本发明涉及一种药物制剂配方及其制备，特别涉及一种重组人尿激酶原组合物及其制备方法。
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：尿激酶原(prourokinase，简称pro-uk)是一类丝氨酸蛋白酶，可以激活体内的纤溶酶原转变成有活性的纤溶酶，从而溶解血栓中的纤维蛋白，因此在溶血栓的治疗方面有着广泛的应用。pro-uk中lys158-ile159间肽键容易被纤溶酶及其他一些酶类水解，生成尿激酶(urokinase,简称uk)。uk由a链和b链两条肽链组成，靠链间二硫键连接。和uk相比，pro-uk和纤维蛋白的亲和力较高，激活纤溶系统的部位常在血栓形成的部位，因而引起全身出血倾向的副作用要比尿激酶小，是一种更优越的纤溶酶原激活剂。pro-uk还具有使用剂量小、使用安全、溶栓效果好、再栓率低、无过敏反应等优点，是一种安全无毒的、理想的生物类溶栓制剂，具有广阔的市场前景。pro-uk制剂不稳定，原因是容易被多种蛋白酶切割为尿激酶，同时，在液体状态下，即使低温保存也会自动分解(cn1730098a的
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部分)另外，为了增加稳定性，通常需要采用干燥方法稳定其活性防止降解。基于以上原因，对尿激酶原进行了修饰，如现有的pro-uk的制剂处方如专利cn1730098a(申请号为200410058006.0)中所述，由重组人尿激酶原、赋形剂、缓冲溶液和盐类组成，还可包括浓度为1.5‰-7.5‰(重量/体积比)的人血白蛋白作为保护剂，赋形剂是糖类和/或多元醇，选自甘露醇、蔗糖、海藻糖、乳糖、葡萄糖、山梨醇、麦芽糖中的一种或几种，缓冲溶液是磷酸盐缓冲液或tris-hcl缓冲液。盐类是浓度为0.03-0.20mol/l的氯化钠。然而，该制剂中存在一定量的人血白蛋白作为产品保护剂，原料较为特殊，存在三方面的制约因素，一是其来源于人血，存在病毒安全性风险；二是其原料供给存在较大的问题，市场上经常出现供不应求的局面，带来一定的采购风险；三是蛋白在储存过程中发挥发生蛋白聚集、脱酰胺化、非酶褐变、氧化反应和水解作用，其存在于处方中对成品较低的共晶点存在贡献(低共晶点使得产品冻干后的外观较差)。另外，生物制品的冻干过程是多步骤过程，会产生低温冻结脱水等多种效应；即使在成功完成冻干后，在长期储存过程中，也很难保证冻干活性组分的变性。为了防止生物制品在冷冻干燥和储存过程的活性成分发生变性，在液体处方中添加保护剂是必不可少的步骤。为了解决上述问题，发明人在上述专利的基础上做了改进。基本方案：用稳定性更强的缓冲体系：柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液体系或琥珀酸缓冲体系替代原处方中的磷酸盐缓冲体系，以无病毒污染风险的蔗糖或者海藻糖及吐温80作为保护剂，替代原来处方中的人血白蛋白，使用甘露醇或者甘氨酸作为赋形剂。技术实现要素：本发明是在现有技术的基础上做的改进发明。本发明提供的一种含有重组人尿激酶原的组合物，该组合物由重组人尿激酶原、赋形剂、保护剂和溶剂制备而成，其中保护剂为吐温80和蔗糖，或吐温80和海藻糖，其中，吐温80和蔗糖或海藻糖的重量比例为1-3：50-150，优选2:100。本发明所述组合物的由以下重量份的组分制备而成：重组人尿激酶原1.5-5.5份、赋形剂1-5份、保护剂0.5-1.6份，用溶剂溶解至100份，调节ph值至4.0-6.0。优选地，本发明所述组合物的由以下重量份的组分制备而成：重组人尿激酶原3-5份、甘露醇3-5份、保护剂0.5-1.6份，用溶剂溶解至100份，调节ph值至5.0-6.0。或本发明所述组合物的由以下重量份的组分制备而成：重组人尿激酶原3-5份、甘氨酸1-3份、保护剂0.5-1.6份，用溶剂溶解至100份，调节ph值至5.0-6.0。进一步优选，本发明所述组合物的由以下重量份的组分制备而成：重组人尿激酶原5mg、甘露醇4mg或甘氨酸2mg、蔗糖或海藻糖1mg、吐温800.02mg，用缓冲液溶解至100ml，调节ph值至4.0-6.0。上述组合物中，虽然在配比中限定了用量，但是不应以上述内容限定本发明的保护范围，本领域技术人员可以根据需要对上述单位进行调整，比如调整为g、kg、l等。所述溶剂为缓冲液或缓冲液与注射用水的组合，当溶剂为缓冲液和注射用水的组合时，溶剂缓冲液与注射用水的重量比为10-100：90-0，优选为20-80：80-20，如果组合物中加入的溶剂为缓冲液和注射用水的组合时，需要调节ph值至4.0-6.0。所用缓冲液为柠檬酸盐缓冲液或琥珀酸盐缓冲液，浓度为18-25mm、ph为5.0～6.0，优选浓度为20mm；所述赋形剂为甘露醇或甘氨酸；本发明还提供了上述组合物的制备方法，该方法包括以下步骤：按照配比称取各成分，然后将重组人尿激酶原、赋形剂、保护剂混匀，溶于溶剂中，总体积为100ml，调节ph4.0-6.0，然后冷冻干燥，即得。冷冻干燥方法为现有技术常规方法，或采用200410058006.0的方法。本申请的重组人尿激酶原组合物与现有技术相比，存在以下优势：1、重组人尿激酶原现有制剂的缺点是使用了人血白蛋白作为保护剂，其缺点见
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部分内容，为了避免使用人血白蛋白，发明人采用以下辅料进行了改进：用蔗糖或海藻糖替换了人血白蛋白，降低了人血白蛋白所带来的病毒污染风险，增加了产品的安全性，由于蔗糖或海藻糖比较容易从市场获得，同时降低了市场采购的风险。同时，发明人还增加了吐温80，该产品可以使蛋白免受剪切力作用。在本处方中，蔗糖或海藻糖与吐温80都作为重组人尿激酶原的保护剂，它们联合作用，保护产品机理不同，使重组人尿激酶原的结构更为稳定，不易降解。用柠檬酸或琥珀酸盐缓冲液替换了磷酸盐缓冲液，重组人尿激酶原在柠檬酸或琥珀酸盐缓冲液体系中，产品更为稳定。最终提供的组合物降低了来源于人血、易被病毒感染的风险，原料更易从市场获得，降低了成本同时，为患者带来质量更为可控、安全性更高的产品。2、与现有技术相比：原有处方中存在注射用重组人尿激酶原和人血白蛋白两种蛋白质，且注射用重组人尿激酶原和人血白蛋白的分子量非常接近，仅差10kd左右，人血白蛋白本身也会降解一些杂质，因此采用sds电泳纯度以及sec-hplc的分析分析手段无法精准确认产品的纯度和杂质。本发明的组合物中除了处方药物之外均是成分明确的化学物质，采用目前常规的sds电泳纯度以及sec-hplc的分析分析方法可以很好的分析纯度和杂质，以便更好的控制注射用重组人尿激酶原制剂。另外，原有处方所用的人血白蛋白随着血源和生产工艺不同，产品质量会有所不同。目前很难选择相同工艺和血源的人血白蛋白非常困难，对制剂而言存在非常大风险。3、本发明提供的组合物改变了原制剂中的缓冲体系，使重组人尿激酶原的新处方制剂更加的稳定。通过新制剂处方的研究，使得注射用重组人尿激酶原在生产过程中更加稳定，并大大降低病毒污染风险低和人血白蛋白的采购风险。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1：注射用重组人尿激酶原称取重组人尿激酶原5mg、甘露醇4mg、海藻糖1mg、吐温-800.02mg，加入20mm、ph为6.0的柠檬酸盐缓冲溶液中，总体积为100ml，调节ph至5.0，然后冷冻干燥，即得。实施例2：注射用重组人尿激酶原称取重组人尿激酶原5mg、甘露醇3mg、蔗糖1.5mg、吐温-800.03mg，加入20ml20mm、ph为5.0的柠檬酸盐缓冲溶液中，用注射用水补足至100ml，然后调节ph到5.5，然后冷冻干燥，即得。实施例3：注射用重组人尿激酶原称取重组人尿激酶原5mg、甘氨酸3mg、蔗糖1mg、吐温-800.02mg，加入60ml20mm、ph为5.5的柠檬酸盐缓冲溶液，用注射用水补足至100ml，调节溶液至ph6.0，然后冷冻干燥，即得。实施例4：注射用重组人尿激酶原称取重组人尿激酶原5mg、甘氨酸2mg、海藻糖0.5mg、吐温-800.01mg，加入20mm、ph为5.5柠檬酸盐缓冲溶液，总体积为100ml，调节溶液ph至5.0，然后冷冻干燥，即得。实施例5：注射用重组人尿激酶原称取重组人尿激酶原5mg、甘露醇5mg、蔗糖0.5mg、吐温-800.01mg，加入40ml20mm、ph为6.0琥珀酸盐缓冲溶液，用注射用水补足至100ml，调节溶液ph至5.5，然后冷冻干燥，即得。实施例6：注射用重组人尿激酶原称取重组人尿激酶原5mg、甘氨酸2mg、蔗糖1.5mg、吐温-800.02mg，加入80ml20mm、ph为5.0琥珀酸盐缓冲溶液，用注射用水补足至100ml，调节溶液ph至6.0，然后冷冻干燥，即得。实验例1：配方筛选实验：稳定性实验1、实验样品：f1-f6：分别为实施例1-6的样品；f7：根据cn1730098a(申请号为200410058006.0)的实施例2制备；f8：根据实施例1的配方及制备方法，删除吐温-80；f9：根据实施例1的配方及制备方法，用磷酸盐缓冲液替换柠檬酸盐缓冲液，并调节ph值为7.0；f10：根据实施例1的配方及制备方法，用葡萄糖替换蔗糖作为保护剂。2、数据检测：2.1dsc扫描，用差示扫描量热法(differentialscanningcalorimetry,dsc)进行tm值测定，参数设置见表1：表1：dsc扫描参数设置表项目设置值开始扫描温度10℃结束扫描温度110℃扫描速率200℃/hr每个样品再扫描次数0冷却速率exp扫描前平衡时间3mins下个扫描前等待时间0最终仪器保持温度25℃数据采集频率10sec热补偿方式none进样前毛细管温度30℃2.2外观性状取各样品，放置并使样品恢复至室温后，检查颜色和澄清度。2.3浓度检测取各考察点项下的样品，放置并使样品恢复至室温后，取样用ph7.0的磷酸缓冲液稀释蛋白至浓度约为0.5mg/ml，按照紫外测定仪器进行蛋白含量测定。2.4sec-hplc采用《中国药典》2010版三部(附录iiib)中面积归一化法。色谱柱为tskgelg3000swxl7.8×300mm，流动相为0.01mol/l磷酸盐缓冲液(ph6.8含0.4mol/l氯化钠)，柱温25℃，样品池温度4℃，流速0.8ml/min，上样量20μg，于波长280nm处检测。2.5dls取各考察点项下的样品，放置并使样品恢复至室温后。按照动态光散射(dynamiclightscattering，dls)仪器进行检查。2.6sds-page采用《中国药典》2010版三部(附录ivc)法，用非还原sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，考马斯亮蓝r250染色，分离胶浓度15％，浓缩胶浓度为5％，样品与上样缓冲液混合后，60℃保温3min，上样量10μg；经扫描仪扫描，蛋白纯度不低于95.0％。2.7单链比例采用s2444显色底物反应法进行检测。3、实验结果：3.1dsc扫描结果，见表2表2：dsc扫描结果汇总编号ph值tmonset(℃)tm1(℃)f15.034.7464.19f25.533.3168.32f36.036.8369.62f45.035.2665.27f55.537.8168.36f66.036.269.43f76.525.7361.61f87.021.6462.31f97.524.0661.33f107.018.3160.21表2结果：tm值越低越不稳定，f1-f6tm值高于f7-f10。结果表明：本发明产品中使用的琥珀酸盐或柠檬酸盐缓冲体系及其调节的ph，效果优于不加吐温80的保护剂体系、用葡萄糖作为赋形剂的体系及磷酸盐缓冲体系。3.2外观性状：见表3表3：外观性状表3结果显示：在t0时各处方溶液为无色澄明溶液，f1-f6在25℃或40℃放置均只有少量蛋白沉淀，f7在40℃第2、4周出现白色浑浊溶液，f8、f9在40℃第1、2、4周时出现白色浑浊溶液。f10在25℃第4周和40℃第1、2、4周均出现大量的蛋白沉淀。分析上述结果的原因，f10中使用的保护剂是葡萄糖，不能用作保护剂；f7、f9均采用的是磷酸盐，其ph也略高于本发明；f8是去除吐温80的制剂，吐温80的加入避免了重组人尿激酶原的降解。结果表明：本发明提供的缓冲体系、保护剂，产品外观性状稳定。3.3浓度检测，测定结果见表4。表4：浓度备注：*标示样品均在微型离心机上离心30～60s后，取上清液进行浓度检测。试验结果表明：外观发生明显沉淀的样品浓度测定结果有明显降低的，但也有无明显降低的。结果表明：本发明提供的缓冲体系、保护剂，产品无明显降解。3.4dls，检查结果见5。表5：dls表5结果显示：本发明实施例各处方溶液样品的平均粒径没有明显变化，表现出较好的稳定性，而f7～f9在25℃或40℃条件下放置后，平均粒径急剧升高，表明有较多蛋白聚集产生。结果表明：本发明提供的缓冲体系、保护剂产品平均粒径稳定。3.5sec-hplc，结果见表6。表6：sec-hplc表6结果显示：f1～f6样品在t0是纯度较高，在25℃和40℃考察后，sec-hplc纯度结果均呈现下降趋势，但明显优于f7～f9。结果表明：本发明提供的缓冲体系、保护剂，产品更稳定，降解杂质更少。3.6sds-page，测定结果见表7。表7：sds-page_表7结果显示：f1～f6样品在t0是纯度较高均在97％以上，在25℃和40℃考察后，sds-page纯度结果有一定程度下降，但f7～f10检测出的主成份已趋近于没有。结果表明：本发明提供的缓冲体系、保护剂，产品更稳定。3.7单链比例，测定结果见表8。表8：单链比例表8结果显示：f1～f10样品在t0单链比例无明显差异，在25℃和40℃考察后，单链比例有一定程度下降，明显优于f7～f10。分析原因：本发明提供的缓冲体系、保护剂，产品更稳定，双链杂质更少。结果表明：与现有技术相比，本发明提供的产品更稳定，双链杂质更少。以上实验结果表明：1、发明人去除保护剂后，产品的稳定性下降，上述质量属性比如dls、sec-hplc、sds电泳纯度、单练比例均会有不同程度的迅速下降。因此想用常规的糖类作为替换，比如葡萄糖，所申报保护的处方的保护剂为比较常规的保护剂，市场上更容易获得，原来用的人血白蛋白不是常规的保护剂；采用葡萄糖作为保护剂，由于葡萄糖属于单糖，与蛋白质结合的保护作用不明显，加速考察过程中，容易形成聚集。2、目前产品处方中的磷酸缓冲体系一般是中性或接近中性(7±0.5)，实验结果表明在缓冲体内，液态状态下产品的热稳定性不大好，通过加速考察容易出现多聚体聚集的现象。通过加热作用，蛋白质分子的氢键会被破坏，容易出现聚集。因此采用本发明的柠檬酸盐缓冲液或琥珀酸盐缓冲液。最终结果证实：与现有技术相比，本发明提供的配方更适合制备成冻干粉针，稳定性更强。虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页12