一种载氧聚合物微泡及其制备方法与流程

本发明涉及一种载氧聚合物微泡及其制备方法，属于医药技术领域。

背景技术：

放疗(放射治疗，radiotherapy)是利用放射线治疗肿瘤的一种局部治疗方法。70％的恶性肿瘤患者在治疗过程中需要用放射治疗，40％的恶性肿瘤可以用放疗根治。放疗的基本原理是利用放射性同位素产生的α、β、γ射线和各类x射线治疗机或加速器产生的x射线、电子线、质子束及其他粒子束等对水分子的电离作用，产生自由基；自由基与生物大分子相互作用，再作用于dna链并造成dna链断裂。上述破坏dna链的过程需要氧气参与。但是绝大部分实体瘤内部呈乏氧状态，该情况使肿瘤细胞易产生放射性抵抗，为杀死肿瘤细胞不得不提高放射剂量。但大剂量放射线会对肿瘤周围血供正常的组织造成较大损伤，引起相关脏器功能异常甚至衰竭，严重降低患者生活质量，减少生存期。

为了降低乏氧区肿瘤细胞的放射抗性，临床试验上曾尝试在放疗过程中引入增敏剂，通常是一些高亲电子试剂(如肖基咪唑或硝基苯衍生物)。但该类增敏剂在增加射线对肿瘤细胞杀伤力的同时，也增加了对正常细胞不可估量的毒副作用。为了减少副作用，国内学者尝试了多种方法来直接提高肿瘤乏氧区的氧气浓度以降低肿瘤细胞的放射抗性。比如，在放射治疗时使患者吸纯氧或在高压氧仓中进行放疗、以及在放疗时通过氧气载体(如：改良的血红蛋白，全氟化碳纳米乳剂和脂质携氧微泡等)向肿瘤乏氧区提供氧气。其中，利用全氟化碳的优异氧亲和力(即氧气在全氟化碳中的溶解度>40％v/v)，氧气饱和的全氟化碳纳米乳剂可以利用肿瘤的高渗透长滞留效应在实体肿瘤聚集，提高肿瘤乏氧区的氧气浓度。但是，全氟化碳液滴仍有一些安全问题未通过临床试验，此外，全氟化碳沸点较低、不太稳定。

另外，磷脂微泡作为超声造影剂在临床上已经大量应用，批准上市的商品包括sonovue、optison和definity。填充气为全氟丙烷或六氟化硫的磷脂微泡作为超声造影剂在临床上大量应用，充分证明了磷脂微泡的安全性。磷脂携氧微泡的结构及组分除了填充气为氧气之外，其他和用作超声造影剂的磷脂微泡(填充气为全氟丙烷或六氟化硫)类似。磷脂携氧微泡被用于传送氧气到人体缺氧组织还处于起步阶段，一般是利用载氧微泡在因呼吸道堵塞或者肺部受伤引起的缺氧和低氧血症时向血液里供给氧气。如专利cn103212094a公开了一种氟氧微泡用来将氧气释放在缺氧脑组织，以实现直接、定点且高效供氧、满足神经细胞的需氧要求。与其他氧气输送系统相比，磷脂携氧微泡在氧气输送效率及安全性具有较大优势。但是，在放疗增敏应用方面，由于氧气在水中扩散系数较高，磷脂携氧微泡的稳定性较差，易在未抵达肿瘤部位前过早将氧气释放到血液中。所以，磷脂携氧微泡稳定性差，用作放疗增敏剂的效率不高。

化学增敏剂因其无差别的增加了射线对肿瘤细胞和正常细胞的杀伤力而毒副作用大。通过携氧载体提高肿瘤乏氧区的氧气分压来降低肿瘤的放射抗性是比较安全的方式，但是现有携氧载体(比如，全氟化碳液滴、磷脂携氧微泡等)仍然面临一些列问题，比如：稳定性差、不易储存等。因此，研发一种易储存、稳定性好、安全有效的携氧载体用做放疗的增敏剂具有良好的应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种载氧聚合物微泡及其制备方法，该载氧聚合物微泡易储存、稳定性好、安全有效，可用作放疗的增敏剂。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种载氧聚合物微泡，所述载氧聚合物微泡包含稳定剂、外壳材料、填充气体、油相溶剂和冻干保护剂，其中，所述稳定剂为人血清白蛋白或合成磷脂，所述外壳材料为脂肪族聚内酯或内酯间的二元或三元无规则或嵌段共聚物、内酯与聚醚间的二元或三元无规则或嵌段共聚物中的至少一种，所述填充气体为氧气或氧气与含氟气体的混合气。

通过本发明的载氧聚合物微泡向肿瘤乏氧区输送氧气，能提高肿瘤细胞对放射的敏感性，从而提高放疗效果。

本发明的载氧聚合物微泡能应用于外照射增敏，包括立体定向放射治疗(srt)、立体定向放射外科(srs)和质子治疗等。立体定向放射治疗(srt)包括三维适形放疗(3dcrt)、三维适形调强放疗(imrt)等，立体定向放射外科(srs)包括x刀(x-knife)、伽玛刀(y刀)和射波刀(cyberknife)，x刀、伽玛刀和射波刀等设备。本发明的载氧聚合物微泡能应用于¹²⁵i等放射性粒子内照射增敏。

靶向分子如叶酸、crgd多肽(cyclicarg-gly-asp，crgd)等可通过磷脂聚乙二醇衍生物官能团连接到本发明的载氧聚合物微泡表面。

作为本发明所述载氧聚合物微泡的优选实施方式，所述合成磷脂为二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二月桂酰基卵磷脂、1，2-二油酰基磷脂酰胆碱、1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂、二花生酰基磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油、二硬脂酰基磷脂酸、二棕榈酰基磷脂酸、二肉豆蔻酰基磷脂酸、二月桂酰基磷脂酸、1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸钠盐、二棕榈酰基磷脂酰丝氨酸、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二-叶酸，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-环肽、聚氧丙烯醚嵌段共聚物、棕榈酸聚烃氧(40)酯、硬脂酸聚烃氧(40)酯中的至少一种。

优选地，所述合成磷脂为二棕榈酰磷脂酰胆碱。

本发明载氧聚合物微泡的制备过程中，稳定剂一般被配置成水溶液，其浓度范围为0.5～10％w/v。将稳定剂配制为水溶液时，可能需要辅助溶剂帮助稳定剂在水种的溶解，常见的溶解辅助溶剂包括丙二醇、甘油等。

作为本发明所述载氧聚合物微泡的优选实施方式，所述外壳材料为聚丙交酯、聚己内酯、聚丙交酯-乙交酯共聚物、聚丙交酯-己内酯共聚物、聚丙交酯-乙交酯-聚乙二醇醚共聚物中的至少一种。

优选地，所述外壳材料的分子量为5000～500000，以5000～80000为更佳；优选地，所述外壳材料为聚己内酯或聚丙交酯-乙交酯共聚物。

本发明载氧聚合物微泡的制备过程中，外壳材料一般溶解在有机溶剂(如二氯甲烷，氯仿、甲苯、苯等)里使用，其浓度范围为1～20％w/v。

作为本发明所述载氧聚合物微泡的优选实施方式，所述含氟气体为六氟化硫、全氟丙烷、全氟丁烷、全氟戊烷、全氟己烷中的至少一种；所述氧气与含氟气体的混合气中，氧气所占的最终体积分数不低于50％。

优选地，填充气体为氧气。

作为本发明所述载氧聚合物微泡的优选实施方式，所述油相溶剂为戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、环辛烷、环壬烷、环癸烷、全氟戊烷，全氟己烷、全氟庚烷、全氟辛烷、全氟壬烷、全氟辛烷、全氟溴辛烷、全氟-15-冠-5-醚中的至少一种。

所述油相溶剂为与水不互溶且不溶解外壳材料的中等沸点的(60～160℃)有机溶剂。

优选地，所述油相溶剂为全氟庚烷或癸烷。

本发明载氧聚合物微泡的制备过程中，油相溶剂和外壳材料一起溶解在有机溶剂中使用，其浓度范围为1～50％v/v。

作为本发明所述载氧聚合物微泡的优选实施方式，所述冻干保护剂为葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、海藻糖、右旋糖酐、可溶性淀粉、聚乙二醇、甘露醇、甘油中的至少一种。

优选地，所述冻干保护剂为聚乙二醇、甘露醇、蔗糖中的至少一种。

本发明载氧聚合物微泡的制备过程中，还可包含其他试剂，如白蛋白交联试剂，比如甲醛、戊二醛。

作为本发明所述载氧聚合物微泡的优选实施方式，所述载氧聚合物微泡的平均粒径为0.1～4.0μm。

本发明的微米级载氧聚合物微泡的平均粒径为1.0～4.0μm，纳米级载氧聚合物微泡的平均粒径为0.1～0.8μm。

本发明还提供了上述载氧聚合物微泡的制备方法，包括以下步骤：

(1)将外壳材料和油相溶剂溶于有机溶剂中，然后加入含稳定剂的水溶液中，在超声、机械破碎、膜乳化的作用下分散为微米级或纳米级乳液；

(2)待步骤(1)所得的乳液中的有机溶剂挥发完全，分散到含有冻干保护剂的水溶液中，然后分装到小瓶中进行冷冻干燥去除水分和聚合物包裹的油相溶剂，从而获得中空的微胶囊；

(3)冷冻干燥完成后，将填充气体填充进小瓶并密封，即得载氧聚合物微泡。

作为本发明所述载氧聚合物微泡的制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)中，外壳材料在有机溶剂中的质量体积分数为1～20％，油相溶剂在有机溶剂中的体积分数为1～50％，稳定剂在水溶液中的质量体积分数为0.5～10％，所述有机溶液与水溶液混合后，有机溶剂的体积分数为5～30％；所述步骤(2)中，冻干保护剂在水溶液中的质量体积分数为0.5～20％，所述乳液与水溶液混合后，乳液的体积分数为10～50％。

作为本发明所述载氧聚合物微泡的制备方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，溶液分装体积一般占瓶子的体积的十分之一到二分之一。

本发明所述载氧聚合物微泡在使用时，向小瓶中注入生理盐水，然后轻轻震荡5～10秒，获得载氧聚合物微泡溶液。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明的载氧聚合物微泡以可生物降解聚合物作为外壳材料，能用于放疗增敏，该研究国内外尚无相关报道。本发明开发了人血清白蛋白或脂质表面包被聚合物双层携氧微泡的制备技术，相比单层磷脂分子作为外壳材料，具有更高机械强度，能提供更强的气体溶解屏障，能避免微泡包裹的氧气过早地释放到血流中。此外，外壳材料可以承受更高的拉普拉斯压力，能使微泡达到纳米级，并通过利用肿瘤的高渗透长滞留效应在肿瘤部位聚集。并且，载氧聚合物微泡可以作为冷冻干燥的粉末储存，并且在使用前现场配制，从而可以避免储存问题。

附图说明

图1为小鼠在注射氧气微泡和氮气微泡后三小时内的肿瘤氧分压变化统计图。

图2为荷瘤小鼠在不同处理后十二天内的肿瘤生长曲线图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1人血清白蛋白-聚合物双层携氧微泡的制备

配置10ml的6％w/v人血清白蛋白水溶液并用1mhcl调节溶液的ph至4，加入2ml的二氯甲烷溶液(溶解有80mg的聚己内酯(mw:10000)和800μl的环辛烷)，利用高速匀浆机在13000～17000rpm条件下乳化上述混合液一分钟。向所得乳浊液缓慢加入10ml蒸馏水并置于磁力搅拌器上搅拌，向上述乳液缓慢滴加0.5ml的25％戊二醛溶液，并且溶液的ph调节到7.0～8.0。搅拌2h使乳浊液里的二氯甲烷挥发，聚合物固化以及表面的白蛋白通过戊二醛交联。将聚己内酯微囊溶液通过离心重悬洗去过量的磷脂和其他小分子，最后分散到96ml的冷冻保护液(25mm甘油，0.5％pluronicf-127(wt/v)，0.1％(wt/v)蔗糖，3.0％(wt/v)甘露醇和5％wt/v聚乙二醇4000水溶液)中，封装到玻璃小瓶中(每瓶3ml)。将玻璃小瓶置于液氮中迅速冷却，然后通过冻干机进行冻干三天。将含有冻干粉的小瓶用橡胶塞密封，然后将瓶中的空气抽出，重新注入氧气。使用之前需要放置一天使瓶中气体稳定。使用时，只需要通过注射器向瓶中注射4ml生理盐水，并用手轻轻振荡。所得的聚己内酯携氧微泡的平均粒径在0.8～4μm之间。

配制本实施例的携氧微泡，取100μl加入2mlpbs溶液(磷酸缓冲溶液)中，通过仪器mastersize2000(malvern，uk)利用直接光散射法测量微泡的粒径。本实施例微泡的粒径为2.21±0.30μm，粒径分散度为0.16±0.08。

实施例2磷脂-聚合物双层携氧微泡的制备

用分析天平量取20mg的二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)，15mg的二棕榈酰磷脂酰甘油(dppg)和15mg的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dspe-mpeg2000)置于烧瓶中，加入2.5ml的丙二醇和2.5ml的甘油，在65℃条件下水浴加热20min至磷脂溶解，然后加入20ml蒸馏水(65℃)在65℃条件下水浴继续加热20min获得均匀的磷脂溶液。将磷脂溶液冷却至室温然后取20ml磷脂溶液转移到烧杯中并置于冰水浴，加入有机相溶液(包括4ml的二氯甲烷、160mg的聚丙交酯-乙交酯共聚物(mw:6000)和1600μl的环辛烷癸)，利用高速匀浆机在13000～17000rpm条件下乳化上述混合液一分钟。向所得乳浊液缓慢加入60ml磷脂稀释液(5ml磷脂溶液加入55ml蒸馏水)并置于磁力搅拌器上搅拌2h使乳浊液里的二氯甲烷挥发和聚合物固化。将聚丙交酯-乙交酯共聚物微囊溶液通过离心重悬洗去过量的磷脂和其他小分子。最后分散到96ml的冷冻保护液(25mm甘油、0.5％w/vpluronicf-127、0.1％w/v蔗糖、3.0％w/v甘露醇和5％w/v聚乙二醇的水溶液)中，按每瓶3ml封装到玻璃小瓶中。将玻璃小瓶置于液氮中迅速冷却，然后通过冻干机进行冻干三天。将含有冻干粉的小瓶用橡胶塞密封，然后将瓶中的空气抽出，重新注入氧气。使用之前需要放置一天使瓶中气体稳定。使用时，只需要通过注射器向瓶中注射4ml生理盐水，并用手轻轻振荡。所得的聚丙交酯-乙交酯共聚物携氧微泡的平均粒径在0.8～4μm之间。

配制本实施例的携氧微泡，取100μl加入2mlpbs溶液(磷酸缓冲溶液)中，通过仪器mastersize2000(malvern，uk)利用直接光散射法测量微泡的粒径。本实施例微泡的粒径为2.12±0.20μm，粒径分散度为0.23±0.05。

实施例3纳米级人血清白蛋白-聚合物双层微泡的制备

人血清白蛋白水溶液配制同实施例1，向上述水溶液中加入2ml的二氯甲烷溶液(溶解有80mg的聚己内酯(mw:10000)和800μl的环辛烷)，利用超声细胞破碎仪乳化上述混合液两分钟。所得乳浊液的后处理同实施例1，即得纳米级人血清白蛋白-聚合物双层微泡。

配制本实施例的携氧微泡，取100μl加入2mlpbs溶液(磷酸缓冲溶液)中，通过仪器mastersize2000(malvern，uk)利用直接光散射法测量微泡的粒径。本实施例微泡的粒径为0.3±0.067μm，粒径分散度为0.15±0.06。

实施例4

本实施例载氧聚合物微泡的制备方法为：

(1)将聚己内酯和环辛烷溶于二氯甲烷中，然后加入含人血清白蛋白的水溶液中，利用高速匀浆机在13000～17000rpm条件下乳化上述混合液一分钟；向所得乳浊液缓慢加入蒸馏水并置于磁力搅拌器上搅拌，向上述乳液缓慢滴加25％戊二醛溶液，并且溶液的ph调节到7.0～8.0；聚己内酯在二氯甲烷中的质量体积分数为1％，环辛烷在二氯甲烷中的体积分数为50％，人血清白蛋白在水溶液中的质量体积分数为0.5％，所述二氯甲烷溶液与水溶液混合后，二氯甲烷溶液的体积分数为30％；

(2)待步骤(1)所得的乳液中的二氯甲烷挥发完全，聚合物固化以及表面的白蛋白通过戊二醛交联，将聚己内酯微囊溶液通过离心重悬洗去过量的磷脂和其他小分子，分散到含有冻干保护剂(25mm甘油，0.5％pluronicf-127(wt/v)，0.1％(wt/v)蔗糖，3.0％(wt/v)甘露醇和5％wt/v聚乙二醇4000水)的水溶液中，然后分装到小瓶中(每瓶3ml)进行冷冻干燥；冻干保护剂在水溶液中的质量体积分数为0.5％，所述乳液与水溶液混合后，乳液的体积分数为50％；

(3)将玻璃小瓶置于液氮中迅速冷却，然后通过冻干机进行冻干三天；将含有冻干粉的小瓶用橡胶塞密封，然后将瓶中的空气抽出，重新注入氧气。使用之前需要放置一天使瓶中气体稳定。使用时，只需要通过注射器向瓶中注射4ml生理盐水，并用手轻轻振荡。

实施例5

本实施例载氧聚合物微泡的制备方法为：

(1)将聚己内酯和环辛烷溶于二氯甲烷中，然后加入含人血清白蛋白的水溶液中，利用高速匀浆机在13000～17000rpm条件下乳化上述混合液一分钟；向所得乳浊液缓慢加入蒸馏水并置于磁力搅拌器上搅拌，向上述乳液缓慢滴加25％戊二醛溶液，并且溶液的ph调节到7.0～8.0；聚己内酯在二氯甲烷中的质量体积分数为20％，环辛烷在二氯甲烷中的体积分数为1％，人血清白蛋白在水溶液中的质量体积分数为10％，所述二氯甲烷溶液与水溶液混合后，二氯甲烷溶液的体积分数为5％；

(2)待步骤(1)所得的乳液中的二氯甲烷挥发完全，聚合物固化以及表面的白蛋白通过戊二醛交联，将聚己内酯微囊溶液通过离心重悬洗去过量的磷脂和其他小分子，分散到含有冻干保护剂(25mm甘油，0.5％pluronicf-127(wt/v)，0.1％(wt/v)蔗糖，3.0％(wt/v)甘露醇和5％wt/v聚乙二醇4000水)的水溶液中，然后分装到小瓶中(每瓶3ml)进行冷冻干燥；冻干保护剂在水溶液中的质量体积分数为20％，所述乳液与水溶液混合后，乳液的体积分数为10％；

(3)将玻璃小瓶置于液氮中迅速冷却，然后通过冻干机进行冻干三天；将含有冻干粉的小瓶用橡胶塞密封，然后将瓶中的空气抽出，重新注入氧气。使用之前需要放置一天使瓶中气体稳定。使用时，只需要通过注射器向瓶中注射4ml生理盐水，并用手轻轻振荡。

实施例6载氧微泡在小鼠肿瘤模型中的增氧效果试验

本试验采用实施例2制备的载氧微泡进行效果测试，其他符合本发明的载氧微泡均具有相同的效果，在此不再赘述。

将人类鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma，npc)细胞cen2种植在小鼠皮下，形成肿瘤模型，两周左右肿瘤生长至体积约160mm³，然后利用该荷瘤小鼠进行实验。采用10％的水合氯醛腹腔注射，100μl的实施例2制备的载氧微泡通过鼠尾静脉注射入鼻咽癌肿瘤的小鼠体内。肿瘤内部的氧分压通过微电极直接测量，微电极在超声影象引导下插入肿瘤中心部位，氧分压的数值通过microsensormultimeter(unisense，denmark)持续记录三个小时。同等浓度的填充氮气的纳米微泡被用于对照试验，小鼠在注射氧气微泡和氮气微泡后三小时内的肿瘤氧分压变化图(**p<0.01)如图1所示。

由图1可知，注射氧气微泡后，瘤内的氧分压逐渐升高并在注射两个小时后达到最高值，随后逐渐下降。和对照组相比，瘤内氧分压最高值提高了6倍左右。注射氧气微泡后，瘤内氧分压超过20mmhg的时间超长达2个小时左右，为放射治疗提供足够长的时间窗口。

实施例7载氧微泡在小鼠肿瘤模型中的放疗增敏效果试验

本试验采用实施例2制备的载氧微泡进行效果测试，其他符合本发明的载氧微泡均具有相同的效果，在此不再赘述。

采用实施例6的方法构建小鼠肿瘤模型。将荷瘤小鼠随机分成四组，每组六只小鼠。分别标记为：组1：对照组，该组小鼠每天注射100μlpbs溶液，不做其他处理；组2：携氧微泡组，该组小鼠注射100μl实施例2的携氧微泡，不做其他处理；组3：放疗组，该组小鼠肿瘤部位植入¹²⁵i粒子，不做其他处理；组4：放疗+携氧微泡组，小鼠注射100μl实施例2的载氧微泡然后超声激发。每天测量各组小鼠肿瘤大小，各组小鼠治疗12天，荷瘤小鼠在不同处理后12内的肿瘤生长曲线(**p<0.01，n＝6)如图2所示。

由图2可知，与组1和组2相比，组3和组4具有显著的肿瘤生长抑制效果。组4和组3只施加放射治疗相比，注射携氧微泡后，肿瘤的抑制效果更加明显。说明本发明的携氧微泡可以通过增加肿瘤乏氧区细胞对射线的放射敏感性，来显著增强放疗的治疗效果。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。