一种脂肪来源基质血管成分的提取装置及其提取方法与流程

本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种脂肪来源基质血管成分的提取装置及其提取方法。

背景技术：

脂肪组织是近年来软组织修复领域一种重要的再生修复资源，可以通过抽脂手术轻松获取，且手术风险低，对患者损伤小。一些临床研究发现脂肪来源的基质血管成分(stromalvascularfraction,svf)具有明显的抗炎和早期血管化作用，添加svf的脂肪组织移植效果明显优于单纯的脂肪组织的效果，提示svf在组织修复和再生领域具有广阔的前景。

目前，从脂肪组织中分离提取svf的方式主要是通过酶消化或高速离心的方法进行。其中，酶消化法要求较高的无菌条件，并需要引入外源性生物酶，耗时较长，具有较高的潜在风险，多用于实验室条件下制备svf，尚未批准在临床进行应用。而高速离心法是一种机械制备方法，相对安全，但其提取的svf活性较差，对脂肪移植术后的改善效果仍有待提高。

因此，如何能够在不引入外源性生物试剂的前提下，高效、安全的制备高活性的svf一直是临床亟待解决的问题。

技术实现要素：

为解决以上问题，本发明提供一种脂肪来源基质血管成分的提取装置及其提方法，该提取装置用于提取脂肪组织中的基质血管成分，能够实现离体脂肪团块的离心运动、涡旋运动、震荡运动、离心震荡运动、涡旋震荡运动，该方法提取基质血管成分具有提取效率高、细胞活性好、不引入酶液等优点。血管基质成分中含有的多种细胞成分可以广泛用于脂肪移植、软骨修复等多向领域；其提取方法中采用的涡旋震荡所得的基质血管成分的活细胞数高、增殖能力强，提取方法简单，成本低，安全高效，易操作实施。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以解决。

(一)一种脂肪来源基质血管成分的提取装置，其特征在于，包括：底板、安装板、托盘、试管架、第一驱动装置、第二驱动装置和第三驱动装置；其中，所述底板的上端固定有第一限位管，所述安装板的底端固定有与第一限位管相匹配的第二限位管，所述第一限位管滑动套入所述第二限位管内；所述底板上通过第一驱动装置驱动所述安装板上下运动；所述安装板的中部上端通过第二驱动装置驱动所述托盘水平转动；所述托盘的上端通过第三驱动装置驱动试管架水平转动；所述试管架包含连杆和支撑架，所述连杆的下端与所述第三驱动装置的输出轴固定连接；所述连杆的上端可拆卸的固定有支撑架，所述支撑架上周向对称设置有多个卡环，所述卡环用于卡住试管；所述安装板的上端左右对称固定有第一支架，所述第一支架上固定有托轮，所述托盘的底端设置有与所述托轮相匹配的滑轨。

根据本发明的脂肪来源基质血管成分的提取装置，安装板上的第二限位管可在底板上的第一限位管内上、下相对滑动，第一驱动装置驱动安装板上下震动，进而带动与安装板连接的试管架上下震荡运动。试管架上的多个卡环用于一次性放置多个试管，试管内用于放置待提取物(本申请中的待提取物为离体脂肪团块)，提高待提取物的工作效率；连杆与支撑架可拆卸连接，可根据实际需求换用不同的支撑架。安装板的两侧的第一支架上的托轮可在托盘上的滑轨上滑动，第一支架上的托轮用于支撑托盘水平旋转，第二驱动装置用于驱动托盘水平旋转，实现待提取物围绕第二驱动装置的输出轴公转。第三驱动装置用于驱动试管架水平旋转，实现待提取物围绕第三驱动装置的输出轴自转，进而实现待提取物的离心运动。本发明的脂肪来源基质血管成分的提取装置通过待提取物的自转和公转的相结合，实现待提取物的涡旋运动；通过第一驱动装置实现待提取物的震荡运动，通过第三驱动装置实现待提取物的离心运动。

作为优选的，所述支撑架与所述卡环铰接或焊接。

根据本发明的脂肪来源基质血管成分的提取装置，本发明的支撑架分为两种类型，一种是支撑架与卡环铰接，另一种支撑架与卡环焊接一体成型。当需要对待提取物进行离心时，选择支撑架与卡环铰接的支撑架，在第三驱动装置的作用下，卡环上的试管被甩起来，根据物质分子量大小的不同实现待提取物的离心。当需要对待提取物做涡旋运动时，选择支撑架与卡环焊接连接的支撑架，在第二驱动装置和第三驱动装置的作用下，实现待提取物的涡旋运动。

作为优选的，所述连杆的顶端具有螺孔，所述支撑架的中心具有通孔，所述螺孔和通孔内装配有手拧螺丝，所述手拧螺丝穿过通孔并拧入螺孔内将支撑架与连杆固定连接。

根据本发明的脂肪来源基质血管成分的提取装置，手拧螺丝的螺杆穿过支撑架上的通过并拧入连杆的螺孔内，实现连杆与支撑架的可拆卸连接，进而可以根据实际需求换用做涡旋运动或离心运动的支撑架。

作为优选的，所述第一驱动装置包含第一电机、凸轮和滚轮；其中，所述底板的中部通过第二支架固定安装有第一电机，所述第一电机的输出轴上固定有凸轮，所述安装板上与所述凸轮相对的位置设置有滚轮。

根据本发明的脂肪来源基质血管成分的提取装置，第一电机通过第二支架固定在底板上，第一电机的输出轴带动凸轮做圆周运动，通过凸轮带动滚轮上下移动，实现待提取的上下震荡运动。此外，凸轮上具有对称的两个凸起部，凸轮在做一次圆周运动过程中，可使待提取物震荡两次，提高待提取物的提取效率。

作为优选的，所述第二驱动装置包含第二电机，所述第二电机固定于所述安装板的中部，所述第二电机的输出轴与所述托盘固定连接。

根据本发明的脂肪来源基质血管成分的提取装置，第二电机的输出轴与托盘固定连接，通过第二电机驱动托盘水平旋转，托盘上试管架可围绕第二电机的输出轴做公转运动。

作为优选的，所述第三驱动装置包含第三电机，所述第三电机具有安装座，所述托盘的中心开设有离心槽，所述托盘沿径向或/和周向均匀开设有多个涡旋槽；所述离心槽与所述涡旋槽分别与所述安装座可拆卸连接；所述第三电机的输出轴与所述连杆通过联轴器连接。

根据本发明的脂肪来源基质血管成分的提取装置，第三电机的底部的安装座与托盘上的离心槽或涡旋槽为可拆卸连接，根据实际需求，可将第三电机固定在托盘上的不同位置。将第三电机固定在离心槽上时，启动第二电机，可实现待提取物的离心运动；当第三电机固定在涡旋槽上时，启动第二电机和第三电机，可实现待提取物的涡旋运动。此外，当第三电机固定在离心槽上时，启动第一电机和第二电机，可实现待提取物的离心震荡运动；当第三电机固定在涡旋槽上时，启动第一电机、第二电机和第三电机，可实现待提取物的涡旋震荡运动。托盘沿径向均匀开设有多个涡旋槽，可以调节第三电机距离第二电机输出轴的距离，实现待提取物沿不同半径做涡旋运动。托盘周向均匀开设有多个涡旋槽，可同时处理多个待提取物试样，处理效率高。

作为优选的，所述安装座的底端具有外螺纹，所述离心槽和涡旋槽上分别具有与所述外螺纹相匹配的螺孔。

根据本发明的脂肪来源基质血管成分的提取装置，安装座通过相互匹配的外螺纹与螺孔上的内螺纹实现与离心槽和涡旋槽的可拆卸连接，便于调节第三电机的位置及对其进行固定。

作为优选的，还包括弹簧，所述弹簧的两端分别与底板和安装板固定连接。

根据本发明的脂肪来源基质血管成分的提取装置，弹簧的弹性作用用于支撑安装板，减少凸轮与滚轮的压力。

作为优选的，还包括保护罩，所述保护罩用于罩住整个脂肪来源基质血管成分的提取装置。

根据本发明的脂肪来源基质血管成分的提取装置，保护罩用于提供无菌及控温环境，使待提取物在4-37℃之间进行提取或储存，减少环境对待提取物的污染。

(二)一种脂肪来源基质血管成分的提取方法，包括以下步骤：

步骤1，将离体脂肪团块的组织筋膜剔除，剪碎，得颗粒物；

步骤2，向所述颗粒物中加入生理盐水，涡旋震荡，得混悬液；

步骤3，对所述混悬液进行离心，得离心物；

步骤4，对所述离心物进行过滤，得基质血管成分。

作为优选的，步骤2中，所述涡旋震荡的频率为5～50hz，涡旋震荡的时间为2～25min。

进一步优选的，步骤2中，所述涡旋震荡的频率为30hz，涡旋震荡的时间为15min。

作为优选的，步骤3中，所述离心的转速为500～1500rpm，离心的时间为1～5min。

进一步优选的，步骤3中，所述离心的转速为1000rpm，离心的时间为2min。

附图说明

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。

图1为静息状态下的脂肪团块的结构示意图；

图2为现有技术中高速离心状态下的脂肪团块的结构示意图；

图3为本申请的涡旋震荡状态下的脂肪团块的结构示意图；

图4是本发明的脂肪来源基质血管成分的提取装置的结构示意图；

图5是图4中试管架的第一种结构示意图；

图6是图5的俯视图；

图7是图4中试管架的第二种结构示意图；

图8是图7中的支撑架的俯视图；

图9为不同处理方法下提取的svf悬液台盼蓝染色结果；其中，纵坐标为活细胞数(cellcounts)，单位为×10⁵；横坐标为不同的处理方法，分别为低频涡旋震荡(vibration)、酶消(enzymedigestion)、高速离心(centrifugation)、纳米乳化(nanoemulsion)；

图10为不同处理方法下提取的svf悬液的增殖能力试验结果；其中，横坐标为天数(days)，纵坐标为在450nm处的吸光度值(absorbanceof450od)；

图11为不同处理方法下提取的svf悬液的b超检测结果；其中，横坐标为时间，单位为周(week)；纵坐标为体积维持率(survivalrate)，单位为％；

图12为不同处理方法下提取的svf悬液植入6个月后的油红o染色试验结果；其中，图中上方从左到右分别为a-震荡组、b-酶消组；图中下方从左到右分别为c-离心组、d-乳化组；

图13为不同处理方法下提取的svf悬液植入6个月后的he染色试验结果；其中，图中上方从左到右分别为a-震荡组、b-酶消组；图中下方从左到右分别为c-离心组、d-乳化组。

在以上图中：1底板；101第一限位管；102第二支架；2安装板；201第二限位管；202第一支架；203托轮；3托盘；301离心槽；302涡旋槽；4试管架；410连杆；420支撑架；421卡环；422通孔；430试管；440手拧螺丝；5第一电机；501凸轮；502滚轮；6第二电机；7第三电机；701安装座；8弹簧。

具体实施方式

图1为静息状态下的脂肪团块的结构示意图；由图1可知，脂肪细胞和svf细胞均匀分布在试管内。

图2为现有技术中高速离心状态下的脂肪团块的结构示意图；由图2可知，在高速离心状态下(离心转速在1500rpm时)，脂肪细胞受压变形挤在一块，svf艰难地从脂肪细胞之间狭窄的缝隙中穿过，并向管底下沉，且svf受压发生形变，活性受到影响。由此可知，高速离心状态下脂肪细胞与svf细胞分离较为困难，提取的svf细胞的活性较弱。

图3为本申请的涡旋震荡状态下的脂肪团块的结构示意图；由图3可知，在涡旋震荡状态下，脂肪细胞之间的间隙随震荡运动呈现出节律性的扩大或缩小，在增大的细胞间隙处，svf细胞能顺利从间隙内通过并向管底下沉。由此可知，涡旋震荡有利于脂肪细胞与svf细胞的分离，便于提取svf细胞，且提取的svf细胞的活性较强。

参考图4-6，根据本发明的内容的实施例所提出的一种脂肪来源基质血管成分的提取装置，包括：底板1、安装板2、托盘3、试管架4、第一驱动装置、第二驱动装置和第三驱动装置；其中，所述底板1的上端固定有第一限位管101，所述安装板2的底端固定有与第一限位管101相匹配的第二限位管201，所述第一限位管101滑动套入所述第二限位管201内；所述底板1上通过第一驱动装置驱动所述安装板2上下运动；所述安装板2的中部上端通过第二驱动装置驱动所述托盘3水平转动；所述托盘3的上端通过第三驱动装置驱动试管架4水平转动；所述试管架4包含连杆410和支撑架420，所述连杆410的下端与所述第三驱动装置的输出轴固定连接；所述连杆410的上端可拆卸的固定有支撑架420，所述支撑架420上周向对称设置有多个卡环421，所述卡环421用于卡住试管430；所述安装板2的上端左右对称固定有第一支架202，所述第一支架202上固定有托轮203，所述托盘3的底端设置有与所述托轮203相匹配的滑轨。

在以上实施例中，安装板2上的第二限位管201可在底板1上的第一限位管101内上、下相对滑动，第一驱动装置驱动安装板2上下震动，进而带动与安装板2连接的试管架4上下震荡运动。试管架4上的多个卡环421用于一次性放置多个试管430，试管430内用于放置待提取物(本申请中的待提取物为离体脂肪团块)，提高待提取物的工作效率；连杆410与支撑架420可拆卸连接，可根据实际需求换用不同的支撑架420。安装板2的两侧的第一支架202上的托轮203可在托盘3上的滑轨上滑动，第一支架202上的托轮203用于支撑托盘3水平旋转，第二驱动装置用于驱动托盘3水平旋转，实现待提取物围绕第二驱动装置的输出轴公转。第三驱动装置用于驱动试管架4水平旋转，实现待提取物围绕第三驱动装置的输出轴自转，进而实现待提取物的离心运动。本发明的脂肪来源基质血管成分的提取装置通过待提取物的自转和公转的相结合，实现待提取物的涡旋运动；通过第一驱动装置实现待提取物的震荡运动，通过第三驱动装置实现待提取物的离心运动。

参考图5-8，根据本发明的一个实施例，所述支撑架420与所述卡环421铰接或焊接。

在以上实施例中，本发明的支撑架420分为两种类型，一种是支撑架420与卡环421铰接(如图5-6所示)；另一种是支撑架420与卡环焊接一体成型(如图7-8所示)。当需要对待提取物进行离心时，选择支撑架420与卡环421铰接的支撑架420，在第三驱动装置的作用下，卡环421上的试管430被甩起来，根据物质分子量大小的不同实现待提取物的离心。当需要对待提取物做涡旋运动时，选择支撑架420与卡环421焊接连接的支撑架420，在第二驱动装置和第三驱动装置的作用下，实现待提取物的涡旋运动。

参考图4-8，根据本发明的一个实施例，所述连杆410的顶端具有螺孔，所述支撑架420的中心具有通孔422，所述螺孔和通孔422内装配有手拧螺丝440，所述手拧螺丝440穿过通孔422并拧入螺孔内将支撑架420与连杆410固定连接。

在以上实施例中，手拧螺丝440的螺杆穿过支撑架420上的通过并拧入连杆410的螺孔内，实现连杆410与支撑架420的可拆卸连接，进而可以根据实际需求换用做涡旋运动或离心运动的支撑架420。

参考图4，根据本发明的一个实施例，所述第一驱动装置包含第一电机5、凸轮501和滚轮502；其中，所述底板1的中部通过第二支架102固定安装有第一电机5，所述第一电机5的输出轴上固定有凸轮501，所述安装板2上与所述凸轮501相对的位置设置有滚轮502。

在以上实施例中，第一电机5通过第二支架102固定在底板1上，第一电机5的输出轴带动凸轮501做圆周运动，通过凸轮501带动滚轮502上下移动，实现待提取的上下震荡运动。此外，凸轮501上具有对称的两个凸起部，凸轮501在做一次圆周运动过程中，可使待提取物震荡两次，提高待提取物的提取效率。

参考图4，根据本发明的一个实施例，所述第二驱动装置包含第二电机6，所述第二电机6固定于所述安装板2的中部，所述第二电机6的输出轴与所述托盘3固定连接。

在以上实施例中，第二电机6的输出轴与托盘3固定连接，通过第二电机6驱动托盘3水平旋转，托盘3上试管架4可围绕第二电机6的输出轴做公转运动。

参考图4，根据本发明的一个实施例，所述第三驱动装置包含第三电机7，所述第三电机7具有安装座701，所述托盘3的中心开设有离心槽301，所述托盘3沿径向或/和周向均匀开设有多个涡旋槽302；所述离心槽301与所述涡旋槽302分别与所述安装座701可拆卸连接；所述第三电机7的输出轴与所述连杆410通过联轴器连接。

在以上实施例中，第三电机7的底部的安装座701与托盘3上的离心槽301或涡旋槽302为可拆卸连接，根据实际需求，可将第三电机7固定在托盘3上的不同位置。将第三电机7固定在离心槽301上时，启动第三电机7，可实现待提取物的离心运动；当第三电机7固定在涡旋槽302上时，启动第二电机6和第三电机7，可实现待提取物的涡旋运动。此外，当第三电机7固定在离心槽301上时，启动第一电机5和第二电机6，可实现待提取物的离心震荡运动；当第三电机7固定在涡旋槽302上时，启动第一电机5、第二电机6和第三电机7，可实现待提取物的涡旋震荡运动。托盘3沿径向均匀开设有多个涡旋槽302，可以调节第三电机7距离第二电机6输出轴的距离，实现待提取物沿不同半径做涡旋运动。托盘3周向均匀开设有多个涡旋槽302，可同时处理多个待提取物试样，处理效率高。

参考图4，根据本发明的一个实施例，所述安装座701的底端具有外螺纹，所述离心槽301和涡旋槽302上分别具有与所述外螺纹相匹配的螺孔。

在以上实施例中，安装座701通过相互匹配的外螺纹与螺孔上的内螺纹实现与离心槽301和涡旋槽302的可拆卸连接，便于调节第三电机7的位置及对其进行固定。

参考图4，根据本发明的一个实施例，还包括弹簧8，所述弹簧8的两端分别与底板1和安装板2固定连接。

在以上实施例中，弹簧8的弹性作用用于支撑安装板2，减少凸轮501与滚轮502的压力。

根据本发明的一个实施例，还包括保护罩，所述保护罩用于罩住整个脂肪来源基质血管成分的提取装置。

在以上实施例中，保护罩用于提供无菌及控温环境，使待提取物在4-37℃之间进行提取或储存，减少环境对待提取物的污染。

实施例1

一种脂肪来源基质血管成分的提取方法，包括以下步骤：

步骤1，将离体脂肪团块的组织筋膜剔除，剪碎，得颗粒物。

步骤2，向颗粒物中加入生理盐水(生理盐水采用浓度为0.9％的氯化钠溶液，其用量为浸没颗粒物即可)，并在频率为30hz条件下涡旋震荡15min，得混悬液。

步骤3，将混悬液在1000rpm转速条件下离心2min，得离心物。

步骤4，对离心物采用100目的滤网进行过滤，获取管底的基质血管成分，即得。

实施例2

一种脂肪来源基质血管成分的提取方法，包括以下步骤：

步骤1，将离体脂肪团块的组织筋膜剔除，剪碎，得颗粒物。

步骤2，向颗粒物中加入生理盐水(生理盐水采用浓度为0.9％的氯化钠溶液，其用量为浸没颗粒物即可)，并在频率为50hz条件下涡旋震荡2min，得混悬液。

步骤3，将混悬液在500rpm转速条件下离心5min，得离心物。

步骤4，对离心物采用100目的滤网进行过滤，获取管底的基质血管成分，即得。

实施例3

一种脂肪来源基质血管成分的提取方法，包括以下步骤：

步骤1，将离体脂肪团块的组织筋膜剔除，剪碎，得颗粒物。

步骤2，向颗粒物中加入生理盐水(生理盐水采用浓度为0.9％的氯化钠溶液，其用量为浸没颗粒物即可)，并在频率为5hz条件下涡旋震荡25min，得混悬液。

步骤3，将混悬液在1500rpm转速条件下离心1min，得离心物。

步骤4，对离心物采用100目的滤网进行过滤，获取管底的基质血管成分，即得。

实施例4

一种脂肪来源基质血管成分的提取方法，包括以下步骤：

步骤1，将离体脂肪团块的组织筋膜剔除，剪碎，得颗粒物。

步骤2，向颗粒物中加入生理盐水(生理盐水采用浓度为0.9％的氯化钠溶液，其用量为浸没颗粒物即可)，并在频率为20hz条件下涡旋震荡20min，得混悬液。

步骤3，将混悬液在1200rpm转速条件下离心1.5min，得离心物。

步骤4，对离心物采用100目的滤网进行过滤，获取管底的基质血管成分，即得。

将所得的基质血管成分(svf)配置成混悬液，接着与脂肪团块混合后，得脂肪；将脂肪注射入受植区。制备的基质血管成分注射后具有易于血管化、细胞活性好的特点。配合自体脂肪移植技术可提高自体脂肪移植术后体积留存率。此外svf还可与多种药物及材料搭配，用于治疗骨关节炎、软骨修复等疾病。同时，本申请研究表明，涡旋震荡在频率为30hz、时间为15min条件下，对基质血管成分的提取效果最佳。

试验1

1)试验方法

在无菌条件下提取家兔背部脂肪组织，剔除筋膜后分为四等份，分别采用低频涡旋震荡(vibration)、高速离心(centrifugation)、酶消(enzymedigestion)、纳米乳化(nanoemulsion)的方法进行处理，提取svf，并配置成1ml的svf悬液，通过台盼蓝染色(trypanbluestaining)观测其制备的即刻的活细胞数，试验结果如图9所示；并采用cck-8检测观察其增殖能力，试验结果如图10所示。

2)试验结果

由图9可知，采用低频涡旋震荡提取的svf的即刻的活细胞数明显高于高速离心、酶消和纳米乳化三种方法。由图10可知，cck8检测结果显示采用低频涡旋震荡提取的svf增殖活性明显高于高速离心和纳米乳化法，而与酶消化法接近。

试验2

1)试验方法

进一步的，通过动物实验验证在体内环境下涡旋震荡法的这种优势是否仍然显著。将24只雄性家兔分为4组，每组6只，每一只家兔分别进行如下实验：取家兔背部脂肪，采用等量的无菌脂肪团分别用上述四种方法处理获得svf混悬液后，各自与1g脂肪团块进行混合，并植入兔耳背部皮下组织，构建兔耳自体脂肪移植模型。采用b超检测(b-ultrasoundexamination)观察脂肪团体积变化趋势，试验结果如图11所示；并依照组别，分别于术后2周、1月、3月、6月时处死取材，进行油红o染色和he染色明确成脂效果，其中油红o染色试验结果如图12所示，he染色试验结果如图13所示。

2)试验结果

由图11可知，b超结果显示，各种不同方法随时间变化趋势可见在脂肪移植术后远期(6个月时)，涡旋震荡组的体积维持率明显高于其他各组，其次为离心组、酶消组和纳米乳化组。

由图12和图13可知，涡旋震荡法和离心法成脂效果更均匀，而酶消组和纳米乳化组则可见较多结缔组织长入，脂滴更小，分布不均匀。

综上，涡旋震荡法提取的svf具有较高的细胞活性，具有很好的临床转化潜力。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些改动和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。