一种酒石酸溴莫尼定结冷胶型原位凝胶滴眼液及制备方法与流程

本发明涉及滴眼液
技术领域：
，特别是涉及一种酒石酸溴莫尼定结冷胶型原位凝胶滴眼液及制备方法。
背景技术：
：青光眼是不可逆失明最主要的原因之一，以特征性视神经萎缩和视野缺损为共同特征，病理性眼压增高是其主要体征。流行病学研究结果表明：眼压每升高1mmhg，患青光眼几率就增加12％。该疾病主要是由于房水循环被破坏而导致，药物治疗主要是通过抑制房水分泌从而降低眼内压，保障患者的视神经和视网膜不被破坏。因此，减少眼内房水的生成和增加房水的排出有助于降低眼压，在降低眼压的同时选择具有神经保护作用的药物更有助于该类疾病的治疗。国外关于青光眼药物治疗的依从性研究数据显示，普通滴眼液由于流失性大，冲洗鼻泪管或溢出到脸颊，可能会导致副作用，如过敏性睑缘炎和接触性皮炎，另外药液流失往往导致达不到治疗剂量，这些因素导致患者对治疗青光眼滴眼液的依从性不良(低于50％)。用药的方便程度以及药物良好的耐受性是提高患者治疗依从性的关键，采用最小的药物剂量、最少的用药次数、达到最佳的降眼压效果是目前青光眼药物治疗的原则。酒石酸溴莫尼定(brimonidinetartrate，brt)是目前临床上主要应用的选择性α2肾上腺素能受体激动剂，用于降低开角型青光眼或高眼压患者的眼压，具有减少房水的产生和增加葡萄膜巩膜外流的双重作用机制，同时具有视神经保护作用。近三年brt滴眼液的使用量在国内降眼压的药品中一直稳居前二。正是因为brt在降眼压方面效果显著，美国allergan公司研制开发出brt滴眼液(浓度0.1-0.2％)，商品名为阿法根(alphagan)，已在美国、中国、英国及巴西等国家获得批准并上市。其用药频率通常是2-3次/天，每次1滴。但由于大多数青光眼患者使用这类普通滴眼液时，因为生理上的原因(如眨眼反射、泪液分泌和鼻泪管引流等)，容易被迅速消除，导致角膜前停留时间短，药物的吸收受到限制，眼部生物利用度较差，给药剂量也不易控制，从而容易使用过量或者频繁，又由于鼻泪管引流容易进入其它非目标区域，从而产生副作用。由于该药较易通过血脑屏障，具有潜在的中枢抑制作用，故对儿童禁用。低浓度的brt滴眼液，虽然可以在一定程度上降低brt的不良反应但效果仍有限。因此，开发该药物的新剂型是很有必要的，以减少brt在眼表的不良反应，减少鼻粘膜对brt的全身吸收，保持药物降低眼压的功效。近年来，为了解决传统的眼用液体制剂的生物利用度较低的缺点，国内外学者研究了一系列新型给药系统来提高局部给药时药物在眼部的生物利用度，如纳米混悬剂、软膏、眼内插入剂和凝胶等。相比于传统的溶液剂，这些剂型能够延长药物在眼部的保留时间。但由于其会造成视力模糊(如软膏)，或者由于患者耐受性差(如眼内插入剂)等影响，并未被广泛地接受。而眼用原位凝胶是一种高分子聚合物溶液，以溶液状态给药，并在给药部位相变为凝胶状态的给药系统，该给药系统兼具溶液与凝胶的优点，且该剂型由于相变前黏度小，故给药剂量准确；相变后凝胶黏度大，呈无色透明状，可延长药物在眼部的滞留时间，降低给药频率，提高药物生物利用度，也可提高患者耐受性等问题，已成为研究热点。这种在眼球表面发生的溶液-凝胶相变可由3种因素引起：温度、ph和离子。①温度敏感型，有泊洛沙姆、纤维素衍生物、木聚糖等，其中常用的是泊洛沙姆。②ph敏感，应用较多的有壳聚糖和卡波姆。③离子型敏感，如结冷胶、藻酸盐、β-卡拉胶等。与温度敏感原位凝胶相比，离子敏感原位凝胶所需聚合物浓度较低；与ph敏感的原位凝胶相比，离子敏感原位凝胶可将处方ph调至眼部最适ph，故对眼部刺激性最小。其中离子型原位凝胶尤以结冷胶(gellangum)为基质的发展前景最优。低浓度的结冷胶在水溶液中形成阴离子多糖，离子强度增加后，由溶液剂变为凝胶剂，泪液中阳离子增加凝胶形成的比例也随之增加。作为眼用原位凝胶基质，结冷胶突出的特点有(1)用量低：一般0.6％以下，对眼刺激小；(2)便于给药，形成凝胶快：低浓度的结冷胶水溶液是一种低黏度的溶液，表现出非常好的流动性，点入眼内碰到微量的泪液后，在水的参与下，泪液中的阳离子诱使结冷胶从无规线团形成链桥转变成双螺旋，接着由双螺旋聚集形成结合区从而形成凝胶。(3)舒适性增强，分布均匀：其在人工泪液中表现出剪切稀释特性，即搅拌或眼皮频繁眨动会使粘度下降，静止则粘度又会升高呈现凝胶状，有利于眼部给药以及在眼球表面的分布。药用结冷胶(gellangum)最初是由美国cpkelco公司20世纪80年代开发的一种微生物食用胶，是一种线性的阴离子杂多糖，由葡萄糖、葡糖醛酸、鼠李糖以2∶1∶1的摩尔比连接成四元重复单元，形成聚合物主链，相对分子质量约0.5×106，结构式如下式所示：其已用于多种药物的研究，如马来酸噻吗洛尔、盐酸环丙沙星、吲哚美辛、甲磺酸培氟沙星和加替沙星等。目前国外虽有马来酸噻吗洛尔原位凝胶上市，但酒石酸溴莫尼定与马来酸噻吗洛尔相比，作用机理不一样，酒石酸溴莫尼定是α2-肾上腺素能受体激动剂，在动物及人体中用荧光光度测定法进行的研究表明，其具有双重的作用机制：既减少房水的生成，又增加葡萄膜巩膜的外流。马来酸噻吗洛尔为非选择性β-肾上腺能受体阻滞剂，降眼压确切机理尚不清楚，眼压标记和房水荧光光度研究提示本品降眼压作用与减少房水生成相关。两者副作用方面，酒石酸溴莫尼定对心血管和肺功能的影响很小，而马来酸噻吗洛尔则比较明显。有文献表明酒石酸溴莫尼定对视网膜神经纤维层损伤也比马来酸噻吗洛尔少，且更不可能发生差的视野进展。技术实现要素：本发明针对现有技术中酒石酸溴莫尼定相关滴眼液眼部生物利用度较差，容易使用过量或者频繁，且容易通过鼻泪管引流进入其它非目标区域，产生副作用等问题，提供了一种使用效果更好的酒石酸溴莫尼定结冷胶型原位凝胶滴眼液。一种酒石酸溴莫尼定结冷胶型原位凝胶滴眼液，以100ml计包括以下原料组分：作为优选，所述渗透压调节剂为甘露醇、甘油、葡萄糖、1,2-丙二醇中的至少一种。更优选的，所述渗透压调节剂为甘露醇。作为优选，所述ph调节剂为氨基丁三醇。关于ph调节剂，一般报道是用缓冲盐体系，比如市售的酒石酸溴莫尼定滴眼液采用枸橼酸钠与枸橼酸作为缓冲液体系，而本发明因为要采用结冷胶制成眼用原位凝胶，离子型的原位凝胶遇到钠、钾、镁、钙等离子会由液体转变成凝胶，所以要避免采用，本发明以氨基丁三醇等作为ph调节剂为佳。作为优选，所述增稠剂为甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素中的至少一种。增稠剂也可以不添加。作为优选，所述抑菌剂为苯扎氯铵、苯扎溴铵、对羟基苯甲酸酯(尼泊金甲酯)中的至少一种。抑菌剂，也可以称为防腐剂，用于在滴眼液包装打开后起到避免细菌滋生，使滴眼液变质的作用。由于一些病人可能会对防腐剂敏感，引起眼部不适，所以也可以去掉防腐剂成分，改成单日剂量的包装，开封后尽快使用即可。作为优选，所述酒石酸溴莫尼定结冷胶型原位凝胶滴眼液的ph值为6.0-7.0，渗透压为260-310mosmol/kg。正常泪液的ph为7.4左右，并具有一定的缓冲容量，滴眼液滴入眼后被泪液稀释，泪液的缓冲作用能中和眼用溶液，所以能减轻明显的不适感。但滴眼液过于偏酸时，可凝固眼黏膜的蛋白质；过于偏碱性，则可使眼黏膜的上皮细胞硬化或膨胀。因此，滴眼剂ph过高或过低对眼都会有刺激性。由ph不当而引起的刺激性，可增加泪液的分泌，导致药物迅速流失，甚至损伤角膜。滴眼液的ph一般可在ph5.5～7.8范围内。有文献认为酒石酸溴莫尼定在6.5左右比在7.0以上时更稳定，市售滴眼液的ph为6.5，考虑原位凝胶未加氨基丁三醇时的ph约为4，可以调整ph到6.0～7.0之间。本发明还提供了所述酒石酸溴莫尼定结冷胶型原位凝胶滴眼液的制备方法，包括以下步骤：(1)结冷胶中加入部分水，搅拌溶胀；(2)将其余原料用剩余部分水溶解后，加入到步骤(1)溶胀后的结冷胶中，搅拌均匀，即得所述酒石酸溴莫尼定结冷胶型原位凝胶滴眼液。作为优选，步骤(1)加入的水量为总水量的60～70％，温度为90±5℃，搅拌溶胀时间为15～20min。作为优选，步骤(2)搅拌均匀后过滤除菌。过滤除菌可以采用0.1μm～0.22μm孔径的滤膜进行过滤除菌。由于结冷胶遇较高温度的水才能比较快地溶散，所以在制备时先将结冷胶用较高的温度制备成浓度高的溶液，同时此时由于不含有主药物酒石酸溴莫尼定，高温度对药物的影响相对较小；然后将主药与其它成分溶解混合，加入到结冷胶溶液中。最后需保持40℃以上过滤除菌，因为此温度以上时，滴眼液溶液的粘度相对来说比25℃室温左右的要小很多(结冷胶溶液温度越高粘度越小，如在10rpm转速时，35℃的粘度为6cp左右，25℃的粘度为125cp)，40℃以上的粘度可在3cp以下，粘度小可以顺利地通过微孔滤膜过滤。本发明酒石酸溴莫尼定结冷胶型原位凝胶滴眼液通过将酒石酸溴莫尼定药物制成结冷胶型原位凝胶滴眼液，相比于现有技术中市售酒石酸溴莫尼定滴眼液，能够在较长时间内使房水内药物浓度保持在较高水平，最高药物浓度和累积药物量均大大提高，增加生物利用度，可以减少药物使用频次，降低副作用发生的可能性。附图说明图1为实施例1中不同离子强度对处方4粘度的影响检测结果图。图2为实施例1中不同处方在与人工泪液的体积配比为40∶28时粘度的变化检测结果图。图3为实施例1中处方3在与人工泪液体积配比为40∶28时不同剪切速率对粘度影响检测结果图。图4为实施例2制得的酒石酸溴莫尼定原位凝胶与市售滴眼液的体外累积释放率-时间曲线图。图5为实施例3制得的酒石酸溴莫尼定原位凝胶与市售滴眼液在兔离体巩膜的体外累积渗透率-时间曲线图。图6为实施例3得的酒石酸溴莫尼定原位凝胶与市售滴眼液在兔离体角膜的体外累积渗透率-时间曲线图。图7为实施例4制得的酒石酸溴莫尼定原位凝胶与市售滴眼液在兔眼房水内药物浓度-时间曲线图。图8为实施例2和7制得的酒石酸溴莫尼定原位凝胶与市售滴眼液的兔眼压变化图。具体实施方式实施例1按下表1配制不同处方，可筛选不同结冷胶和羟丙基甲基纤维素(hpmc)的量。表1不同辅料配比的胶凝能力。注：+：胶凝，但晃动易散；++：迅速胶凝，晃动不易散；+++：迅速胶凝，晃动更不易散。制备方法：取结冷胶加入适量90℃左右纯化水中，制成重量百分比含量0.6％的结冷胶溶液，搅拌溶胀完全。然后分别稀释可得0.3、0.4、0.45、0.5％不同浓度的结冷胶；取0.2ghpmc溶解于25ml纯水中，取2.5ml加入7.5ml0.6％结冷胶，即形成处方5；取1.25ml加7.5ml0.6％结冷胶补加水至10ml，即形成处方4，其余处方按类似方法配制。胶凝能力测定：取2ml人工泪液(34℃，氯化钠水溶液6.7g·l-1、碳酸氢钠水溶液2.0g·l-1、二水合氯化钙水溶液0.8g·l-1)置于具塞试管中，水浴34℃保温，将100μl原位凝胶加入试管中，观察并记录凝胶形成及溶解的时间。另外，采用brookfielddv-2t粘度计可以测定不同处方的粘度随泪液配比(离子强度)和转速(剪切速率)的变化情况。由于给药后眼部会不断分泌泪液，故将原位凝胶与不同比例的人工泪液混合均匀，加入样品杯中，平衡5min后开始测定其在温度为34℃、转速为10rpm下、粘度随时间变化的情况，每个样品分别测定4次。以处方4为例，其粘度随离子强度变化的情况见图1，在未加入人工泪液前，原位凝胶的粘度为7cp左右，加入不同配比的人工泪液后，粘度会随离子强度的变化而起很大的变化。这是一个随泪液量的增多而升高降低的过程，体现了离子原位凝胶的特性。处方在与人工泪液的体积配比为40∶28时总体粘度最高，各处方在此时的情况可见图2。剪切速率对处方粘度的影响也很高，以处方3为例，其对处方与人工泪液的体积配比为40∶28时的粘度变化见图3，剪切速率越高，粘度显示越小，这验证了结冷胶在人工泪液中能表现出剪切稀释的特性，即搅拌或眼皮频繁眨动会使粘度下降，静止则粘度又会升高呈现凝胶状，有利于眼部给药以及在眼球表面的分布。这几种结冷胶与hpmc的配比实验结果可作为选择结冷胶重量百分比含量的依据，结冷胶最为重要，优选可为0.4-0.5％。实施例2制备方法：取结冷胶加入适量90℃左右纯化水中，制成重量百分比含量0.6％的结冷胶溶液，搅拌溶胀完全；另取处方量的羟丙基甲基纤维素用15ml纯化水溶解，加入酒石酸溴莫尼定、甘油、氨基丁三醇、对羟基苯甲酸酯，搅拌溶解，加入上述重量百分比含量为0.6％的结冷胶溶液70ml，再加纯化水至100ml，0.22μm微孔滤膜过滤，分装即得，酒石酸溴莫尼定重量百分比含量为0.1％，结冷胶最终重量百分比浓度0.42％。ph值为6.5，渗透压为260mosmol/kg。体外释放实验：分别精密移取1.0ml酒石酸溴莫尼定眼液(1mg/ml)，与本实施例2自制的结冷胶原位凝胶于分子截留量为3500的透析袋中，将透析袋口扎紧后置于西林瓶中。加入25ml人工泪眼作为扩散介质，并将西林瓶置于恒温摇床中，温度控制在34℃，震荡频率100rpm。每隔一定时间(15min、30min、45min、60min、75min、90min、120min、150min、180min)，取样1ml，并及时补加等温等体积人工泪眼。样品经离心后，采用高效液相法测定药物含量。色谱柱：c18column(diamonsil，4.6mm×150mm，5μm，dikma公司)，流动相：乙腈∶枸橼酸缓冲液(0.017mol/l，三乙胺调ph＝3)体积比为0.08∶0.92；流速：1.0ml/min；检测波长：248nm；柱温：30℃；进样量：20μl。结果见图4，图4中，处方1为实施例2制备得到的产品；对照为同浓度的酒石酸溴莫尼定普通滴眼液(由浓度为2mg/ml的市售酒石酸溴莫尼定滴眼液稀释一倍得到。市售酒石酸溴莫尼定滴眼液(2mg/ml)每毫升含：酒石酸溴莫尼定2mg，苯扎氯铵0.05mg，聚乙烯醇14mg，氯化钠7.0mg，枸橼酸钠4.5mg，枸橼酸0.5mg及纯化水。)，实验重复次数n＝4。由图4的检测结果可知，与酒石酸溴莫尼定普通滴眼液相比，本发明实施例2制备的结冷胶组释放没有明显差异。实施例3制备方法：取处方量结冷胶加入90℃左右700ml的纯化水中，搅拌溶胀完全；另取酒石酸溴莫尼定、甘露醇、氨基丁三醇、苯扎氯铵置小瓶中，取约150ml纯化水搅拌使溶解，加入上述结冷胶溶液中，取约100ml水荡洗小瓶再次加入。混合溶液加纯化水至1000ml，40℃以上0.22μm微孔滤膜过滤，分装即得。酒石酸溴莫尼定重量百分比含量为0.2％，结冷胶最终重量百分比浓度0.48％。ph值为6.74，渗透压为289mosmol/kg。兔离体巩膜(或角膜)渗透研究：将新西兰兔空气针处死后，立即取眼球，除去多余组织，仔细分离出巩膜(或角膜)。将新鲜离体巩膜(或角膜)固定于自制弧形口franz扩散池的供给池和接收池之间，使上皮层面向供给池(或角膜外侧面向供给池)，在接受池中加入新鲜配制的stf溶液约3ml，赶尽气泡，磁力搅拌并将温度控制于34℃，然后分别在供给池中加入80μlbrt-isg+14μlstf的混合溶液或80μl市售酒石酸溴莫尼定滴眼液+14μlstf的混合液。加入制剂后开始计时，每隔一定时间从接收池中取出100μl样品，同时补充等体积等温stf溶液，hplc法测定药物浓度。以累积渗透量q与时间t做图。结果见图5和图6所示，与现有的市售酒石酸溴莫尼定滴眼液相比，本发明实施例3制备的结冷胶组的兔离体巩膜(图5)和角膜(图6)渗透总体来说没有明显差异。实施例4制备方法：取处方量结冷胶加入90℃左右600-700ml的纯化水中，搅拌溶胀完全；另取氨基丁三醇、甘露醇、酒石酸溴莫尼定置于小烧杯中加入100ml约50℃左右纯化水搅拌溶解，加入上述结冷胶溶液中，取约100ml水分2-3次荡洗小烧杯再次加入。混合溶液加纯化水至1000ml，50-60℃0.22μm微孔滤膜过滤，分装即得。酒石酸溴莫尼定百分比含量为0.2％，结冷胶的最终质量百分比浓度为0.45％。ph值为7.0，渗透压为293mosmol/kg。家兔眼刺激性试验：取检疫合格、健康的新西兰兔4只，雌雄各半。采用同体左右侧自身对照，每兔左眼给予供试品，右眼给予对照。使动物的头右倾，让受试的左眼向斜上方，轻提一侧眼睛的下眼睑，将供试品(实施例4制备得到的酒石酸溴莫尼定眼用结冷胶原位凝胶剂)1滴(约50μl)直接滴于结膜囊内，轻合眼睑10s。右侧眼睛用相同方法滴加0.9％nacl水溶液作为对照。连续给药14天。于每天第一次给药前以及最后一次给药后1、2、4、24、48和72小时用检眼镜进行眼刺激反应检查并评分，眼刺激性试验表明无刺激性。兔眼房水内药动学实验：取重量在2.5-3.0kg的健康新西兰白兔作为实验动物。兔耳缘静脉注射20％乌拉坦(剂量1g/kg)麻醉，适时补注射，保证在整个试实验过程中动物一直处于麻醉状态。在插入探针前，先在眼部滴入1％托吡卡胺放大瞳孔。用开睑器撑开眼睑，借助27g注射针辅助探针插入房水，将注射针从角膜的一端边缘穿过角膜插入，然后横穿前房到达角膜的另一端边缘，再将探针样品收集端小心地插入注射针的斜面端，然后把注射针慢慢抽出使得探针上的透析膜位于前房的中间，用医用粘合剂封闭穿线洞。微注射泵向探针内灌注ph7.4林格氏缓冲盐溶液，平衡1h，使眼内压和眼前房内防房水得到充分恢复。市售酒石酸溴莫尼定滴眼液(2mg/ml)每毫升含：酒石酸溴莫尼定2mg，苯扎氯铵0.05mg，聚乙烯醇14mg，氯化钠7.0mg，枸橼酸钠4.5mg，枸橼酸0.5mg及纯化水。左、右眼分别给予原位凝胶与市售酒石酸溴莫尼定滴眼液(2mg/ml)50μl，在给药后的30、60、90、120、150、180、210、240、270、300min收集房水的微透析样品，用高效液相-串联质谱测定药物浓度。液质系统：agilent液质系统(安捷伦科技有限公司，美国)，模块组成：agilent1290液相系统，agilent6460三重四极杆质谱仪，masshunterworkstationsoftwareb07软件。lc/ms/ms条件：液相条件：采用色谱柱zorbaxsb-c18(3.0×150mm，3.5μm)；流动相：a：0.1％甲酸水；b：乙腈，等度洗脱程序：0min～2.5min(一针样品时间)：50％b；流速：0.4ml/min；进样量：5μl；柱温40℃。质谱条件：大气压电喷雾离子源(esi)：正离子模式，多重反应选择离子监测(mrm)；离子源参数：干燥气温度(gastemp)：300℃干燥气流速；(gasflow)5l/min雾化气压力：(nebulizer)45psi鞘气温度：(sheathgastemp)250℃鞘气流速：(sheathgasflow)11l/min毛细管电压：(capillary)3500v喷嘴电压：(nozzlevoltage)500v；质谱分析参数见表2。表2化合物的mrm质谱分析参数。将测得的药物浓度进行对比分析，用das2.0药动学软件处理。房水内药物浓度－时间曲线结果见图7，药动学参数见表3(n＝10)。结果显示，市售石酸溴莫尼定滴眼液房水内浓度一直在比较低的水平，浓度-时间曲线下面积(auc)为412.6±204.3mg/l·min，最高浓度(cmax)为3.1±1.4mg/l，而本发明实施例4制备的原位凝胶能在较长时间内使房水药物浓度保持于较高的药物浓度水平，auc为1397.1±444.6mg/l·min，cmax为8.2±2.6mg/l。原位凝胶的auc是市售滴眼液的3.38倍，cmax是市售滴眼液的2.67倍，两者有极显著性差异(p<0.01)。表3酒石酸溴莫尼定原位凝胶与市售滴眼液在兔眼内的药动学参数(n＝10)。药动学参数单位市售滴眼液原位凝胶滴眼液auc(0-t)mg·min·l-1412.6±204.3**1397.1±444.6mrt(0-t)min110.3±18.2**140.1±17.5t1/2min65.0±19.2*75.6±17.7tmaxmin60.0±21.2**93.0±29.0cmaxmg·l-13.1±1.4**8.2±2.6*市售vs原位p>0.05；**市售vs原位p<0.01。实施例5制备方法：取处方量结冷胶加入约700ml纯化水中，升温至90-95℃，搅拌至澄清；另取甲基纤维素加100ml纯化水溶胀完全，再加入1,2-丙二醇、氨基丁三醇、酒石酸溴莫尼定，搅拌均匀，加入上述结冷胶溶液中。再用纯化水100ml分两次荡洗药液瓶加入混合液中。混合液加纯化水至1000ml，保持温度50-60℃，0.22μm微孔滤膜过滤，分装即得，酒石酸溴莫尼定百分比含量为0.1％，结冷胶的最终质量百分比浓度为0.4％。ph值为6.0，渗透压为286mosmol/kg。实施例6制备方法：取处方量结冷胶加入约60ml纯化水中，升温至90℃左右，搅拌摇匀；另取其他辅料与酒石酸溴莫尼定，加20ml约50℃左右纯化水，搅拌使溶解，加入上述结冷胶溶液中。再用少量纯化水分两次荡洗药液瓶加入混合液中。混合液加纯化水至100ml，40℃以上过0.22μm微孔滤膜即得，酒石酸溴莫尼定百分比含量为0.2％，结冷胶的最终质量百分比浓度为0.55％。ph值为6.5，渗透压为291mosmol/kg。家兔眼刺激性试验：取检疫合格、健康的新西兰兔4只，雌雄各半。采用同体左右侧自身对照，每兔左眼给予供试品，右眼给予对照。使动物的头右倾，让受试的左眼向斜上方，轻提一侧眼睛的下眼睑，将供试品(实施例6制备得到的酒石酸溴莫尼定眼用结冷胶原位凝胶剂)1滴(约50μl)直接滴于结膜囊内，轻合眼睑10s。右侧眼睛用相同方法滴加市售酒石酸溴莫尼定滴眼液作为对照。连续给药14天。于每天第一次给药前以及最后一次给药后1、2、4、24、48和72小时用检眼镜进行眼刺激反应检查并评分。眼刺激性试验表明两药均无刺激性。实施例7制备方法：取处方量结冷胶加入约60ml纯化水中，升温至95℃，摇匀；另取羧甲基纤维素加水20ml溶胀完全，加入氨基丁三醇、甘油、酒石酸溴莫尼定，搅拌均匀，加入上述结冷胶溶液中。再用少量纯化水荡洗药液瓶加入混合液中。混合液加纯化水至100ml，过0.22μm微孔滤膜，分装即得。酒石酸溴莫尼定百分比含量为0.04％，结冷胶的最终质量百分比浓度为0.4％。ph值为6.0，渗透压为310mosmol/kg。实施例8降眼压实验：新西兰兔，雌雄兼有，制作慢性高眼压模型，耳缘静脉注射麻醉，用1ml注射器眼角膜缘穿刺抽取房水0.1ml，再注入0.3％复方卡波姆溶液0.1ml，tonopen眼压计每日测眼压并观察兔眼的变化，每次测量3遍，取其平均值。以眼压大于22mmhg并持续l周，表明造模成功。取造模成功的8只兔(16只眼)，随机分成4组，每组4只眼，分别滴入0.2％市售酒石酸溴莫尼定滴眼液、0.1％和0.04％酒石酸溴莫尼定原位凝胶(实施例2和7)各50μl，每天滴1次，生理盐水滴眼液作为空白对照。测量眼压，每次测量3遍，取其平均值。眼压变化见图8。由图可见0.1％和0.04％的酒石酸溴莫尼定原位凝胶与市售酒石酸溴莫尼定滴眼液降眼压效果相当。稳定性试验：按实施例3处方制备的制剂分装入浅蓝色高密度聚酯滴眼液瓶密封(每支5ml)后作为样品，做初步影响因素试验和加速试验，1.影响因素试验(1)高温试验：将样品分别置于40℃、60℃的恒温箱中放置10d。并在第0、5、10d取样，考察制剂各项指标。(2)强光照射试验：将样品置于光照培养箱中，于照度4500lx±500lx的条件下放置10d，于第5d和第10d取样，考察样品的各项指标。2.加速试验：将样品置于温度40±2℃、相对湿度为25±5％条件下的恒温培养箱中6个月，分别在1、2、3、6个月时取样，考察样品的各项指标。试验结果：影响因素试验：(1)高温试验：结果见表4。表4高温条件下的稳定性(n＝3)结果显示，与初始相比，分别在高温40℃和60℃条件下放置10天后，外观、ph值和含量基本无变化，在40℃下渗透压基本也无变化，而在60℃高温下渗透压值略微增加，但仍在人眼适应范围内。表明该制剂在高温40℃条件下稳定，但60℃高温条件对其有一定的影响。(2)强光照试验：结果见表5。表5光照条件下的稳定性(n＝3)结果显示，与初始相比，在4500lx±500lx条件下放置10天后，外观、ph值和含量基本无变化，杂质稍有增多。加速试验：结果见表6。表6加速试验结果(n＝3)结果显示，与初始相比，加速放置6个月后，外观、ph值和含量、有关物质等稍有变化，但仍在正常范围内。结合影响因素试验，表明制剂应避光阴凉处保存。总的来说，长期放置比较稳定。当前第1页12