柚子皮水提物粉末,其制备,抗血栓作用及应用的制作方法

本发明涉及一种制备鲜柚子皮水提物粉末的方法,涉及由该方法制备的鲜柚子皮水提物粉末在制备抗静脉血栓和抗动脉血栓药物中的应用。本发明属于生物医药领域。
背景技术：
：静脉栓塞已成为目前发病率高和死亡率高的疾病之一。后果最严重的静脉血栓主要是脑部静脉血栓和下肢深静脉血栓。脑部静脉血栓源自硬脑膜静脉窦道血栓形成和/或者脑部静脉纹理血栓形成,进而导致脑部静脉堵塞,颅压升高,脑部缺血或颅内出血。脑部静脉栓塞的标准治疗策略是口服抗凝剂。上/下肢深静脉血栓和肺部栓塞的发病率是0.1-0.2％。上/下肢深静脉血栓和肺部栓塞享有类似的风险因子。虽然肺部栓塞是上/下肢深静脉血栓的普遍并发症,但是肺部栓塞不容易诊断。因为肺部栓塞没有特征的临床信号。研究20年间超过4200万死亡者的身体状况发现,他们之中大约1.5％患肺部血栓。肺部栓塞是20万死亡者的死因。另一项研究发现,在血管造影确认的上/下肢深静脉血栓患者中也有50％以上肺部栓塞患者。上/下肢深静脉血栓可波及老年人,青年人及儿童。大量临床研究证明,肿瘤患者普遍并发上/下肢深静脉血栓,接受人工心脏瓣膜手术,静脉瘘手术和其他手术,以及器官移植手术的患者都面临静脉血栓风险。此外,静脉插管及缺血性中风则使得儿童静脉血栓病例日益增加。因为病因不同,所以在传统观念下静脉血栓和动脉血栓被看作两种不同的疾病。动脉栓塞已成为目前发病率高和死亡率高的疾病之一。动脉血栓形成对暂时性脑缺血发作,急性冠状动脉综合症,心肌梗塞和心房颤动负责。在房颤中有18％-47％病人患有冠状动脉疾病,在伴随冠状动脉疾病的房颤患者中有大约20％接受经皮冠状动脉介入治疗。动脉血栓形成还对人工心脏瓣膜,动静脉瘘和其他手术后的动脉血栓及不稳定型心绞痛负责。例如肝移植手术之后,患者面临肝脏动脉血栓风险。此外,抗磷脂综合症患者也面临动脉血栓风险。虽然肿瘤与静脉血栓的关联比与动脉血栓的关联广泛,但是对特殊恶性肿瘤及肿瘤治疗中动脉血栓包括外周动脉血栓发病的认识正在日益加深。动脉插管及缺血性中风则使得儿童动脉血栓病例日益增加。十多年前就开始警惕可卡因滥用导致的动脉血栓风险。因为病因不同,所以在传统观念下静脉血栓和动脉血栓被看作两种不同的疾病。最近的流行病学研究表明,静脉血栓和动脉血栓之间的关联性难以割断。这种状况可以归结于它们的风险因子相互重叠。这样一来,动脉血栓的预防和治疗便越来越受到重视。直接口服抗凝是动脉血栓和静脉血栓临床治疗的唯一策略。尽管口服抗凝剂对动脉血栓和静脉血栓的疗效确切,但是都有出血副作用。例如在有效的口服剂量下,阿司匹林可诱发消化道出血或颅内出血。这种风险大幅度限制了患者的受益面。临床需要疗效可与阿司匹林媲美,又没有阿司匹林样消化道出血或颅内出血风险的药物。针对这个临床需求,国内外研究人员付出了大量心血。可是,一直取得没有实质性进展。发明人长期从事柚子皮水提物粉末化学成分及治疗作用研究。发明人认识到至今业内人既不清楚柚子皮水提物粉末到底含哪些化学组分,也不清楚柚子皮水提物粉末有怎样的治疗作用。针对这种状况,发明人对柚子皮水提物粉末进行质谱分析,发现了24种未见文献报道的组分。通过反复研究发明人发现,这24种组分联合可治疗静脉血栓和动脉血栓。与所有柚子皮的已知发明相比,本发明的柚子皮水提物粉末可治疗静脉血栓和动脉血栓的发明达到了一个全新高度。根据这些认识,发明人提出了本发明。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种制备鲜柚子皮水提物粉末的方法,以及由该方法制得的鲜柚子皮水提物粉末。实验证明,由本发明制备的鲜柚子皮水提物粉末具有抗动脉血栓以及抗静脉血栓作用。为了达到所述目的,本发明采用了以下技术手段:第一个技术手段是提供了一种鲜柚子皮水提物粉末,所述鲜柚子皮水提物粉末含10种奎尼酸类化合物和14种黄酮醇类化合物。其中所述10种奎尼酸类化合物为3-o-[e-2-(8-羧基-1,3,5,7-正辛四烯羰氧)-3-羟基-4-(6-羧基-1,3,5-正己三烯羰氧)-5-甲酰氧-6-(4-羧基-1,3-正丁二烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸,3-o-[e-2-羧基正丙酰氧-3-羟基正丙酰氧-4,6-二(4-羧基-1-正丁烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸,3-o-[e-2-(5-羧基-1-正戊烯羰氧)-4-羟基正丙酰氧-6-(5-羧基正戊羰氧)桂皮酰]奎尼酸,3-o-[e-2,6-二(羧甲基正丁酰氧)-3-羟基-4-羟基乙酰氧-5-羟基正丙酰氧桂皮酰]奎尼酸,3-o-[e-2,6-二(5-羧基-1-正丁烯羰氧)-4-(4-羟基正丁羰氧)桂皮酰]奎尼酸,3-o-[e-2-(4-羟基正丁羰氧)-2-羟基-4,5-二(羟基正丙酰氧)-6-(4-羧基正丁羰氧)桂皮酰]奎尼酸,3-o-[e-2-(4-羧基-1-正丁烯羰氧)-3-(5-羟基-1-正戊烯羰氧)-4-(4-羟基-1-正丁烯羰氧)-5-(4-羧基正丁羰氧)-6(5-羧基-1-正戊烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸,3-o-[e-2,3-二(6-羧基-1,3-正己二烯羰氧)-4-羟基-5-(8-羧基-1,3,5-正辛三烯羰氧)-6-(7-羧基-1,3-正庚二烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸,3-o-[e-2-(4-羧基-1-正丁烯羰氧)-4-羧基正丙烯酰氧-6-(7-羧基正庚羰氧)桂皮酰]奎尼酸和3-o-[e-2-(4-羧基-1-正丁烯羰氧)-4-羧基正丙烯酰氧)-6-(7-羧基正庚羰氧)桂皮酰]奎尼酸,其中所述14种黄酮醇为3-o-葡萄糖苷-5-羟基正丁酰氧-7-(4-羧基-1-正丁烯羰氧)-8-(3-羟基-1-正丙烯羰氧)黄酮醇,3-o-葡萄糖苷-5-羟基正丁酰氧-7-(3-羧基-1-正丙烯羰氧)-8-(5-羟基-1,3-正戊二烯羰氧)黄酮醇,3-o-葡萄糖苷-5-(4-羧基正丁羰氧)-7-(3-羧基正丙羰氧)-8-(5-羟基-1-正戊烯羰氧)黄酮醇,3-o-葡萄糖苷-5-羟甲氧-6-(6-羧基-1-正己烯羰氧)-7-(3-羧基-1-正丙烯羰氧)-8-(4-羟基-1,4-正丁二烯羰氧)黄酮醇,3-o-葡萄糖苷-5-(7-羟基-1,3-正庚二烯羰氧)-6,7-二羟基-8-(5-羧基-1,3-正戊二烯羰氧)黄酮醇,3-o-葡萄糖苷-5-羟甲氧-6-(4-羧基-1,3-正丁二烯羰氧)-7-(3-羧基-1-正丙烯羰氧)-8-(4-羟基-1,3-正丁二烯羰氧)黄酮醇,3-o-葡萄糖苷-5-(7-羧基-1,3-正庚二烯羰氧)-6-(6-羧基-1,3-正己羰氧)-7-羟基-8-(6-羧基-1,3-正己二烯羰氧)黄酮醇,3-o-葡萄糖苷-5-(5-羧基-1-正戊烯羰氧)-6-(5-羟基正戊羰氧)-7-(4-羧基-1,3-正丁二烯羰氧)黄酮醇,3-o-葡萄糖苷-5-(5-羧基-1,3-正戊二烯羰氧)-6-(4-羧甲基正丙酰氧)-7-羟基-8-(4-羧基-1,3-正丁二烯羰氧)黄酮醇,3-o-葡萄糖苷-5-(7-羟基-1,3,5-正庚三烯羰氧)-6-甲氧-7-羟基-8-(5-羧基-1,3-正戊二烯羰氧)黄酮醇,3-o-葡萄糖苷-5-(4-羟基正丁羰氧)-6-羟基-7,8-二(5-羟基正戊羰氧)黄酮醇,3-o-葡萄糖苷-5-羟甲基-6-羟基-7-羟基正丙酰-8-(4-羟基正丁羰氧)黄酮醇,3-o-葡萄糖苷-5,8-二(6-羧基-1,3-正己二烯羰氧)-6-(3-羧基-1-正丙烯羰氧)-7-(5-羧基-1,3-正戊二烯羰氧)黄酮醇和3-o-葡萄糖苷-5-(5-羟基-1,3-正戊二烯羰氧)-6-(3-羧基-1-正丙烯羰氧)-7-(4-羧基-1,3-正丁二烯羰氧)-8-(6-羧基-1,3-正己二烯羰氧)黄酮醇。第二个技术手段是提供了制备所述鲜柚子皮水提物粉末方法。即取鲜柚子皮用自来水洗净,切碎,在蒸馏水中于50℃-100℃加热0.5-4小时,冷却至室温,过滤,滤饼用蒸馏水洗3次,合并的滤液减压浓缩,得到的粉末即为鲜柚子皮水提物粉末。其中,鲜柚子皮用自来水洗净,切碎,优选地在蒸馏水中于50℃-80℃加热2小时并于220rpm/min搅拌,冷却至室温,过滤,滤饼用蒸馏水洗3次,合并的滤液减压浓缩,得到的粉末即为鲜柚子皮水提物粉末。第三个技术手段是提供鲜柚子皮水提物粉末的质谱总离子流图谱。第四个技术手段是提供与鲜柚子皮水提物粉末的质谱总离子流谱中的峰对应的24种组分的化学结构。第五个技术手段是描述鲜柚子皮水提物粉末的抗静脉血栓作用。第六个技术手段是描述鲜柚子皮水提物粉末的抗动脉血栓作用。附图说明图1.鲜柚子皮水提物粉末的uplc-质谱总离子流图谱。图2.3-o-[e-2-(8-羧基-1,3,5,7-正辛四烯羰氧)-3-羟基-4-(6-羧基-1,3,5-正己三烯羰氧)-5-甲酰氧-6-(4-羧基-1,3-正丁二烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图3.3-o-[e-2-羧基正丙酰氧-3-羟基正丙酰氧-4,6-二(4-羧基-1-正丁烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图4.3-o-[e-2-(5-羧基-1-正戊烯羰氧)-4-羟基正丙酰氧-6-(5-羧基正戊羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图5.3-o-[e-2,6-二(羧甲基正丁酰氧)-3-羟基-4-羟基乙酰氧-5-羟基正丙酰氧桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图6.3-o-[e-2,6-二(5-羧基-1-正丁烯羰氧)-4-(4-羟基正丁羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图7.3-o-[e-2-(4-羟基正丁羰氧)-2-羟基-4,5-二(羟基正丙酰氧)-6-(4-羧基正丁羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图8.3-o-[e-2-(4-羧基-1-正丁烯羰氧)-3-(5-羟基-1-正戊烯羰氧)-4-(4-羟基-1-正丁烯羰氧)-5-(4-羧基正丁羰氧)-6(5-羧基-1-正戊烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图9.3-o-[e-2,3-二(6-羧基-1,3-正己二烯羰氧)-4-羟基-5-(8-羧基-1,3,5-正辛三烯羰氧)-6-(7-羧基-1,3-正庚二烯羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图10.3-o-[e-2-(4-羧基-1-正丁烯羰氧)-4-羧基正丙烯酰氧-6-(7-羧基正庚羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图11.3-o-[e-2-(4-羧基-1-正丁烯羰氧)-4-羧基正丙烯酰氧)-6-(7-羧基正庚羰氧)桂皮酰]奎尼酸及裂解产物。图12.3-o-葡萄糖苷-5-羟基正丁酰氧-7-(4-羧基-1-正丁烯羰氧)-8-(3-羟基-1-正丙烯羰氧)黄酮醇及裂解产物。图13.3-o-葡萄糖苷-5-羟基正丁酰氧-7-(3-羧基-1-正丙烯羰氧)-8-(5-羟基-1,3-正戊二烯羰氧)黄酮醇及裂解产物。图14.3-o-葡萄糖苷-5-(4-羧基正丁羰氧)-7-(3-羧基正丙羰氧)-8-(5-羟基-1-正戊烯羰氧)黄酮醇及裂解产物。图15.3-o-葡萄糖苷-5-羟甲氧-6-(6-羧基-1-正己烯羰氧)-7-(3-羧基-1-正丙烯羰氧)-8-(4-羟基-1,4-正丁二烯羰氧)黄酮醇及裂解产物。图16.3-o-葡萄糖苷-5-(7-羟基-1,3-正庚二烯羰氧)-6,7-二羟基-8-(5-羧基-1,3-正戊二烯羰氧)黄酮醇及裂解产物。图17.3-o-葡萄糖苷-5-羟甲氧-6-(4-羧基-1,3-正丁二烯羰氧)-7-(3-羧基-1-正丙烯羰氧)-8-(4-羟基-1,3-正丁二烯羰氧)黄酮醇及裂解产物。图18.3-o-葡萄糖苷-5-(7-羧基-1,3-正庚二烯羰氧)-6-(6-羧基-1,3-正己羰氧)-7-羟基-8-(6-羧基-1,3-正己二烯羰氧)黄酮醇及裂解产物。图19.3-o-葡萄糖苷-5-(5-羧基-1-正戊烯羰氧)-6-(5-羟基正戊羰氧)-7-(4-羧基-1,3-正丁二烯羰氧)黄酮醇及裂解产物。图20.3-o-葡萄糖苷-5-(5-羧基-1,3-正戊二烯羰氧)-6-(4-羧甲基正丙酰氧)-7-羟基-8-(4-羧基-1,3-正丁二烯羰氧)黄酮醇及裂解产物。图21.3-o-葡萄糖苷-5-(7-羟基-1,3,5-正庚三烯羰氧)-6-甲氧-7-羟基-8-(5-羧基-1,3-正戊二烯羰氧)黄酮醇及裂解产物。图22.3-o-葡萄糖苷-5-(4-羟基正丁羰氧)-6-羟基-7,8-二(5-羟基正戊羰氧)黄酮醇及裂解产物。图23.3-o-葡萄糖苷-5-羟甲基-6-羟基-7-羟基正丙酰-8-(4-羟基正丁羰氧)黄酮醇及裂解产物。图24.3-o-葡萄糖苷-5,8-二(6-羧基-1,3-正己二烯羰氧)-6-(3-羧基-1-正丙烯羰氧)-7-(5-羧基-1,3-正戊二烯羰氧)黄酮醇及裂解产物。图25.3-o-葡萄糖苷-5-(5-羟基-1,3-正戊二烯羰氧)-6-(3-羧基-1-正丙烯羰氧)-7-(4-羧基-1,3-正丁二烯羰氧)-8-(6-羧基-1,3-正己二烯羰氧)黄酮醇及裂解产物。具体实施方式为了进一步阐述本发明,下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的,它们仅用来对本发明进行具体描述,不应当理解为对本发明的限制。实施例1鲜柚子皮水提物粉末的制备鲜柚子皮用自来水洗洗净,取120g鲜柚子皮切碎。在500ml蒸馏水中于50℃-80℃加热2小时,同时搅拌(220rpm/min)。冷却至室温,过滤,滤液减压浓缩得到6g鲜柚子皮水提物粉末。即为鲜柚子皮水提物粉末。实施例2测定鲜柚子皮水提物粉末的色谱和质谱离子流谱2-1.样品溶液的制备(10mg/ml)称取26.7mg柚子皮水提物粉末,用2.67ml超纯水中将粉末溶解。得到的溶液经超声震荡1分钟,之后再于13000r/min离心10分钟。取上清液,过0.22μm滤膜,置于样品瓶中供色谱和质谱测定用。2-2.色谱条件色谱柱:waters,acquityhsst3柱(2.1×100mmi.d.,1.7μm)；进样体积:2μl；pda检测器:190-400nm；流动相:水(0.1％甲酸),乙腈；采用这种流动相并按表1的梯度洗色谱柱。表1流动相梯度表2-3.测定离子流谱的条件电喷雾离子化模式:正(pi)及负(ni)模式；离子模式参数:毛细管电压1000v,去溶剂气流速800l/h,温度450℃(柚子皮水提物粉末的离子流谱见图1)。2-4.测定质谱的条件源温度120℃,锥孔气流速50l/h,喷雾气压6bar,碎裂电压20-45v,取样锥电压40v,采集模式为msecontinuum；分辨率模式:带电粒子的质量数与电荷数之比(m/z),数据采集范围100-1500；低能量通道trap碎裂电压6v,高能量通道trap碎裂电压选择20-60v梯度电压；选le(亮氨酸脑啡肽)为质量锁,采集m/z(鲜柚子皮水提物粉末的质谱见说明书附图2-25)。实施例3指定鲜柚子皮水提物粉末中24种组分的结构将实施例2的uplc色谱与质谱联接,测定鲜柚子皮水提物粉末的uplc-质谱。质谱条件是电喷雾离子化的正离子和负离子两种模式。斜阱碰撞能为20-60v。园椎体电压为40v。离子源温度为100℃。毛细管电压为30kv。喷雾器的压力为6.5bar。质/荷比的范围为100-1500。在45分钟内分出24个独立峰。根据质谱裂解规律,与这些峰(对总离子流图谱的峰从左到右顺序编号)被指定为表2的对应组分。这24种组分在质谱条件下的裂解产物见附图2-25。表2总离子流图谱中峰对应组分保留时间,负离子质量数,结构及名称实施例4评价鲜柚子皮水提物粉末的抗静脉血栓作用实验动物与方法sd品系雄性大鼠(250±20g),购自北京维通利华实验动物技术有限公司,用于制作大鼠下腔静脉结扎模型。实验分组和剂量sd雄性大鼠在实验前适应25-28℃的环境并禁食一天。之后,随机分为阳性对照华法林组,口服剂量为0.82μmol/kg/天；阴性对照生理盐水组,口服剂量为10ml/kg/天；鲜柚子皮水提物粉末组,剂量为6mg/kg/天。连续口服7天。评价方法最后一次给药30min后大鼠腹腔注射20％乌拉坦溶液使麻醉。在手术板上将麻醉大鼠仰卧位固定,备皮和消毒。然后,沿大鼠腹白线打开腹腔。开腹切口为下至凝固腺上至露出肝脏一角。将小肠等器官从腹腔内移出并用浸润过生理盐水的纱布包裹。钝性分离血管周围结缔组织,暴露下腔静脉及分支。在肾静脉下方将腹主动脉和下腔静脉剥离开,然后用生理盐水浸湿的缝合线在下腔静脉与左肾静脉交汇处将下腔静脉结扎。将从腹腔内移出并用浸润过生理盐水的纱布包裹的肠等器官按解剖位置移回腹腔内,用缝合线逐层缝合腹腔。由于华法林治疗的大鼠随时可死亡,所以30min之后便打开腹腔,逐个将分支结扎,从下腔静脉与左肾静脉的交汇处的结扎处取出2cm下腔静脉,再从下腔静脉中取出血栓称重,数据见表3。表3鲜柚子皮水提物粉末对静脉血栓的影响静脉血栓大鼠的治疗剂剂量静脉血栓湿重:均值±sdmg生理盐水(n＝12)10ml/kg/天22.2±7.0华法林(n＝7)0.82μmol/kg/天8.7±1.8鲜柚子皮水提物粉末(n＝12)6mg/kg/天9.0±2.7aa)与生理盐水比p<0.01,与华法林比p>0.05在治疗过程中口服0.82μmol/kg/天华法林的大鼠5只因全身性出血死亡,存活的7只大鼠在最后测定静脉血栓湿重时也发现全身性出血副反应；口服生理盐水的12只大鼠及口服6mg/kg/天鲜柚子皮水提物粉末的12只大鼠在测定静脉血栓湿重时均未见出血副反应。也就是说,鲜柚子皮水提物粉末无出血副反应。为了进一步支持鲜柚子皮水提物粉末无出血副反应，本发明在静脉血栓大鼠上测定了它们的尾出血时间。具体操作是,最后一次给药30min后,将鼠尾尖剪去2mm并开始计时。每15s用滤纸将血轻轻拭去,直至滤纸无任何血迹,经历的时间为出血时间。表4的数据说明,0.82μmol/kg/天华法林显著延长大鼠出血时间。鲜柚子皮水提物粉末对大鼠尾出血时间无影响。表4鲜柚子皮水提物粉末对静脉血栓大鼠尾出血时间的影响静脉血栓大鼠的治疗剂剂量尾出血时间:均值±sds生理盐水(n＝12)10ml/kg/天153.6±43.9华法林(n＝7)0.82μmol/kg/天346.3±71.9a鲜柚子皮水提物粉末(n＝12)6mg/kg/天183.7±28.7aa)与生理盐水比p<0.01；b)与生理盐水比p>0.05,与华法林比p<0.01综合从上面2个模型获得的数据,本发明的结论是口服剂量为6mg/kg/天的鲜柚子皮水提物粉末可有效地抑制静脉血栓,不影响静脉血栓大鼠的出血时间,无出血副作用。这两方面都比口服剂量为0.82μmol/kg/天的华法林优秀,鲜柚子皮水提物粉末有优秀的抗静脉血栓活性。实施例5评价鲜柚子皮水提物粉末的抗动脉血栓作用1)将聚乙烯管拉成一端为斜口的细管,定长为10.0cm,分别为右颈静脉(管径较粗)及左颈动脉(管径较细)插管；中段聚乙烯管定长为8.0cm,血栓线压在颈动脉插管方向,插管前需在管中充满肝素。2)将体重200±20g雄性大鼠在手术前适应环境并禁食一天。随机分为生理盐水(0.3ml/100g,7只大鼠)组,阿司匹林(1110μmol/kg,7只大鼠)组,鲜柚子皮水提物粉末(4mg/kg,7只大鼠)组。按照规定剂量给大鼠口服药物。给药30min后,大鼠腹腔注射20％乌拉坦溶液麻醉(7ml/kg),2min之后开始手术。手术中将大鼠仰卧位于固定板上,剪开颈部皮肤,分离右颈总动脉及左颈静脉,血管下压线,结扎远心端,在静脉靠远心端处剪一小口,将插管插入静脉端,注射肝素,而后取下注射肝素的注射器,系线固定,再用动脉夹夹住动脉近心端,在靠近远心端方向剪一小口,将动脉端结扎,系线固定后松开动脉夹,建立体外循环旁路。循环15分钟后先剪断静脉端观察血液循环是否正常,若正常从动脉端取出血栓线,在纸上沾干浮血后称重,以血栓重表示活性,数据列入表5。表中的血栓重量表明,在167μmol/kg口服剂量下阿司匹林有效地抑制大鼠患动脉血栓症,在4mg/kg口服剂量下鲜柚子皮水提物粉末同样有效抑制大鼠患动脉血栓症。也就是说,鲜柚子皮水提物粉末具有优秀的抗动脉血栓活性。表5鲜柚子皮水提物粉末对大鼠动脉血栓的影响动脉血栓大鼠的治疗剂剂量血栓湿重:均值±sdmg生理盐水10ml/kg45.2±8.0阿司匹林167μmol/kg28.0±3.2a鲜柚子皮水提物粉末4mg/kg30.1±9.3ba)与生理盐水比p<0.01,与阿司匹林比p>0.05；n＝7。当前第1页12