一种酸响应型Fe3O4-RGO-MTX纳米药物及其制备方法和应用与流程

本发明属于材料制备及纳米医药技术领域，具体涉及一种酸响应型fe3o4-rgo-mtx纳米药物及其制备方法和应用。

背景技术：

肿瘤是威胁人类生命健康的世界性问题，临床上针对恶性肿瘤的非手术治疗包括放疗和化疗等，均以杀死肿瘤细胞为目的，其最大的不足就是缺乏针对肿瘤细胞的特异性。

甲氨蝶呤(mtx)是众所周知的抗肿瘤药物之一，可治疗肝癌，乳腺癌，皮肤癌，肺癌和其它恶性肿瘤。遗憾的是，相比于流入率，mtx的血浆半衰期非常短且流出率高，治疗时需要使用高剂量的mtx。并且，实际施加到生物体上的药物剂量并没有完全达到肿瘤部位，而是遍布全身，从而对身体其他正常组织造成了毒副作用，这使其在其临床应用上受到了许多限制。将抗肿瘤药物通过纳米载体递送至病灶部位，根据外界环境的某种刺激敏感信号的性质、强弱等调整药物释放可达到局部病变局部治疗的目的。在治疗的同时也能有效地降低药物使用剂量、照射剂量和减轻药物的毒副作用，提高治疗增益比，减轻患者的痛苦与经济负担。

通过对现有文献探索发现，许多类型的mtx递送载体已被报道，如纳米颗粒，脂质体，微球，聚合物胶束和其他多颗粒系统。在这些递送载体中，纳米颗粒，特别是，磁性氧化铁(fe3o4)纳米颗粒似乎是一种很有前途的用于靶向特异性药物递送载体，能够通过外磁场的作用将抗癌药物输送到病灶部位，提升药物的实际使用效率。但是也存在一些问题，比如fe3o4纳米颗粒与药物的生物相容性和载药量均表现不佳，药物的释放很难控制，造成一定的毒副作用。

鉴于此，提出本发明。

技术实现要素：

针对现有技术中mtx纳米药物的疗效和生物利用度较低的不足，本发明的目的在于提供一种酸响应型fe3o4-rgo-mtx纳米药物及其制备方法和应用。本发明通过调节铁源与rgo的比例，反应温度等因素，调节目标产物的结构，通过调节pei(聚乙酰亚胺)的加入量来改善材料生物相亲性及载药性能，从而为用于甲氨蝶呤递送的酸响应型fe3o4-rgo-mtx纳米药物的制备和应用提供新的实验技术路线。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种酸响应型fe3o4-rgo-mtx纳米药物，包括fe3o4-rgo载体和甲氨蝶呤，所述甲氨蝶呤负载在fe3o4纳米粒子表面及rgo片层上。

优选地，所述fe3o4-rgo载体的载药率为84％～99％，载药量为13％～23％。

本发明的另一个目的在于提供所述的一种酸响应型fe3o4-rgo-mtx纳米药物的制备方法，包括如下步骤：

(1)将fecl3·6h2o、rgo和醋酸钠溶于乙二醇中，超声搅拌分散均匀，然后加入pei，超声搅拌，得到均匀分散的反应液；

(2)将上述反应液进行水热反应，所得产物提纯洗涤、真空干燥后得到fe3o4-rgo纳米粒子；

(3)将上述fe3o4-rgo纳米粒子与甲氨蝶呤在水中超声分散均匀后，进行避光反应至反应完全，所得产物经提纯洗涤、冷冻干燥后，得到fe3o4-rgo-mtx纳米药物。

优选地，步骤(1)中所述fecl3·6h2o、rgo和pei的加入量以质量比计为1.08:1-5:1-1.5。

优选地，步骤(3)中所述fe3o4-rgo纳米粒子与甲氨蝶呤的质量比为5-2:1。

优选地，步骤(2)中所述水热反应在180-200℃下反应8-10h；所述真空干燥的温度为25-35℃。

优选地，步骤(3)中所述避光反应的温度为25-35℃。

优选地，步骤(1)和步骤(3)中所述超声的时间为10-20min。

优选地，步骤(2)和步骤(3)中所述提纯洗涤为采用磁倾析法。

本发明还提供了一种所述的fe3o4-rgo-mtx纳米药物在抗肿瘤治疗中的应用。

本发明的有益效果：

(1)本发明中fe3o4与rgo通过一步水热法形成纳米粒子，用于mtx药物的载体，能够赋予靶向药物的磁性能，使得合成的fe3o4-rgo-mtx纳米药物可以在外界磁场的作用下直接到达病灶部位，使得所负载的mtx药物在病灶部位富集，避免了抗癌药物对正常组织的伤害；其次rgo相比于其他的材料，具有薄纱状的结构使得其边缘更长，更易于被掺杂以及化学改性，更易于接受功能团，制备fe3o4-rgo纳米粒子的过程中加入pei，其结构中的氨基离子的植入可使rgo材料表面接枝大量的阳离子活性功能团，大量的氨基赋予了mtx更多的结合位点，便于mtx通过静电作用负载到fe3o4-rgo上，利于抗癌药物的负载，进而有效提高药物的负载量。因此，本发明制备的fe3o4-rgo-mtx纳米药物具有磁靶向作用的同时提高了载体的生物相亲性，并且载体的磁响应性及生物相亲性均可控。

(2)本发明所制备的fe3o4-rgo-mtx纳米药物，主要通过酸响应的形式释放药物，充分结合了肿瘤组织的特点(肿瘤组织的微环境ph<6.0)，使得经静电负载的mtx在酸性条件下有效释放，并在较长时间内维持一个相对较大的药物剂量，以有效杀死肿瘤细胞，且不伤害正常组织细胞，提高疗效和生物利用度。

(3)本发明在fe3o4-rgo纳米粒子上负载mtx时，反应条件温和，相对于现有技术中的在高温条件下负载mtx药物的方法，本发明极大程度地保护了mtx的药物活性，有利于生物利用度的提高。

(4)本发明中的rgo特有的单原子厚度和二维平面结构既能够大大地提高抗癌药物mtx的载药量，又可以提高mtx药物的缓释效果。

附图说明

图1为本发明实施例1中所得的fe3o4-rgo纳米粒子的透射电镜图。

图2为本发明实施例1制备的fe3o4-rgo-mtx纳米药物在不同ph环境下的药物释放对比图。

图3为本发明实施例7中fe3o4-rgo纳米粒子(a)、mtx(b)及fe3o4-rgo-mtx纳米药物(c)对hepg2的细胞毒性评价结果图。

具体实施方式

下面将结合附图和具体实施例做进一步地说明。

一、fe3o4-rgo-mtx纳米药物的制备:

制备得到的fe3o4-rgo-mtx纳米药物的载药率和载药量为通过紫外分光光度法测得，计算公式如下：

载药率＝(成功负载到载体上的mtx的量/总的mtx的量)×100％；

载药量＝(成功负载到载体上的mtx的量/fe3o4-rgo-mtx纳米药物的量)×100％。

实施例1

依次称取1.08gfecl3·6h2o、3.0g醋酸钠和1.0gpei，量取40ml乙二醇，置于50ml烧杯，超声搅拌20min使体系分散均匀，再加入称取好的1.0grgo，继续超声搅拌10min，得到分散均一的混合液体。将均一的混合液体转入100ml聚四氟乙烯反应釜中，200℃反应10h。反应结束后倒出产物，磁倾析法提取产物，3次去离子水洗，3次乙醇洗。最后，将产品放入30℃的真空烘箱中烘干，得到干燥的fe3o4-rgo纳米粒子。

依次称取60mg干燥的fe3o4-rgo纳米粒子、12mgmtx和量取20ml去离子水置于烧杯中，超声8min使体系分散均匀。然后转入三颈烧瓶中，25℃下避光反应24h。反应结束后倒出产物，磁倾析法提取产物，用去离子水多次洗涤。最后，经冷冻干燥后得到的粉末状产品为fe3o4-rgo-mtx纳米药物。

该实施例制备的fe3o4-rgo纳米粒子的透射电镜图如图1所示，可以看出，fe3o4纳米粒子负载在透明纱状的rgo片层上，且fe3o4纳米粒子大小均一，分散性佳。

通过紫外分光光度法测得载药率为90.5％，载药量为15.3％。

实施例2

依次称取1.08gfecl3·6h2o、3.0g醋酸钠和1.0gpei，量取40ml乙二醇，置于50ml烧杯中，超声搅拌20min使体系分散均匀，再加入称取好的2.0grgo，继续超声搅拌10min，得到分散均一的混合液体。将上述均一的混合液体转入100ml聚四氟乙烯反应釜中，200℃反应10h。反应结束后倒出产物，磁倾析法提取产物，3次去离子水洗，3次乙醇洗。最后，将产物放入30℃的真空烘箱中烘干，得到干燥的fe3o4-rgo纳米粒子。

依次称取60mg干燥的fe3o4-rgo纳米粒子、20mgmtx和量取20ml去离子水置于烧杯中，超声8min使体系分散均匀。然后转入三颈烧瓶中，25℃下避光反应24h。反应结束后倒出产物，磁倾析法提取产物，用去离子水多次洗涤。最后，经冷冻干燥后得到的粉末状产品为fe3o4-rgo-mtx纳米药物。

通过紫外分光光度法测得载药率为98.8％，载药量为24.7％。

实施例3

依次称取1.08gfecl3·6h2o、3.0g醋酸钠和0.5gpei，量取40ml乙二醇，置于50ml烧杯中，超声搅拌20min使体系分散均匀，再加入称取好的1.0grgo，继续超声搅拌10min，得到分散均一的混合液体。将上述均一的混合液体转入100ml聚四氟乙烯反应釜中，190℃反应8h。反应结束后倒出产物，磁倾析法提取产物，3次去离子水洗，3次乙醇洗。最后，将产物放入30℃的真空烘箱中烘干，得到干燥的fe3o4-rgo纳米粒子。

依次称取60mg干燥的fe3o4-rgo、12mgmtx和量取20ml去离子水置于烧杯中，超声8min使体系分散均匀。然后转入三颈烧瓶中，25℃下避光反应24h。反应结束后倒出产物，磁倾析法提取产物，用去离子水多次洗涤。最后，经冷冻干燥后得到的粉末状产品为fe3o4-rgo-mtx纳米药物。

通过紫外分光光度法测得载药率为86.3％，载药量为14.7％。

实施例4

依次称取1.08gfecl3·6h2o、3.0g醋酸钠和1.0gpei，量取40ml乙二醇，置于50ml烧杯中，超声搅拌20min使体系分散均匀，再加入称取好的3.0grgo，继续超声搅拌10min，得到分散均一的混合液体。将上述均一的混合液体转入100ml聚四氟乙烯反应釜中，200℃反应10h。反应结束后倒出产物，磁倾析法提取产物，3次去离子水洗，3次乙醇洗。最后，将产物放入30℃的真空烘箱中烘干，得到干燥的fe3o4-rgo纳米粒子。

依次称取60mg干燥的fe3o4-rgo、18mgmtx和量取20ml去离子水置于烧杯中，超声8min使体系分散均匀。然后转入三颈烧瓶中，25℃下避光反应24h。反应结束后倒出产物，磁倾析法提取产物，用去离子水多次洗涤。最后，经冷冻干燥后得到的粉末状产品为fe3o4-rgo-mtx纳米药物。

通过紫外分光光度法测得载药率为97.3％，载药量为24.8％。

实施例5

依次称取1.08gfecl3·6h2o、3.0g醋酸钠和1.5gpei，量取40ml乙二醇，置于50ml烧杯中，超声搅拌20min使体系分散均匀，再加入称取好的5.0grgo，继续超声搅拌10min，得到分散均一的混合液体。将上述均一的混合液体转入100ml聚四氟乙烯反应釜中，190℃反应8h。反应结束后倒出产物，磁倾析法提取产物，3次去离子水洗，3次乙醇洗。最后，将产品放入30℃的真空烘箱中烘干，得到干燥的fe3o4-rgo纳米粒子。

依次称取60mg干燥的fe3o4-rgo、30mgmtx和量取20ml去离子水置于烧杯中，超声8min使体系分散均匀。然后转入三颈烧瓶中，25℃下避光反应24h。反应结束后倒出产物，磁倾析法提取产物，用去离子水多次洗涤。最后，经冷冻干燥后得到的粉末状产品为fe3o4-rgo-mtx纳米药物。

通过紫外分光光度法测得载药率为84.3％，载药量为29.6％。

二、fe3o4-rgo-mtx纳米药物的释药性能实验

实施例6

将实施例1制得的fe3o4-rgo-mtx纳米药物分别置于ph为4.0、5.8和7.4的磷酸盐缓冲液中，于37℃恒温振荡箱中释放，每隔一定时间(0-12h为每隔1h取样一次，然后分别在24h和48h时取样)取出3ml缓冲液进行紫外分光光度法测定fe3o4-rgo-mtx的释药量，并同时补给等量的新鲜缓冲液。

在不同ph条件下，fe3o4-rgo-mtx纳米药物的释药率随时间的变化曲线图如图2所示，可以看出，fe3o4-rgo-mtx纳米药物有着明显的药物缓释效果，缓释曲线平稳，没有突释的现象出现，并且在酸性条件下释药速率加快且释放率高；fe3o4-rgo-mtx纳米药物在0-10h的释药速度较快，可能是吸附在fe3o4纳米粒子表面的mtx的释放，10h以后，释药速度变得缓慢，此时可能是吸附在rgo片层间的mtx的释放，可见，rgo对药物的缓释作用有较好的效果；当ph＝4.0时，48h内mtx的释放率达83.2％，表明fe3o4-rgo-mtx对酸性的肿瘤组织有较好的靶向释药功能。

三、fe3o4-rgo-mtx纳米药物的细胞毒性评价

实施例7

采用mtt法，将生长状态良好的人体乳腺癌细胞(hepg2)接种于96孔板中，37℃，5％co2的恒温培养箱中培养24h后加入一系列浓度(20、60、100、140μg/ml)的fe3o4-rgo纳米粒子、mtx及fe3o4-rgo-mtx纳米药物样品，继续培养24h后每孔加入20μlmtt溶液，恒温培养箱中放置4h，用酶标仪测定96孔板上各孔细胞液的吸光度(od)，细胞成活率按照以下公式算得：

细胞成活率＝(od样品/od对照)×100％；

其中，od样品：为加入各浓度样品的细胞液的吸光度；

od对照：为空白培养液的吸光度。

每个样品设置3个平行样，细胞存活率如图3所示，说明载体fe3o4-rgo纳米粒子对细胞几乎没有毒副作用，且fe3o4-rgo-mtx纳米药物相比于mtx在对肿瘤细胞的抑制效果上有明显的增强。