能的银杏内酯b纳米脂质体制剂。技术方案：本申请所述的一种银杏内酯b纳米脂质体，包含银杏内酯b、卵磷脂、胆固醇、维生素e、培化磷脂酰乙醇胺、磷脂聚乙二醇马来酰亚胺和多肽(cys)-an2。其中，银杏内酯b的结构如下：银杏内酯b英文名ginkgolideb，分子量：424.40，分子式：c20h24o10。多肽(cys)-an2的氨基酸序列为tffyggsrgkrnnfkteeyc，其末端半胱氨酸(cys)的巯基通过与马来酰亚胺基团耦合的方式连接到脂质体表面。进一步的，所述银杏内酯b、卵磷脂、胆固醇、维生素e、培化磷脂酰乙醇胺、磷脂聚乙二醇马来酰亚胺和(cys)-an2摩尔比2-8：30-60：10-40：1-4：2-8：1-4：1-4。进一步优选的，所述银杏内酯b、卵磷脂、胆固醇、维生素e、培化磷脂酰乙醇胺、磷脂聚乙二醇马来酰亚胺和(cys)-an2摩尔比为3-6：35-50：15-30：1-3：3-6：1-3：1-3。所述银杏内酯b、卵磷脂、胆固醇、维生素e、培化磷脂酰乙醇胺、磷脂聚乙二醇马来酰亚胺和(cys)-an2摩尔比可以选择为2:20:10:1:2:1:1，在能够达到较高包封率的情况下，节约成本。所述卵磷脂可以是天然磷脂和(或)合成磷脂，包括但不仅限于蛋黄卵磷脂，大豆卵磷脂，氢化大豆卵磷脂，二硬脂酰基磷脂酰胆碱，二棕榈酰基卵磷脂，二肉豆蔻酰基卵磷脂等磷脂酰胆碱中的一种或任意几种混合物。所述多肽(cys)-an2的氨基酸序列为tffyggsrgkrnnfkteeyc，其末端半胱氨酸(cys)的巯基通过与马来酰亚胺基团耦合的方式连接到脂质体表面。银杏内酯b脂质体制剂的制备方法，包括以下制备步骤：(1)称取配方量的银杏内酯b、卵磷脂、胆固醇、维生素e、培化磷脂酰乙醇胺和磷脂聚乙二醇马来酰亚胺溶解于有机溶剂中，超声形成均匀脂质溶液；(2)在氮气条件保护下，将步骤(1)所得脂质溶液减压蒸馏至无有机溶剂残留，制成均匀的脂质膜；(3)将步骤(2)制成的脂质膜水化，并在氮气保护下涡旋搅拌均匀；(4)将步骤(3)处理后的脂质体溶液质体挤出器进行挤出操作；(5)在氮气保护下，将步骤(4)处理后的脂质体溶液的ph调至7.0-7.5，再将配方量的多肽(cys)-an2加入到脂质体溶液中，避光搅拌反应；(6)反应结束后，超滤除去未反应的多肽(cys)-an2，用ph＝7.0-7.5磷酸缓冲盐溶液重新分散脂质体，即得具有脑主动靶向功能的银杏内酯b纳米脂质体制剂。步骤(1)中，所述有机溶剂选自无水乙醇、氯仿甲醇混合液、甲醇和二氯甲烷中的一种或多种混合。步骤(1)中，所述超声条件为水浴超声10-30分钟。步骤(2)中，减压蒸馏条件为：控制真空度大于0.09mpa，水浴温度为30-40℃。步骤(3)中，用ph＝6.0-7.0磷酸缓冲盐溶液水化，优选ph＝6.5。所述磷酸缓冲盐溶液的温度为30-55℃，需高于卵磷脂的相变温度。步骤(3)中，涡旋搅拌条件为：控制转速为每秒2-4转。步骤(4)中，脂质体挤出器依次使用0.8μm、0.4μm、0.2μm、0.1μm孔径的聚碳酸酯膜。步骤(5)中，常温下反应6-10小时。本发明通过具有与脑毛细血管壁上低密度脂蛋白受体特异结合功能的(cys)-an2与磷脂聚乙二醇马来酰亚胺(dspe-peg2000-mal)进行化学偶联制成脑靶向材料，并利用该偶联物制备的脂质体包裹银杏内酯b，构建兼具长循环与脑主动靶向功能的药物新剂型。有益效果：本发明制备的银杏内酯b脂质体粒径小，以水为分散介质，稀释10倍后，用激光粒度测定仪测得平均粒径为127.5nm，多分散指数(pdi)为0.186。本发明提供的银杏内酯b脂质体制剂粒径达到纳米级别，并且在脂质体中加入长循环材料dspe-peg200，其在表面形成亲水层和空间位阻，可以有效避免网状内皮系统的吞噬，降低脂质体的血液清除率，从而延长脂质体在循环系统的滞留时间，增加脂质体的脑靶向效果。本发明提供的银杏内酯b脂质体经过(cys)-an2的表面修饰，使得银杏内酯b脂质体能通过受体介导的方式在脑部聚集并透过血脑屏障，达到保护脑组织与中枢神经的作用。本发明制备的银杏内酯b脂质体制剂质量均一，稳定可控，可显著提高银杏内酯b在水中的分散性，从而大大提高药物的生物利用度和成药性。本发明的兼具长循环与脑靶向的银杏内酯b脂质体的制备过程方便、环保且易于工业放大。附图说明图1为本发明实施例1制备的银杏内酯b脂质体外观图；图2为本发明实施例1制备的银杏内酯b脂质体粒径分布图；图3为本发明实施例1制备的银杏内酯b脂质体透射电镜图。具体实施方式下面结合具体实施例对本申请作出详细说明。原料来源：银杏内酯b购自南京景竹生物科技公司；几种卵磷脂，胆固醇均购自上海艾伟拓公司；培化磷脂酰乙醇胺、磷脂聚乙二醇马来酰亚胺均购自上海芃圣生物公司；维生素e购自sigma公司；(cys)-an2由上海吉尔生化有限公司合成。设备仪器：liposofast脂质体挤出器、td5z台式低速离心机、millipore-410kd超滤管、litesizer500纳米激光粒度仪、岛津高效液相色谱仪lc-10a、hitachi透射电镜。实施例1将10mg银杏内酯b、180mg蛋黄卵磷脂、50mg胆固醇、5mg维生素e、65mg培化磷脂酰乙醇胺、35mg磷脂聚乙二醇马来酰亚胺溶解于20ml无水乙醇，超声10分钟形成均匀脂质溶液，转入250ml的圆底烧瓶中，将上述脂质溶液于35℃减压蒸馏至乙醇无残留，在圆底烧瓶内壁形成均匀的脂质膜。将制成的脂质膜用5ml磷酸缓冲盐溶液(ph＝6.0)在30℃下水化1小时，并在氮气保护下搅拌分散均匀。将上述脂质体溶液用脂质体挤出器进行多次挤出，依次通过0.8μm、0.4μm、0.2μm、0.1μm孔径的聚碳酸酯膜。在氮气保护下，加入磷酸氢二钠溶液，使ph调高至7.2，再将30mg的(cys)-an2加入到脂质体溶液中，在室温下避光轻微搅拌10小时，超滤离心除去分子量小于10000的溶质，用5mlph＝7.2的磷酸缓冲盐溶液重新分散脂质体，即得具有脑靶向功能的银杏内酯b纳米脂质体制剂(样品a)。实施例2将30mg银杏内酯b、520mg二棕榈酰基卵磷脂、140mg胆固醇、16mg维生素e、195mg培化磷脂酰乙醇胺、100mg磷脂聚乙二醇马来酰亚胺溶解于30ml氯仿：甲醇＝2：1的混合溶液，超声20分钟形成均匀脂质溶液，转入500ml的圆底烧瓶中，在氮气条件保护下，将上述脂质溶液于30℃减压蒸馏至溶剂无残留，在圆底烧瓶内壁形成均匀的脂质膜。将制成的脂质膜用15ml磷酸缓冲盐溶液(ph＝6.5)在45℃下水化1小时，并在氮气保护下搅拌分散均匀。将上述脂质体溶液用脂质体挤出器进行多次挤出，依次通过0.8μm、0.4μm、0.2μm、0.1μm孔径的聚碳酸酯膜。在氮气保护下，加入磷酸氢二钠溶液，使ph调高至7.4，再将90mg的(cys)-an2加入到脂质体溶液中，在室温下避光轻微搅拌8小时，超滤离心除去分子量小于10000的溶质，用15mlph＝7.4的磷酸缓冲盐溶液重新分散脂质体，即得具有脑靶向功能的银杏内酯b纳米脂质体制剂(样品b)。实施例3将50mg银杏内酯b、1000mg大豆卵磷脂、230mg胆固醇、25mg维生素e、330mg培化磷脂酰乙醇胺、170mg磷脂聚乙二醇马来酰亚胺溶解于50ml二氯甲烷，超声形成均匀脂质溶液，转入1000ml的圆底烧瓶中，在氮气条件保护下，将上述脂质溶液于30℃减压蒸馏至二氯甲烷无残留，在圆底烧瓶内壁形成均匀的脂质膜。将制成的脂质膜用25ml磷酸缓冲盐溶液(ph＝6.8)在30℃下水化1小时，并在氮气保护下搅拌分散均匀。将上述脂质体溶液用脂质体挤出器进行多次挤出，依次通过0.8μm、0.4μm、0.2μm、0.1μm孔径的聚碳酸酯膜。在氮气保护下，加入磷酸氢二钠溶液，使ph调高至7.5，再将150mg的(cys)-an2加入到脂质体溶液中，在室温下避光轻微搅拌6小时，超滤离心除去分子量小于10000的溶质，用25mlph＝7.5的磷酸缓冲盐溶液重新分散脂质体，即得具有脑靶向功能的银杏内酯b纳米脂质体制剂(样品c)。实施例4将20mg银杏内酯b、280mg二硬脂酰基卵磷脂、90mg胆固醇、10mg维生素e、130mg培化磷脂酰乙醇胺、70mg磷脂聚乙二醇马来酰亚胺溶解于30ml氯仿：甲醇＝2：1的混合溶液，超声20分钟形成均匀脂质溶液，转入500ml的圆底烧瓶中，在氮气条件保护下，将上述脂质溶液于30℃减压蒸馏至溶剂无残留，在圆底烧瓶内壁形成均匀的脂质膜。将制成的脂质膜用15ml磷酸缓冲盐溶液(ph＝6.5)在55℃下水化1小时，并在氮气保护下搅拌分散均匀。将上述脂质体溶液用脂质体挤出器进行多次挤出，依次通过0.8μm、0.4μm、0.2μm、0.1μm孔径的聚碳酸酯膜。在氮气保护下，加入磷酸氢二钠溶液，使ph调高至7.4，再将60mg的(cys)-an2加入到脂质体溶液中，在室温下避光轻微搅拌8小时，超滤离心除去分子量小于10000的溶质，用15mlph＝7.4的磷酸缓冲盐溶液重新分散脂质体，即得具有脑靶向功能的银杏内酯b纳米脂质体制剂(样品d)。实施例5将40mg银杏内酯b、1110mg氢化大豆卵磷脂、185mg胆固醇、20mg维生素e、260mg培化磷脂酰乙醇胺、135mg磷脂聚乙二醇马来酰亚胺溶解于60ml氯仿：甲醇＝2：1的混合溶液，超声20分钟形成均匀脂质溶液，转入1000ml的圆底烧瓶中，在氮气条件保护下，将上述脂质溶液于30℃减压蒸馏至溶剂无残留，在圆底烧瓶内壁形成均匀的脂质膜。将制成的脂质膜用30ml磷酸缓冲盐溶液(ph＝6.5)在58℃下水化1小时，并在氮气保护下搅拌分散均匀。将上述脂质体溶液用脂质体挤出器进行多次挤出，依次通过0.8μm、0.4μm、0.2μm、0.1μm孔径的聚碳酸酯膜。在氮气保护下，加入磷酸氢二钠溶液，使ph调高至7.4，再将115mg的(cys)-an2加入到脂质体溶液中，在室温下避光轻微搅拌8小时，超滤离心除去分子量小于10000的溶质，用30mlph＝7.4的磷酸缓冲盐溶液重新分散脂质体，即得具有脑靶向功能的银杏内酯b纳米脂质体制剂(样品e)。实施例6取实施例1制备的1ml银杏内酯b脂质体制剂(样品a)于试管中，加入去离子水稀释五倍，得到具有有淡蓝色乳光的澄清溶液，用激光散射粒度分析仪测定粒径，同时使用透射电镜进行形貌扫描。所得结果分别如附图2和附图3所示，从附图2可以看出，实施例制备的紫衫醇脂质体制剂粒径分布均匀，分散性好，且粒径大小均集中在一定范围内。实施例7采用微柱离心-高效液相色谱法测定银杏内酯b脂质体制剂的包封率。微柱的制作：取一次性1ml注射器，取下活塞，以少量脱脂棉填入注射器管底，防止胶漏，填入入以去离子水充分溶胀的葡聚糖凝胶g-50，置于离心管中，3000r·min-1离心3min脱水，使微柱高度达到1ml刻度。色谱条件：thermoscientifictmumisllc18色谱柱(250×4.6mm)，流动相：甲醇:0.1％磷酸溶液＝35:65(v/v)，柱温：25℃，流速1ml/min，检测波长225nm，进样量20ul。包封率的测定：取0.1ml银杏内酯b纳米脂质体溶液缓缓加入到微柱(预先用空白脂质体饱和)的顶端，500r·min-1离心1min，使脂质体进入微柱，继续加入去离子水0.1ml于微柱的顶端，1000r·min-1离心1min，收集洗脱液，连续重复操作2次，合并收集液于10ml容量瓶，加入流动相定容，超声破乳，于225nm处进样检测，测定浓度，计算被包封的银杏内酯的质量m包。另取0.1ml银杏内酯b纳米脂质体溶液于10ml容量瓶，加入流动相定容，超声破乳，于225nm处进样检测，测定浓度，计算银杏内酯的总质量m总。计算包封率＝m包/m总×100％样品abcde平均包封率(％)8889858188当前第1页12