一种人参皂苷-华法林自组装纳米凝胶及其应用的制作方法

本发明属于药剂制剂技术领域，具体涉及一种人参皂苷-华法林自组装纳米凝胶及其应用。

背景技术：

肿瘤（cancer）是威胁全人类健康的极具破坏性的一种疾病，在我国肿瘤已成为居民首要的死亡原因，而肿瘤转移是肿瘤患者的主要死亡原因，临床上90%以上的肿瘤患者死于肿瘤转移而不是原发性肿瘤，虽然原发性肿瘤通过手术后能得到一定的控制，然而却面临着肿瘤复发和转移的危险，肿瘤细胞一旦转移就很难通过手术的手段进行治愈。肿瘤转移是由肿瘤原发部位直接向周围扩张，或者通过血道或淋巴道转移瘤细胞在远端组织落户发展形成新生肿瘤的过程。一般来说，肿瘤转移要经历粘附、分泌各种蛋白酶、迁移和局部增殖形成转移灶。所以，抑制肿瘤细胞粘附、肿瘤对细胞外基质的降解、癌细胞运动、肿瘤新生血管的形成是目前抑制肿瘤转移的主要方法。

华法林（warfarin）是双香豆素衍生物类化合物，它是目前临床上心血管疾病应用最广泛的口服抗凝药之一，主要用于预防和治疗心脑血管内科、骨科等多种血栓栓塞、缺血性疾病。其主要通过抑制维生素k依赖性凝血因子ii、vii、ix和x以及蛋白s、蛋白c和蛋白z在肝脏内合成从而发挥抗凝作用。华法林主要由肝脏的p450系统进行代谢。s-warfarin的代谢酶主要是肝药酶cyp2c9，其代谢之后的产物为s-7-hydroxywarfarin，r-warfarin的代谢酶主要是肝药酶cyp3a4和cyp1a2，代谢后所生成的产物为r-6-hydroxywarfarin、r-8-hydroxywarfarin和r-10-hydroxywarfarin。华法林是最常用于静脉血栓栓塞症治疗的口服抗凝药，包括合并性肿瘤患者，华法林都有很好的疗效。

人参（ginseng）是多年生草本植物，被人们称为“百草之王”，是中国传统的药材。人参总皂苷（ginsenosides）是人参的主要活性成分。已有文献证明人参皂苷具有增强机体免疫力、改善心血管功能、抗炎、抗氧化、抗血小板聚集、神经保护等生物活性。研究表明人参对血管内皮细胞功能的保护作用是其调节心血管系统的关键因素，其作用机制主要包括：抑制血管内皮细胞表面粘附因子的表达、减少血小板的聚集、调节细胞刺激因子的活性和抑制炎性因子的表达等。近年来研究结果发现，人参总皂苷及其单体化合物对促进肿瘤细胞凋亡、促使肿瘤细胞分化、提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性以及提高机体抗肿瘤的免疫力等方面具有重要的作用。

人参中的有效成分人参总皂苷对癌细胞的增殖具有非常强的抑制作用，可诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖、转移和血管生成。华法林能改善癌症患者的生存，具有潜在的抗肿瘤活性，而二者结合在抗肿瘤转移方面的应用尚未有人报道。本发明运用纳米技术，第一次创新性的将治疗心血管药物的华法林与人参皂苷制备成纳米凝胶，其具有的较小纳米尺寸可通过epr效应即实体瘤的高通透性和滞留效应(enhancedpermeabilityandretentioneffect)将药物有效的传递到肿瘤组织中，发挥抗肿瘤转移的作用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种人参皂苷-华法林自组装纳米凝胶及其应用，其可从两种传统的治疗心血管疾病的药物中探索出一条抗肿瘤转移方面联合应用的新途径。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种人参皂苷-华法林自组装纳米凝胶，其是将华法林和人参皂苷凝胶纳米颗粒在水中混合，经超声处理15min后使其自组装形成人参皂苷-华法林纳米凝胶输送系统。

所述人参皂苷-华法林自组装纳米凝胶中人参皂苷凝胶纳米颗粒的浓度为1~25mg/ml、华法林的浓度为1~25mg/ml。

所述人参皂苷-华法林自组装纳米凝胶的平均粒径为15~60nm，具有较高的稳定性。

所述人参皂苷凝胶纳米颗粒的制备包括如下步骤：

1）以五加科植物中国人参、高丽参、西洋参、越南人参中的一种或多种提取的人参总皂苷为原料，在酸性水溶液中进行酸解反应得人参皂苷酸解液；

2）将步骤1）所得人参皂苷酸解液经纯化去除杂质即得。

步骤1）中所述酸性水溶液为有机酸和/或无机酸的水溶液，其ph值<7，最佳为1-3；所述酸解反应的温度为50~105℃，时间为1~72h；

步骤2）中纯化的具体操作为：将人参皂苷酸解液于-25℃～35℃静置2小时以上，然后经离心或过滤去除沉淀，将清液用有机碱和/或无机碱调节ph至7.5～14，获得沉淀物；在25℃～85℃下，将沉淀物溶解于有机溶剂中，然后将溶液冷却至-20℃～10℃，经离心或过滤去除沉淀后，将清液减压浓缩，再重新于有机溶剂中溶解，并将溶液冷却至-20℃～10℃，经离心或过滤去除沉淀后，清液减压浓缩并进行干燥。

所述有机溶剂为二甲基亚砜、甲醇、乙醇、正丁醇、丙醇、四氢呋喃、吡啶中的一种或多种；所述干燥为常压干燥、减压浓缩干燥或喷雾干燥。

所得人参皂苷-华法林自组装纳米凝胶不仅可用于制备心血管药物，还可用于制备抗肿瘤转移药物。

本发明具有的优点在于：

（1）本发明制备的人参皂苷-华法林自组装纳米凝胶可显著提高人参皂苷和华法林抑制肿瘤细胞转移的作用；

（2）本发明制备的人参皂苷-华法林自组装纳米凝胶具有较小的粒径、较高的稳定性和载药量；

（3）本发明人参皂苷-华法林自组装纳米凝胶具有线性结构。

附图说明

图1为人参皂苷-华法林自组装纳米凝胶的粒径（a）和电势图（b）。

图2为人参皂苷-华法林自主装纳米凝胶的原子力图。

图3为不同浓度下华法林溶液（war）、人参皂苷空白纳米凝胶溶液（gs）、华法林和人参皂苷物理混合溶液（war+gs）及人参皂苷-华法林自组纳米凝胶溶液（war-gsnps）的细胞毒性实验结果对比图。

图4为不同时间下华法林溶液（war）、人参皂苷空白纳米凝胶溶液（gs）、华法林和人参皂苷物理混合溶液（war+gs）及人参皂苷-华法林自组纳米凝胶溶液（war-gsnps）的实验细胞迁移情况对比图。

图5为华法林溶液（war）、人参皂苷空白纳米凝胶溶液（gs）、华法林和人参皂苷物理混合溶液（war+gs）及人参皂苷-华法林自组纳米凝胶溶液（war-gsnps）的实验细胞迁移率计算结果对比图。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例1

称取5.0g人参总皂苷加入ph为1.8的醋酸水溶液，在90℃下反应4h，反应物于室温放置2h后，用0.45μm的滤膜过滤，去除杂质；滤液用10%的碳酸钠溶液ph至7.5，静置沉淀，减压抽滤收集沉淀物；沉淀物于无水乙醇中加热至60℃溶解后，在4℃放置2h，用滤膜过滤，收集滤液减压浓缩后，再将浓缩物投入无水乙醇中溶解，此后再于4℃下放置2h，用2μm滤膜过滤后滤液减压浓缩干燥即得人参皂苷纳米凝胶；取华法林和人参皂苷凝胶粉，加入二次水，使溶液中人参皂苷的终浓度为1~10mg/ml、华法林的浓度为1~10mg/ml，超声震荡15min，即得人参皂苷-华法林自主装纳米凝胶溶液。

实施例2人参皂苷-华法林纳米凝胶的表征

用动态光散射（dls）测定纳米凝胶的粒径（size，nm）和电势（zetapotential，mv），结果如图1所示。

由图1可见，本发明制备的纳米凝胶具有小的粒径和负的电势。

实施例3人参皂苷-华法林纳米凝胶结构的表征

用原子力显微镜（afm）测定纳米凝胶的三维结构，结果如图2所示。

由图2可见，本发明制备的人参皂-华法林呈线性结构。

实施例4人参皂苷-华法林纳米凝胶颗粒的药效学评估

细胞毒性实验：取对数生长期的人肺癌a549细胞用含edta的胰酶消化，用细胞计数仪计算细胞数，用培养基将细胞配制成0.7-1.0×10⁴/ml的细胞悬浮液。用100µl的排枪将细胞悬浮液加入到96孔板中，每孔的量为100µl，细胞个数大约为0.5-0.8×10⁴。将96孔板放入细胞间的培养箱培养过夜。预先用1640培养基配制不同浓度的华法林溶液（war）(10，20，50，100，200µg/ml)、人参皂苷空白纳米凝胶溶液（gs）(10，20，50，100，200µg/ml)、华法林和人参皂苷物理混合溶液（war+gs）(10，20，50，100，200µg/ml)和人参皂苷-华法林自组纳米凝胶溶液（war-gsnps）(10，20，50，100，200µg/ml)。用100µl的排枪将孔板里旧培养基吸出弃掉，按照每孔100µl的量将配好的含有药物的培养基加入到孔中，放入细胞间培养箱培养24h。母液mtt与无血清无酚红的1640培养基预先按照1:9的比例准备好，将96孔板里的培养基用100µl的排枪吸出弃掉，然后再用100µl的排枪将配好的mtt溶液加入孔中，将96孔板拿进细胞间的培养箱接着培养4h。将mtt溶液弃掉，用100µl的排枪给每孔加入100µl的dmso，将96孔板放在摇床上摇晃5-10min，使孔板里的紫色结晶完全溶解。在490nm处测量各孔吸光值(od值)，计算细胞的存活率，结果如图3。

由图3可见，人参皂苷-华法林自组纳米凝胶对人肺癌a549细胞的毒性大于单独人参皂苷、单独华法林用药及华法林和人参皂苷物理混合用药组，且随着剂量的增大，其对人肺癌a549细胞的毒性就越大。可见，人参皂苷-华法林自组纳米凝胶有利于提高人参皂苷和华法林对癌细胞的抑制作用。

实施例5人参皂苷-华法林纳米凝胶对癌细胞的迁移作用

体外测定人参皂苷-华法林自组装纳米凝胶溶液对人肺癌a549细胞迁移影响实验：取对数生长期的人肺癌a549细胞，用含edta的胰酶消化，配制成0.8-1.0×10⁶/ml的细胞悬浮液。取24孔板，吸取0.5ml的细胞悬浮液加入到孔板中，放入细胞间培养箱培养过夜。第二天细胞单层铺满孔板时，用10µl的小枪头在孔内长满细胞的1/4、2/4和3/4处横向或竖向划“一”字型划痕，用pbs清洗2-3次洗净划落下来的损伤细胞。用培养基配制华法林溶液（war）（50µg/ml）、人参皂苷溶液（gs）(50µg/ml)、华法林和人参皂苷物理混合溶液（war+gs）(50µg/ml、50µg/ml)和人参皂苷-华法林自组装纳米凝胶溶液（war-gsnps）(50µg/ml)，然后在相应的孔板里加入0.5ml含有药物的新鲜培养基，并在正置显微镜下选取不同的视野进行拍照，记录细胞在0h时划痕所在的位置，并计算划痕的宽度。将24孔板置于细胞间的培养箱接着培养24h，再次在之前记录的位置拍摄照片，计算细胞迁移的距离和迁移率，结果分别如图4和图5所示。

由图5可见，50µg/ml的人参皂苷-华法林自组装纳米凝胶（war-gsnps）处理的样品的细胞迁移率降至不足20%，可见人参皂苷-华法林自组装纳米凝胶在体外有明显的的抑制肿瘤细胞转移的效果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。