本发明涉及碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(crkp)等耐药菌感染治疗的复方组方。
背景技术：
：：肺炎克雷伯菌(klebsiellapneumoniae，kpn)是临床最常见的条件致病菌之一,可引发呼吸系统、泌尿系统、腹腔关节甚至是血流感染[1]。根据《2018年全国细菌耐药监测报告》，肺炎克雷伯菌为革兰阴性菌中检出率排名第一的细菌，从2017年起，肺炎克雷伯菌在呼吸道标本的分离率超过鲍曼不动杆菌，上升至第一位，占19.3％[2]。在血液和其他无菌体液标本中，肺炎克雷伯菌的分离率仅次于大肠埃希菌[2]。目前临床上针对肺炎克雷伯菌相关感染的治疗主要应用β-内酰胺类抗生素，但随着该类抗生素尤其是第三代头孢菌素的广泛应用，超广谱β-内酰胺酶(esbls)的肺炎克雷伯菌明显增加，其耐药水平也明显增高，尤其是对多种抗生素耐药的现象日趋严重。碳青霉烯类抗生素是治疗肺炎克雷伯菌强有效的抗生素，被称为“人类抵抗细菌的最后一道防线”。但随着碳青霉烯类抗生素的广泛使用，对碳青霉烯类抗生素耐药的肺炎克雷伯菌呈逐渐增多的趋势。根据我国2018年chinet网站提供的数据来看，肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素的耐药率呈逐年上升的趋势，对亚胺培南和美罗培南的耐药率高达25％和26.3％[2]。1996年美国首次报道了碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantklebsiellapneumoniae，crkp)，随后crkp在各个地区逐渐流行。全球性的快速传播使得crkp成为各医疗健康机构关注的焦点。crkp能够引起多种感染包括菌血症、尿路感染、肺炎、腹腔感染以及切口感染。有研究报道感染crkp的患者死亡率高达30～40％[3～5]，而crkp菌血症的患者死亡率高达71.9％[6]。2013年美国cdc将碳氢霉烯耐药的肠杆菌科细菌(carbapenem-resistantenterobacteriacea-e,cre)称之为“噩梦细菌”[7.]。在2017年世界卫生组织(worldhealthorganization,who)发布的迫切需要新型抗生素的细菌清单中，cre位于1类重点的“极为重要”列表中[8],而crkp在cre中占有非常大的比例。根据我国2017年耐药监测网的数据统计，crkp已成为cre中分离率最高的细菌，占68.8％[2]。此外，crkp还能够通过质粒介导将耐药基因传递给其他肠杆菌科细菌从而导致医院感染的流行。因此有效治疗crkp的感染尤为重要。crkp的感染治疗非常困难，其原因与其耐药机制有关：产碳青霉烯酶；高产ampc酶；膜孔蛋白的缺失或表达下降；主动外排泵；形成生物膜。其中，最重要的耐药机制是产碳青霉烯酶。碳青霉烯酶可以水解青霉素、头孢菌素、氨曲南和碳青霉烯类等多种抗生素。因此，crkp所致的感染对临床来说是新的挑战。目前，治疗crkp尚无最有效的方案，一般建议采用联合治疗的方案。主要包括以多粘菌素为基础的联合治疗方案；以替加环素为基础的联合治疗方案；以磷霉素和氨基糖苷类药物联合的治疗方案等。然而，这些方案只能使部分患者获益，但总体治疗效果不理想。此外，多粘菌素的肾毒性和神经毒性，氨基糖苷类的耳、肾毒性且在体内分布不理想，以及替加环素治疗患者全因死亡率的增加等因素限制了临床的应用。crkp引起的院感爆发事件屡有报道[9～11]，且病死率高，已成为威胁人类健康最大的病原菌。根据2010年who报告，全球前10位死亡原因中，感染性疾病占50％，因感染性疾病导致的死亡人数占全球死亡人总数的25％。根据英国政府耐药评估小组结论对于耐药菌若不积极干预，到2050年，预计每年将有1000万人死于抗菌药物耐药，感染性疾病将再次成为人类首位死因。在2016年杭州g20峰会上细菌耐药甚至被认为是全球经济发展面临的挑战。因此，对耐药菌的防治迫在眉睫。目前在全球范围内，新型抗生素的缺乏已经带来了严重的公共卫生危机，新药的研发困难重重。因此，继续合理利用现有的抗生素，并继续探讨有协同作用的联合用药方案，有利于提高临床耐药菌的治愈率，有利于防止cre的快速播散，从而防止医院感染的爆发流行。[1]张文玲，王秀娟，赵喜荣，张翠仙.产β-esbls大肠埃希菌和肺炎克雷伯病原菌的耐药性分析[j].中国医学创新，2015,12(30):105-108.[2]胡付品，郭燕，朱德妹，等.chinet中国细菌耐药性监测(2018年)chinet中国细菌耐药监测网，www.chinets.com；[3]schwabermj,klarfeld-lidjis,navon-venezias,etal.predictorsofcarbapenem-resistantklebsiellapneumoniaeacquisitionamonghospit-alizedadultsandeffectofacquisitiononmortality[j].antimicrobagentschemother.2008；52(3):1028–1033.[4]patelg,huprikars,factorsh,jenkinssg,calfeedp.outcomesofcarbapenem-resistantklebsiellapneumoniainfectionandtheimpactofantimicrobialandadjunctivetherapies[j].infectcontrolhospepidemiol.2008；29(12):1099–1106.[5]falagasme,rafailidispi,kofteridisd,etal.riskfactorsofcarbapenem-resistantklebsiellapneumoniaeinfections:amatchedcasecontrolstudy[j].jantimicrobchemother.2007；60(5):1124–1130.[6]borera,saidel-odesl,riesenbergk,etal.attributablemortalityrateforcarbapenem-resistantklebsiellapneumoniabacteremia[j].infectcontrolhospepidemiol.2009；30(10):972–976[7]rebeccavoelker,msj,bacterialcarbapenemresistancecouldcreate“nightmarescenario”.jama,2013,310(4):363[8]worldhealthorganization.whopublisheslistofbacteriaforwhichnewantibioticsareurgentlyneeded[eb/ol].512.[2017-2-28]http://www.who.int/mediacentre/news/releases/2017/bacteria-antibiotics-needed/en/.[9]zhuj,sunl,dingb,etal.outbreakofndm-1-producingklebsie-llapneumoniaest76andst37isolatesinneonates[j].eurjclinmicr-obiolinfectdis,2016,35(4):611-618.[10]gud,dongn,zhengz,etal.afataloutbreakofst11carbapenem-resistanthypervirulentklebsiellapneumoniaeinachinesehospital:amolecularepidemiologicalstudy[j].lancetinfectdis,2018,18(1):37-46.[11]zhanl,wangs,guoy,etal.outbreakbyhypermucoviscousklebsiellapneumoniaest11isolateswithcarbapenemresistanceinatertiaryhospitalinchina[j].frontcellinfectmicrobiol,2017,7:1-9.技术实现要素：本发明第一目的在于，提供一种抗感染组合物，旨在提供一种具有优异协同效果的抗感染组合物。本发明第二目的在于，提供一种包含所述的抗感染组合物在用于制备敏感菌或者耐药菌感染的药物的用途(应用)。本发明第三目的在于，提供一种由所述的抗碳青霉烯类耐药菌感染的制剂(药物)。一种抗感染组合物，包括以下组分：组分a：亚胺培南、或其药学上可接受的盐及溶剂化物；组分b:哌拉西林、或其药学上可接受的盐及溶剂化物；组分c：阿维巴坦、或其药学上可接受的盐及溶剂化物。本研究发现，所述的组分a和组分b的具有良好的抗菌效果，可明显提升对敏感菌的作用效果，进一步与组分c联合，还可出人意料地增强对碳青霉烯霉耐药肺炎克雷伯菌的敏感性(本发明也称为敏感率)，提升crkp的治疗效果。本发明中，所述的组分a可以为亚胺培南、亚胺培南药学上可接受的盐溶剂化物(例如带有结晶水的化合物)。本发明中，所述的b可以为哌拉西林、哌拉西林药学上可接受的盐例如(哌拉西林钠)、哌拉西林溶剂化物(例如一水合哌拉西林)。本发明中，所述的c可以为阿维巴坦或阿维巴坦药学上可接受的盐(例如阿维巴坦钠)。作为优选，组分a、组分b、组分c的质量比为1:1～32:1；优选为1:1～16:1,优选为1:16～32:1，最优选为1:16:1。研究发现，所述比例下的组合物，可以进一步提升正协同作用，进一步提升抗菌特别是多种耐药菌的敏感度。研究发现，本发明优选比例下的的抗感染组合物，对超级细菌crkp的敏感率高于95％，为超级细菌crkp提供了一种全新的治疗思路。作为优选，所述的抗感染组合物，其特征在于，阿维巴坦的固定浓度为4μg/ml。本发明人创新性地研究发现，将阿维巴坦的浓度固定为4μg/ml，可提升二者的协同效果，特别是与亚胺培南联合使用可出人意料地提升crkp的敏感率。例如，在该优选比例下，对多重耐药(对三种以上抗生素耐药，并对哌拉西林他唑巴坦耐药但对碳青霉烯类敏感)的敏感率为100％。与亚胺培南联用后，本发明人意外发现，可进一步提升对crkp的敏感率，敏感率高达95％。作为优选，所述的抗感染组合物，所述的a、b、c以混合物的形式存在，或者在使用前彼此独立存在的ab料。本发明所述的抗感染组合物，优选为一种用于碳青霉烯类敏感菌和/或耐药菌的抗感染药物；进一步优选为抗crkp感染的抗感染组合物。本发明还提供了一种所述的抗感染组合物在用于制备抗碳青霉烯类敏感菌和/或碳青霉烯类耐药菌感染药物的应用。进一步优选，所述的应用，将所述的抗感染组合物在用于制备抗碳青霉烯类耐药菌感染药物的应用。本发明所述的抗感染组合物，除了可以改善敏感菌的抗菌效果外，更主要的功效在于，能够明显协同提升碳青霉烯类耐药菌的抗菌效果。作为优选，所述的应用，所述的碳青霉烯类耐药菌为碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌。本发明所述的抗菌组合物，对碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌表现出优异的协同抗菌效果，可明显提升该耐药菌的敏感率，降低mic。研究发现，本发明所述的抗感染组合物可明显协同提升对多重耐药菌以及crkp的敏感性，例如，多重耐药菌哌拉西林的抗菌活性提高了2-16倍。crkp对亚胺培南mic50(64μg/ml)与mic90(256μg/ml)分别为下降为mic50(1μg/ml)，mic90(16μg/ml)，活性分别提高了64倍和16倍，本发明所述的抗感染组合物多重耐药菌效果显著，亚胺培南联用后对crkp效果显著。进一步优选，所述的应用，将所述的抗感染组合物用于制备肺炎克雷伯菌敏感菌株以及多重耐药的肺炎克雷伯菌以及碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌感染所致的脑脊髓膜炎、下呼吸道感染、单纯性下尿路感染、复杂性尿路感染、非复杂性皮肤、皮肤软组织感染、复杂性腹腔内感染、妇产科感染、败血症的药物。作为优选，所述的应用，用于制备亚胺培南敏感细菌引起的细菌性脑脊髓膜炎、下呼吸道感染、单纯性下尿路感染、复杂性尿路感染、非复杂性皮肤、皮肤软组织感染、复杂性腹腔内感染、妇产科感染、败血症的药物。所述的应用中，将所述的抗感染组合物作为活性成分，和药学上可接受的辅料一起，制得适合临床应用的任意剂型；例如注射制剂。本发明还提供了一种抗碳青霉烯类耐药菌感染的药物，包含所述的抗感染组合物，还包含药学上可接受的辅料。本发明中，可采用药学上可接受的辅料，将本发明所述的抗感染组合物制得适合使用需求的制剂。优选地，所述的抗感染药物为注射用粉剂。本发明中，优选将所述的抗感染组合物和药学上可接受的辅料一起，制得用于注射的制剂。所述的抗碳青霉烯类耐药菌感染的药物，为抗碳青霉烯类耐药的肺炎克雷伯菌感染的药物。有益效果本发明所述的抗感染组合物，除用于敏感菌引起的感染并协同提升抗感染外，与亚胺培南联用后特别适用于碳青霉烯类耐药的肺炎克雷伯菌(crkp)等耐药菌引起的脑脊髓膜炎，下呼吸道感染(肺炎和支气管炎)，单纯性下尿路感染和复杂性尿路感染(包括肾盂肾炎)，非复杂性皮肤和皮肤软组织感染，复杂性腹腔内感染(包括腹膜炎和胆道感染)，妇产科感染，败血症等感染。本发明人还创新性地发现，a、b、c可出人意料地提升对碳青霉烯类耐药菌(特别是crkp)的作用效果，可将crkp的敏感率提升至95％，在临床上具有重大意义。附图说明图1为40株crkp的ipm+prl/avi、ipm+caz(头孢他啶)/avi、ipm+fep(头孢吡肟)/avi联合累积抑菌曲线。图2为40株crkpfic指数分布图。具体实施方式本发明体外抗菌活性验证一、病原菌分离与鉴定1.病原菌的分离收集临床不同患者分离的(2016年8月到2018年10月)耐碳氢霉烯肺炎克雷伯菌(crkp)株，共40株，多重耐药菌株32株，所有细菌通过phonenix细菌鉴定药敏系统(bectondickinson，美国)鉴定，菌株保存在-80℃冰箱备用，用美国标准菌株大肠埃希菌atcc25922，肺炎克雷伯菌atccbaa-1705和baa-1706作质控菌株。2.体外敏感性实验初始药物敏感性通过phonenix系统验证，验证的抗生素如下：碳青霉烯类(亚胺培南,美罗培南),哌拉西林，哌拉西林/他唑巴坦，氨苄西林，氨苄西林/舒巴坦，阿莫西林/克拉维酸，氨基糖苷类(阿米卡星，庆大霉素)，头孢菌素(头孢吡肟，头孢唑林，头孢噻肟，头孢他啶)，氟喹诺酮类药物(左氧氟沙星，环丙沙星)，四环素，复方新诺明，氯霉素和氨曲南。3.改良碳青霉烯灭活试验验证(mcim)(参照2017年clsi)①取1μl接种环的过夜培养纯菌落于2mltsb肉汤中，震荡混匀10-15秒，每管放入一张含10μg美罗培南的无菌纸片，确认纸片浸没于菌悬液中，35℃±2℃大气环境孵育4小时±15分钟；②孵育结束时，立即用营养肉汤或生理盐水制备0.5麦氏浊度的大肠埃希菌atcc25922的菌悬液(直接菌悬法)，并涂布于m-h平板上，菌悬液制备和平板涂布必须15分钟内完成，干燥3-10分钟；③用10μl接种环将美罗培南纸片从tsb肉汤中取出，将纸片贴于试管内壁，轻轻按压以挤去纸片上多余水分，然后将纸片取出贴于已涂布有大肠埃希菌atcc25922的mh平板上，35℃±2℃大气环境孵育；④18-24小时后量取抑菌圈直径并判断结果。肺炎克雷伯菌atccbaa-1705和肺炎克雷伯菌atccbaa-1706分别为阳性质控菌和阴性质控菌。美罗培南抑菌圈直径为6-15mm或直径为16-18mm但抑菌圈内有散在菌落时为阳性；抑菌圈直径≥19mm为阴性；抑菌圈直径为16-18mm无法判断是否存在碳青霉烯酶。4.体外敏感性与mcim结果40株crkp菌株经phonenix系统检测药敏结果如表2所示。表240株crkp的耐药情况结果显示kpc生产的肺炎克雷伯菌菌株对几乎所有的碳青霉烯类，头孢菌素类和β-内酰胺酶抑制剂耐药，对氟喹诺酮类和庆大霉素类耐药率高，菌株对阿米卡星和复方新诺明约有一半的敏感性。多重耐药菌株对头孢菌素类、青霉素类、β-内酰胺酶抑制剂、复方新诺明耐药率均在80％以上，对碳青霉烯类药物多表现为敏感。二、不同组方联合药敏筛选1.药品与试剂对以下抗生素进行研究：阿维巴坦(avi；上海荣柏生物技术有限公司，中国)、亚胺培南(ipm；国家食品药品监督管理局，中国)、哌拉西林(prl；国家食品药品监督管理局，中国)和阿维巴坦(avi)的储备液在-80℃冰箱冷冻保存，六个月内使用。实验当天制备新鲜的亚胺培南(ipm)药液。2.最小抑制浓度(mic)按照美国临床和实验室标准化协会(clsi)和联邦药品管理局(fda)标准，使用mh培养基通过肉汤微量稀释法测定抗生素的mic值。根据clsi指南，crkp分离株的耐药折点选择为：根据clsi指南，crkp分离株的耐药折点选择为：头孢他啶和头孢吡肟≥16μg/ml；美罗培南和比阿培南≥4μg/ml；阿米卡星≥64μg/ml。根据欧洲抗微生物药物敏感性试验委员会(eucast)折点建议，多粘菌素对肠杆菌科的mic耐药性折点>2μg/ml；替加环素的耐药性>2μg/ml。3.分级(或部分)抑菌浓度(fic)指数测定测试了以下3种抗菌药物组合：ipm+prl/avi、ipm+caz/avi、ipm+fep/avi。根据先前测定的mic值确定抗菌药物的范围。使用96孔微量平底细胞板和新鲜mh肉汤(mhb；oxoid，uk)通过微量肉汤棋盘法进行抗菌药物的协同分析。每孔用100μl5×105cfu/ml，最终体积为200μl,每组设置一个阳性对照孔和一个无菌对照孔。然后将96孔细胞板在37℃孵育18-24小时。单一抗菌药物的mic再次在每个96孔细胞板中测定，并且只有当单一试剂mic在通过肉汤微稀释法测定的mic高于或低于mic一倍稀释浓度时才进行读数。4.数据统计使用以下公式计算组合的分级抑菌浓度指数(fici)：fici＝mica，c/mica，a+micb,c/micb,a其中mica，c为联合时a药的mic值，mica，a为a药单用时的mic值；micb，c为联合时b药的mic值，micb，a为单用时b药的mic值。当fici≤0.5，表明两种药物联合存在协同作用，当0.5<fici≤1时，表明两种药物联合存在相加作用，当1<fici≤2，表明表明两种药物联合存在无关，当fici>2时，表明两种药物联合存在拮抗作用。1.联合方案对mic的影响分别测定在联合组方基础上的mic值(如表3)表340株crkp在联合用药下的mic分布(μg/ml)结果显示，当亚胺培南与哌拉西林/阿维巴坦联合使用时，亚胺培南的抗菌活性提高了16-64倍，亚胺培南的mic值显著下降。哌拉西林/阿维巴坦的抗菌活性也提高了8-32倍，mic值也显著下降。2.累积抑制作用图1显示了ipm+prl/avi、ipm+caz/avi、ipm+fep/avi单药和联合状况下随着抗菌药物浓度增加的累积抑菌曲线。x轴为浓度，y轴为抑菌的累及百分比(％，n＝40)。其中蓝色和绿色代表单药的累积抑菌曲线，棕色和紫色为联合给药后累积抑菌曲线。联合累积抑制曲线左移表明联合方案的达到相应累积抑菌率的mic低于单药，表明联合比单药有效。3.分级抑菌浓度指数(fici)prl/avi与ipm联用后在体外对抗crkp多表现协同作用，表4为哌拉西林/阿维巴坦与亚胺培南联用后的fici分布。表440株crkp菌株在ipm与prl/avi联合方案下的fici值亚胺培南哌拉西林阿维巴坦不同配比的研究取亚胺培南、哌拉西林与阿维巴坦，配制初始浓度为亚胺培南512、256、128、64、32、16、8、4、2μg/ml，哌拉西林阿维巴坦混合药液512/16、256/16、128/16、64/16、32/16、16/16、8/16、4/16μg/ml，菌液配置0.5麦氏浊度(大约108cfu/ml)，然后用mh肉汤稀释100倍。每孔添加菌液(100μl)和药液(单药100μl，复合50μl)，保证每孔终体积为200μl，得到亚胺培南与哌拉西林的质量比为128:1，64:1,32:1,16:1，8:1,4:1,2:1,1:1,1:2,1:4,1:8,1:16,1:32,1:64,1:128,1:256。将加完样的微孔板加盖放置于37℃温箱培养18-24h后，酶标仪读数与肉眼观察综合判断结果，以微孔内肉汤的透明度来判断有无长菌并记录下各孔的长菌情况，验证不同比例组分对40株crkp的敏感性，结果如下表根据clsi指南，对碳青霉烯抗性肺炎克雷伯氏菌分离株的折点：亚胺培南≥4,哌拉西林≥64,结果表明，当亚胺培南、哌拉西林与阿维巴坦的质量比为1:32:1、1:16:1、1:8:1、1:4:1、1:2:1、1:1:1、1:0.5:1、1:0.25:1时，crkp的敏感率分别为100％、100％、92.5％、87.5％、82.5％、72.5％、45％、2.5％。以70％细菌敏感，因此适宜的亚胺培南、哌拉西林、阿维巴坦的比例为1:16:1、1:8:1、1:4:1、1:2:1、1:1:1。从上表可以看出亚胺培南联合哌拉西林/阿维巴坦具有较好的协同，协同率高达95％，分布趋势见图1。当前第1页12当前第1页12