抑制脉络膜新生血管的药物及制备方法和药效检验方法与流程

本发明涉及一种药物及制备方法和药效检验方法，特别是涉及一种抑制脉络膜新生血管的药物及制备方法和药效检验方法，属于中药新型递药系统技术领域。

背景技术：

脉络膜新生血管是湿性年龄相关性黄斑变性的主要病理特征之一和重要的致盲因素。年龄相关性黄斑变性(amd)又称为老年性黄斑变性(smd)，是一种进展性变性疾病，累及双眼，表现为黄斑区非感染性损伤的眼底病变，是严重威胁老年人视功能的主要眼底病变之一。

amd在临床上分为萎缩型(又称干性)和渗出型(又称湿性)两种。湿性老年性黄斑变性，又称渗出性年龄相关性黄斑变性，或新生血管性年龄相关性黄斑变性，占所有amd的10-20％，但80-90％的amd严重视力障碍是由湿性amd导致，湿性amd黄斑区脉络膜新生血管(cnv)引起出血是视力丧失的主要原因。目前，amd的临床治疗主要采用玻璃体腔注射抗vegf药物抑制眼部新生血管形成，光动力疗法，瞳孔温热疗法等。这些方法普遍价格昂贵，操作复杂且病人顺应性差。

因此，寻找一种有效价廉且便于使用的amd治疗药物成为当前药物治疗amd的首要任务。

技术实现要素：

本发明的主要目的是为了针对目前临床上用于治疗amd的药物存在价格昂贵且病人顺应性差等不足，提供一种用于抑制脉络膜新生血管的药物及其眼部给药剂型的制备方法和药效检验方法，旨在更加安全有效地对amd进行干预治疗，从而达到改善amd患者的生活质量的目的。

本发明的目的可以通过采用如下技术方案达到：

一种用于抑制脉络膜新生血管的药物，按照质量百分比包括：磷脂19-57％、胆固醇5-25％、川芎嗪2-13％和蔗糖23-60％。

优选的，所述磷脂包括大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、dppc磷脂和dspc磷脂。

优选的，该药物按照质量百分比包括：磷脂38％、胆固醇10％、川芎嗪5％、蔗糖47％。

进一步的，一种如上述用于抑制脉络膜新生血管的药物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤(1)、将磷脂与胆固醇共溶于二氯甲烷中，减压旋蒸制得薄膜；

步骤(2)、加入硫酸铵溶液，溶解薄膜，孵育得空白脂质体溶液；

步骤(3)、将空白脂质体溶液装进行透析；

步骤(4)、将透析好的空白脂质体溶液与川芎嗪药液混合，孵育得川芎嗪脂质体溶液；

步骤(5)、将川芎嗪脂质体溶液进行透析，加入保护剂蔗糖，冷冻干燥得川芎嗪脂质体粉末。

优选的，所述步骤(1)中制得薄膜的方法为在温度30-65℃条件下减压旋转蒸发0.5-3h形成薄膜。

优选的，所述步骤(2)溶解薄膜后减小粒径的方法包括探头超声方法和高压均质方法，所述探头超声的方法为冰浴探针超声1-5min。

优选的，所述步骤(2)和步骤(4)中孵育的温度均为水浴，温度均为30-60℃。

优选的，所述步骤(5)透析过程中的透析介质为纯净水，透析时间为2-6h，所述步骤(3)透析过程中的透析介质为生理盐水、5％葡萄糖或10％蔗糖溶液。

优选的，所述步骤(3)和步骤(5)中的透析方法均为透析袋法、高速离心法或者葡聚糖凝胶柱法。

进一步的，一种上述用于抑制脉络膜新生血管的药物的药效检验方法，包括如下步骤：

步骤(6)、将该脂质体冻干粉末加水复溶后，通过微孔滤膜对实验动物的眼部给药；

步骤(7)、给药后对眼部刺激性进行评价以及监测该药物对532nm激光所致的实验动物脉络膜新生血管的药效；

所述给药后对眼部刺激性进行评价的过程如下：准备健康实验兔若干只，所有动物选择一只眼滴川芎嗪脂质体溶液，另一只眼滴生理盐水作为对照组，然后通过肉眼观察进行driaze评分、病理切片、酶联免疫吸附法测定角膜和房水炎症因子il-1β和tnf-α含量来评价川芎嗪眼用脂质体的安全性；

所述监测该药物对532nm激光所致的实验动物脉络膜新生血管的药效过程如下：

步骤(7.1)、分组：准备spf级雄性sd实验鼠若干只，随机分为4组，所述4组分类分别为生理盐水对照组、川芎嗪原料药组、川芎嗪脂质体组和正常对照组；

步骤(7.2)、制备模型：实验前对所有实验鼠均进行眼部检查，确保双眼前节和眼底均未见异常；给予适应性喂养至少1周后，将正常对照组作为空白对照，其它三组实验鼠进行532nm激光造模；

步骤(7.3)、判断造模成功与否：造模两周后，通过光学相关断层扫描和病理切片判断模型是否成功，若见有新生的毛细血管则表示模型成功；

步骤(7.4)、检测实验鼠脉络膜相关蛋白的表达：造模成功后，滴眼给药至少两周，然后对对实验鼠眼睛进行光学相干断层扫描以及病理切片，免疫荧光检测实验鼠脉络膜cd31蛋白的表达，免疫组化检测实验鼠脉络膜vegf蛋白的表达；

步骤(7.5)、对比实验结果以及分析实验数据。

本发明的有益技术效果：

(1)、本发明提供的抑制脉络膜新生血管的药物，根据脉络膜新生血管的生成机制，基于中药川芎嗪的活血功效和药理作用，且由于川芎嗪普通制剂如注射剂和片剂等到达眼底的有效药量少，借助脂质材料的生物相容性，构建一种融合现代纳米技术和传统中医药理论的新型高效的中药眼部脂质体递药系统，有助于延长药物释放时间，提高其靶向性及生物利用度。

(2)、本发明提供的抑制脉络膜新生血管的药物与现有技术相比，中医认为amd属于眼科血证，根据病程不同治以宁血活血通络和行气活血化疲等；中药川芎药用效果主要包括行气与活血两方面，川芎嗪为川芎中提取的生物碱，是川芎的有效成分之一，具有相同功效，其临床上主要用于治疗缺血性心脑血管等多系统疾病，基于中医对amd的认识，将川芎嗪作为治疗amd的药物。

(3)、本发明提供的抑制脉络膜新生血管的药物，将川芎嗪制备成脂质体滴眼液，改善传统给药方式即玻璃体腔注射药物导致病人顺应性差的问题，而且脂质体具有极好的生物相容性、高渗透性、能延长药物的眼部滞留时间，提高药物的生物利用度等优点。

附图说明

图1为按照本发明的抑制脉络膜新生血管的药物及制备方法和药效检验方法的一优选实施例的川芎嗪脂质体冻干粉末的透射电镜图；

图2为按照本发明的抑制脉络膜新生血管的药物及制备方法和药效检验方法的一优选实施例的川芎嗪脂质体冻干粉末的粒径分布图；

图3为按照本发明的抑制脉络膜新生血管的药物及制备方法和药效检验方法的一优选实施例的川芎嗪脂质体的dsc图；

图4为按照本发明的抑制脉络膜新生血管的药物及制备方法和药效检验方法的一优选实施例的川芎嗪脂质体的xrd图；

图5为按照本发明的抑制脉络膜新生血管的药物及制备方法和药效检验方法的一优选实施例的病理切片染色的制剂组角膜和生理盐水组角膜对照图；

图6为按照本发明的抑制脉络膜新生血管的药物及制备方法和药效检验方法的一优选实施例的炎症因子含量的制剂组和生理盐水组对照图；

图7为按照本发明的抑制脉络膜新生血管的药物及制备方法和药效检验方法的一优选实施例的532nm激光造模2周后的oct图；

图8为按照本发明的抑制脉络膜新生血管的药物及制备方法和药效检验方法的一优选实施例的532nm激光造模2周后病理切片；

图9为按照本发明的抑制脉络膜新生血管的药物及制备方法和药效检验方法的一优选实施例的给药前和给药14天后的oct图的对照图；

图10为按照本发明的抑制脉络膜新生血管的药物及制备方法和药效检验方法的一优选实施例的给药2周后四组病理切片的对照图；

图11为按照本发明的抑制脉络膜新生血管的药物及制备方法和药效检验方法的一优选实施例的四组cd31免疫荧光图的对照图；

图12为按照本发明的抑制脉络膜新生血管的药物及制备方法和药效检验方法的一优选实施例的cd31免疫荧光平均光密度值的示意图；

图13为按照本发明的抑制脉络膜新生血管的药物及制备方法和药效检验方法的一优选实施例的四组vegf免疫组化图的对照图；

图14为按照本发明的抑制脉络膜新生血管的药物及制备方法和药效检验方法的一优选实施例的四组vegf免疫组化平均光密度值的示意图。

具体实施方式

为使本领域技术人员更加清楚和明确本发明的技术方案，下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

本实施例提供的抑制脉络膜新生血管的药物及制备方法，包括：大豆卵磷脂120mg、胆固醇30mg、川芎嗪15mg和蔗糖150mg，采用主动载药法中的硫酸铵梯度法制备川芎嗪脂质体，称取大豆卵磷脂120mg、胆固醇30mg溶于6ml二氯甲烷中，45℃减压旋转蒸发1h形成薄膜，加入0.2mol/l的硫酸铵溶液8ml，超声溶解，冰浴条件下探头超声2min以使粒径分布均匀，45℃水浴孵育20min，将空白脂质体放入分子量为3500的透析袋中，透析介质为100倍体积的生理盐水，透析24h，定时更换透析介质，取出空白脂质体溶液，将15mg川芎嗪溶于pbs液中，与空白脂质体混合，于45℃水浴孵育20min即得川芎嗪脂质体。

将川芎嗪脂质体溶液装入已处理好的透析袋中，以100倍体积的纯水为透析介质透析4h，以除去未包封的川芎嗪游离药物，收集透析袋中的川芎嗪脂质体溶液，在川芎嗪脂质体溶液中加入150mg冻干保护剂蔗糖，真空冷冻干燥24h得到川芎嗪脂质体冻干粉末。

实施例2

与实施例1不同的是，本实施例提供的抑制脉络膜新生血管的药物及制备方法，包括：大豆卵磷脂120mg、胆固醇30mg、川芎嗪20mg和蔗糖150mg，采用主动载药法中的硫酸铵梯度法制备川芎嗪脂质体，称取大豆卵磷脂120mg、胆固醇30mg溶于6ml二氯甲烷中，45℃减压旋转蒸发1h形成薄膜，加入0.2mol/l的硫酸铵溶液8ml，超声溶解，冰浴条件下探头超声2min以使粒径分布均匀，37℃水浴孵育20min，将空白脂质体放入分子量为3500的透析袋中，透析介质为100倍体积的生理盐水，透析24h，定时更换透析介质，取出空白脂质体溶液，将20mg川芎嗪溶于pbs液中，与空白脂质体混合，于45℃水浴孵育20min即得川芎嗪脂质体。

将川芎嗪脂质体溶液装入已处理好的透析袋中，以100倍体积的纯水为透析介质透析4h，以除去未包封的川芎嗪游离药物，收集透析袋中的川芎嗪脂质体溶液，在川芎嗪脂质体溶液中加入150mg冻干保护剂，真空冷冻干燥24h得到川芎嗪脂质体冻干粉末。

实施例3

与实施例1和实施例2不同的是，本实施例提供的抑制脉络膜新生血管的药物及制备方法，包括：天然磷脂120mg、胆固醇60mg、川芎嗪18mg和蔗糖180mg，采用主动载药法中的硫酸铵梯度法制备川芎嗪脂质体，称取天然磷脂120mg、胆固醇60mg溶于6ml二氯甲烷中，45℃减压旋转蒸发1h形成薄膜，加入0.3mol/l的硫酸铵溶液8ml，超声溶解，冰浴条件下探头超声2min以使粒径分布均匀，37℃水浴孵育20min，将空白脂质体放入分子量为3500的透析袋中，透析介质为100倍体积的生理盐水，透析24h，定时更换透析介质，取出空白脂质体溶液，将18mg川芎嗪溶于pbs液中，与空白脂质体混合，于37℃水浴孵育20min即得川芎嗪脂质体。

将川芎嗪脂质体溶液装入已处理好的透析袋中，以100倍体积的纯水为透析介质透析4h，以除去未包封的川芎嗪游离药物，收集透析袋中的川芎嗪脂质体溶液，在川芎嗪脂质体溶液中加入180mg冻干保护剂，真空冷冻干燥24h得到川芎嗪脂质体冻干粉末。

在上述实施例中，可以将大豆卵磷脂换成蛋黄卵磷脂、dppc、dspc等磷脂材料，溶解薄膜的方法可以将探头超声方法换成高压均质方法，透析空白脂质体时可以将透析介质生理盐水换成5％葡萄糖或者10％蔗糖溶液，透析川芎嗪脂质体溶液过程中除去未包封的游离川芎嗪药物采用的透析袋法可以换成高速离心法或者葡聚糖凝胶柱法。

如图1-图4所示，综上述实施例的结果分析，结果如下：

在上述实施例中，如图1和图2所示，通过透射电镜观察川芎嗪脂质体的形态，发现脂质体成规则的球形，表面光滑，且粒径较小，分布较窄。

采用透析法测定川芎嗪脂质体溶液的包封率(ee％)，结果为56.2％；

ee％＝脂质体中药物质量/投药总质量×100％

上述实施例中ee(％)、pdi及纳米粒径(nm)的变化情况如下表：

表1：各实施例与对比例的ee(％)、pdi及纳米粒径(nm)的变化情况

由表1可知，与其它实施例相比，实施例1具有较高的包封率和较小的粒径，分布也比较窄。

在上述实施例中，如图3所示，川芎嗪脂质体冻干粉末1和物理混合物的曲线3有明显不同，物理混合物为川芎嗪和空白脂质体冻干粉末的简单叠加，在90.7℃处出现了川芎嗪的特征峰，在290.6℃处为空白脂质体的峰，而川芎嗪脂质体在300.7℃处出峰，川芎嗪特征峰已消失，且川芎嗪脂质体峰与空白脂质体稍有不同，表明川芎嗪包封于脂质体中。

在上述实施例中，如图4所示，物理混合物3在10°左右出现了川芎嗪原料药1的特征峰，说明物理混合物只是空白脂质体和药物的简单叠加，川芎嗪脂质体2与物理混合物3相比10°-20°之间的衍射峰变宽变高，说明药物包封于脂质体后性质发生变化，证明川芎嗪脂质体制备成功。此结果与dsc的结果一致。

进一步的，在上述实施例中制得的抑制脉络膜新生血管的药物，需要对其用于眼部刺激性做出评价，首先将上述实施例中制得的川芎嗪脂质体冻干粉末加少量水复溶后，将脂质体冻干粉末复溶后过0.22μm的微孔滤膜用于眼部刺激性评价，具体操作如下，健康新西兰白兔6只，所有动物选择右眼滴川芎嗪脂质体溶液，左眼滴生理盐水作为对照组，每日给药3次，每次50μl，滴眼后使兔眼闭合10s，连续给药7天。通过肉眼观察进行driaze评分、病理切片、酶联免疫吸附法(enzymelinkedimmunosorbentassay，elisa)测定角膜和房水炎症因子il-1β和tnf-α含量等方式来评价川芎嗪眼用脂质体的安全性。

滴眼后7天，通过肉眼观察，川芎嗪脂质体组与生理盐水组相比，眼部未见红肿现象，角膜澄清，结膜未见充血。根据表2刺激性draize评分标准，川芎嗪脂质体组总分为2分，结果表明，川芎嗪脂质体多次给药对兔眼无刺激。

表2眼刺激性实验评分标准

由图5可知，左图1为病理切片染色制剂组角膜图，右图2为生理盐水组角膜图，病理切片结果显示，川芎嗪脂质体组和生理盐水组两组角膜上皮细胞连续，基质层纤维排列规则，均未见炎性细胞。角膜上皮、前界膜层、角膜基质、后界层和角膜内皮细胞结构完整，细胞排列整齐，各层细胞分界清晰。表明川芎嗪脂质体对角膜没有刺激性。

由图6可知，图中1为炎症因子含量制剂组图，图中2为生理盐水组，与生理盐水组相比，川芎嗪脂质体组角膜和房水的炎症因子il-1β和tnf-α含量未见有显著性差异(p>0.05)，表明川芎嗪脂质体组对兔眼不会造成炎症反应，由此可说明川芎嗪脂质体的安全性较好。

综上所述，川芎嗪脂质体用于眼部应用刺激性较小，安全性较好。

将以上制得的川芎嗪脂质体冻干粉末加少量水复溶后，将脂质体冻干粉末复溶后过0.22μm的微孔滤膜用于眼部给药。考察其对532nm激光所致的大鼠脉络膜新生血管的药效。具体操作如下：

spf级雄性sd大鼠24只，随机分为4组，每组6只，分别为生理盐水对照组，川芎嗪原料药组，川芎嗪脂质体组，正常对照组。模型制备的过程为：实验前所有大鼠均进行眼部检查，双眼前节和眼底均未见异常。给予适应性喂养1周后，将大鼠随机分为4组，其中一组作为空白对照，其它老鼠进行532nm激光造模。先以10％水合氯醛(3.5ml/kg)于大鼠腹腔内注射麻醉，以复方托吡卡胺滴眼液滴双眼扩瞳，应用532nm激光仪经裂隙灯显微镜在全视网膜镜下围绕视盘等距离于2支视网膜血管之间进行光凝，光斑直径50μm，激光能量320mw，时间0.12s，以光凝后有气泡产生或轻度出血为准。

造模两周后，通过光学相关断层扫描(oct)和病理切片判断模型是否成功，如图7为oct所示视网膜神经上皮层增厚，rpe复合层不连续，局部增厚，反射增强，界限不清；图8为病理切片结果显示脉络膜组织结构紊乱，散在炎性细胞浸润及纤维细胞增生，见有新生的毛细血管则表示模型成功，模型成功后连续滴眼给药两周，3次/日，1次50μl。给药两周后，对大鼠眼睛进行光学相干断层扫描，然后处死大鼠，摘取眼球于4％多聚甲醛中固定，进行病理切片，免疫荧光检测大鼠脉络膜cd31蛋白的表达，免疫组化检测大鼠脉络膜vegf蛋白的表达。

oct结果如图9显示，与造模两周后，川芎嗪脂质体组大鼠眼球的病灶区域明显有所减少。切片的结果如图10显示：从1组-四组分别为：1-正常组；2-生理盐水组；3-川芎嗪药物组；4-川芎嗪脂质体组，川芎嗪脂质体组共六个样本，除了一只右眼脉络膜细胞层排列紊乱，散在右炎性细胞浸润同时见有新生的毛细血管。其余样本组织细胞排列整齐，未见有明显组织病理学损伤改变。而造模组六个样本除了一只左眼组织结构正常，未见明显的组织病理学损伤改变。其余样本均见有脉络膜组织结构紊乱，散在炎性细胞浸润及纤维细胞增生，见有新生的毛细血管。

免疫荧光检测大鼠脉络膜cd31蛋白的表达，由图11和12所示，图11中1-4分别为1-生理盐水组、2-川芎嗪药物组、3-川芎嗪脂质体组、4-正常组，图12中1-4分别是1-生理盐水组、2-川芎嗪药物组、3-川芎嗪脂质体组、4-正常组，给药14天后，生理盐水组cd31绿色荧光阳性表达明显，川芎嗪脂质体组和川芎嗪药物组的cd31阳性表达低于生理盐水组。imagej软件分析可知：川芎嗪脂质体组和川芎嗪药物组的cd31蛋白着色平均光密度值mod均低于生理盐水组，但川芎嗪脂质体组的cd31蛋白着色平均光密度值明显低于生理盐水组(p<0.05)。

免疫组化检测大鼠脉络膜vegf蛋白的表达，由图13和14所示，图13中1-4分别是1-生理盐水组、2-川芎嗪药物组、3-川芎嗪脂质体组、4-正常组，图14中1-4分别是1-生理盐水组、2-川芎嗪药物组、3-川芎嗪脂质体组、4-正常组，给药14天后，生理盐水组vegf棕黄色阳性表达明显，高于川芎嗪脂质体组和川芎嗪药物组。imageproplus6.0软件分析可知：川芎嗪脂质体组和川芎嗪药物组的vegf蛋白着色平均光密度值mod均低于生理盐水组，但川芎嗪脂质体组的vegf蛋白着色平均光密度值明显低于生理盐水组(p<0.05)。

综上，上述实施例提供的抑制脉络膜新生血管的药物及制备方法和药效检验方法，根据脉络膜新生血管的生成机制，基于中药川芎嗪的活血功效和药理作用，且由于川芎嗪普通制剂如注射剂和片剂等到达眼底的有效药量少，于是借助脂质材料的生物相容性，构建一种融合现代纳米技术和传统中医药理论的新型高效的中药眼部脂质体递药系统，有助于延长药物释放时间，提高其靶向性及生物利用度。

以上所述，仅为本发明进一步的实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明所公开的范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都属于本发明的保护范围。