一种具有降血压、抗血栓作用的口服液的制作方法

本发明属生物制剂技术领域，具体涉及一种具有降血压、抗血栓作用的口服液。

背景技术：

1913年，Kylin从掌状海带中提取出一种含L-岩藻糖的多糖，命名为Fucoidan，中文名称为墨角藻多糖、岩藻多糖或褐藻糖胶。此后，又陆续报道褐藻糖胶的分子中含有硫酸酯、半乳糖、木糖、糖醛酸等，褐藻糖胶是高度不均一的多糖。研究表明，褐藻糖胶具有许多生物学活性，具有抗凝血、抗病毒、抗血栓、降血压和抗肿瘤等功能，尤其是其较好的抗凝血活性，日益引起人们广泛的关注，在抗凝血药物方面有较大的市场潜力。

中国的海带养殖量在国内外处于领先地位，其岩藻聚糖含量达到3.6％，是我国褐藻资源中岩藻糖含量最高的一种褐藻，可以作为开发和利用海带褐藻糖胶的原材料，加工的海带中含有丰富的褐藻酸钠、碘以及甘露醇，而加工随之产生大量褐藻糖胶，经常作为废弃物丢弃，造成了很大的资源浪费。而目前关于岩藻聚糖硫酸酯尤其是低分子质量海带岩藻聚糖硫酸酯制备及应用的研究还相对较少。

现有技术如授权公告号为CN 104256252 B的中国发明专利，该发明涉及一种辅助降血压保健制品，提供一种分步提取与生物转化偶联制备辅助降血压保健海带制品的方法，属于海洋食品精深加工领域。该方法以优质海带为原料，采用循环超声分步浸提工艺与生物转化偶联制备技术，制备步骤依次为：原料预处理、醇提甘露糖醇、酸提醇沉褐藻胶和褐藻糖胶、生物转化、超滤，得到降血压生理活性组分并进行科学配伍。该发明方法针对我国传统大宗海产品海带进行精深加工和综合利用，得到具有降血压功能的甘露糖醇、褐藻胶、褐藻糖胶、海带膳食纤维和海带降血压肽五个产品。对这五个产品进行科学配伍，开发系列具有显著辅助降血压功能的新型海带降血压功能性制品。该制品ACE抑制活性IC50为0.68～1.15mg/g，显著降低SHR大鼠血压(-12.4～-17.5)mmHg。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种具有降血压、抗血栓作用的口服液及其制备方法，该方法能够缩短硫酸酯基的共价键长，增加共价键强度，减少硫酸根的脱落，该口服液中褐藻胶分子量低，易吸收，能够减少红细胞膜中饱和脂肪酸的形成，提高红细胞膜表面受体唾液酸含量，降低血液粘度，具有较好的抗血栓效用。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

提供一种具有降血压、抗血栓作用的口服液，口服液的制备方法，包括：

S1、海带多糖的提取；

S2、褐藻糖胶的分离纯化；

S3、自由基氧化降解褐藻糖胶；

S4、溶解；

S5、粗滤；

S6、风味调配；

S7、杀菌；

S8、灌装、封口；

其中，步骤S3褐藻糖胶氧化降解过程中添加有氯化胆碱。自由基降解褐藻多糖的生产方法相对简单，产品质量易于控制，有利于实现工业化生产，但是过于剧烈的反应条件会破坏糖链的结构，脱硫酸根程度也会增加，褐藻糖胶氧化降解时添加氯化胆碱，硫酸酯基吸附带正电的胆碱，酯基上的O从胆碱的羟基给电子基团吸电子，缩短硫酸酯基的共价键长，增加了共价键强度，从而减少硫酸根的脱落，提高硫酸根含量，提高低分子褐藻糖胶的生物活性。

在一些实施方式中，步骤S3自由基氧化降解褐藻糖胶的方法包含：

a、配制85-100mg/mL褐藻糖胶溶液，加入醋酸铜至0.038-0.042mol/L；

b、加入氯化胆碱至0.032-0.036mol/L，静置0.8-1.2h；

c、59-61℃下，以恒定流速加入质量体积分数为4.4-4.6％的H2O2溶液，反应5-6h；

d、反应液用0.22μm滤膜过滤，

e、取滤液，用螯合树脂洗脱；

f、旋蒸后浓缩冻干，得低分子量褐藻糖胶；

其中，所述步骤a-步骤c整个过程保持pH在7.2-7.8。本发明提供的自由基氧化降解条件所得到的产物分子量较低，同时硫酸根含量较高，因此具有较高的生物活性和生物利用度。

在一些实施方式中，步骤S1采用超声波法提取海带多糖。采用超声波法提取海带多糖得率和生物活性较高，同时减少色素等杂质析出，简化提取纯化流程。

在一些实施方式中，超声波提取海带多糖的方法为：按照1:70-75(g/mL)的比例向蒸馏水中加入干海带粉，62-68℃下超声波处理55-65min。海带具有很强的溶胀性，固液比太高时溶胀不充分，提取率低，超过适当溶胀度的固液比时，溶胀过度亦导致提取率下降；超声波是通过机械剪切力来辅助提取的，超声时间太短，机械剪切作用不充分，提取率不高，超声时间太长，会使大分子多糖断链，亦使提取率降低；温度升高会使液体介质的表面张力和粘度降低，加快溶液的扩散，促使细胞内的多糖向外扩散，但温度过高时，多糖结构的局部会遭到破坏。

在一些实施方式中，步骤S2采用乙醇重沉淀法进行分离纯化。乙醇分级沉淀法操作简便且条件易控制，适合大规模的分离纯化。

在一些实施方式中，乙醇重沉淀分离纯化褐藻糖胶的方法为：超声波处理后，过滤，将滤液浓缩至18-25％原体积，加入90-95％乙醇至浓度为28-32％；过滤，再将滤液浓缩至1/5体积，加入90-95％的乙醇至浓度为59-61％，静置11-13h；收集沉淀，冷冻干燥。本发明提供的滤液浓缩倍数、乙醇加量以及乙醇质量分数为最佳醇析条件，褐藻糖胶得率较高。

在一些实施方式中，步骤S1提取海带多糖之前对海带进行脱脂处理。多糖是极性强的大分子化合物，对原料进行脱脂可以使水溶液更容易深入原料内部，有利于多糖的溶出。

在一些实施方式中，步骤S6风味调配的方法为：过滤后的褐藻糖胶溶液中加入0.13-0.17％(w/w)的β-环糊精、13-17％(w/w)的木糖醇、0.13-0.17％(w/w)的柠檬酸及适量的香精，搅拌均匀。本发明提供的风味调制技术，从味觉、嗅觉、视觉等方面调整产品的颜色、香味、使产品酸甜适口，口感纯正。

在一些实施方式中，褐藻糖胶上接枝生物素。低分子质量的褐藻糖胶具有一定的抗血栓活性，出血危险性也较低，低分子质量的褐藻糖胶主要是通过抗凝血、抗血小板活化和纤溶功能发挥抗血栓作用。低分子质量的褐藻糖胶具有一定的抗血栓活性，出血危险性也较低，低分子质量的褐藻糖胶主要是通过抗凝血、抗血小板活化和纤溶功能发挥抗血栓作用。血栓形成因素中有一条重要原因就是由于血液流变学的改变，致使血液粘稠，血流变慢，加大了血管内皮受损和栓塞形成的可能性。褐藻糖胶上接枝生物素后，能够提高红细胞内SOD水平，改善红细胞膜表面的氧化特性，对抗并阻断氧自由基对红细胞的伤害，减少细胞膜中饱和脂肪酸的形成，提高细胞膜的流动性、降低粘度，同时能够提高红细胞膜表面受体唾液酸含量，减小红细胞的聚集指数，总之，接枝生物素后的褐藻糖胶能够使全血粘度、血浆黏度、红细胞压积、红细胞沉降率及血沉方程K值均显著降低，提高血细胞的变形能力，从而明显改善血液流变学，提高抗血栓效用。

在一些实施方式中，口服液还具有抗病毒、抗肿瘤以及提高免疫力的作用。本发明提供的褐藻糖胶口服从海带中提取，经过降解，修饰，具有分子量小，易吸收的特点，且抗病毒、抗肿瘤以及提高免疫力的生物活性较高。

本发明的有益效果为：

1)本发明通过对自由基氧化降解褐藻糖胶的方法进行改进，缩短硫酸酯基的共价键长，增加共价键强度，减少硫酸根的脱落，提高硫酸根含量，提高低分子褐藻糖胶的生物活性；

2)本发明通过对海带脱脂处理，对超声波处理条件、醇沉条件进行优化，提高了多糖的提取率和褐藻淀粉的得率；

3)本发明通过对低分子量褐藻糖胶接枝多肽，改善红细胞膜表面的氧化特性，减少细胞膜中饱和脂肪酸的形成，提高细胞膜的流动性、降低粘度，同时能够提高红细胞膜表面受体唾液酸含量，减小红细胞的聚集指数，提高抗血栓效用。

附图说明

图1为本发明的试验例1的示意图；

图2为本发明的试验例2的示意图；

图3为本发明的试验例3的示意图；

图4为本发明的试验例4的示意图；

图5为本发明的红细胞膜表面唾液酸含量，SOD、MDA水平的示意图；

图6为本发明的150s^-1和10s^-1切变率下全血粘度，血浆粘度的示意图；

图7为本发明的红细胞压积、红细胞沉降率、血沉方程K值的示意图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述：

实施例1：

一种褐藻糖胶的制备方法，包括：

称取海带干粉5g，加入蒸馏水312.5mL后，65℃下超声波超声处理60min，后加入1/3体积的sevage试剂，磁力搅拌器搅拌30min后，1000rpm离心15min，收集上清，重复5次，用截流量为3500膜透析，减压浓缩至1/5体积，加入质量分数为95％的乙醇至浓度为30％，静置，过滤，再将滤液浓缩至1/5体积。加入95％乙醇至浓度为60％，静置12h，收集沉淀，冷冻干燥至恒重。

实施例2：

一种褐藻糖胶的制备方法，包括：

取80g海带干粉，加入5倍体积的质量分数为95％的乙醇，超声波脱脂25min，真空条件下进行抽滤，收集滤渣，重复3次，烘干滤渣，粉粹过80目筛。

称取80目海带干粉5g，加入蒸馏水312.5mL后，65℃下超声波超声处理60min，后加入1/3体积的sevage试剂，磁力搅拌器搅拌30min后，1000rpm离心15min，收集上清，重复5次，用截流量为3500膜透析，减压浓缩至1/5体积，加入质量分数为95％的乙醇至浓度为30％，静置，过滤，再将滤液浓缩至1/5体积。加入95％乙醇至浓度为60％，静置12h，收集沉淀，冷冻干燥至恒重。

取4.5g褐藻糖胶溶于蒸馏水，配制成100mg/mL溶液，然后加入醋酸铜至Cu²⁺浓度为0.035mol/L，用2mol/L NaOH溶液调pH至7.5左右，加入氯化胆碱至0.032mol/L，静置1h，水浴加热至溶液温度达到60℃，然后以12mL/h的速度加入质量体积分数我4.5％的H2O2溶液，反应5h后停止加入H2O2溶液，用2mol/L NaOH溶液调pH至7.5左右。反应液过0.22um的滤膜，除去形成沉淀的Cu²⁺。再加入Chelex100螯合树脂除去残留的游离Cu²⁺，用截留分子量为1000Da的超滤设备除去绝大部分盐，再用截留分子量为500Da的透析袋透析脱盐，旋蒸后浓缩冻干，得低分子褐藻糖胶。

称取2g低分子褐藻糖胶溶于甲酰胺，80℃下搅拌35min，将生物素溶于含1％1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的甲酰胺中，滴加到多糖溶液中，反应5h后，将反应液倒出，用85％的乙醇沉淀，95％的乙醇洗涤沉淀2次，将沉淀溶于200mL蒸馏水中，2000Da透析袋自来水透析2d，蒸馏水透析1d，浓缩冻干，得生物素接枝的褐藻糖胶。

实施例3：

一种具有降血压、抗血栓作用的口服液的制备方法，包括：

溶解：将制得的褐藻胶加水溶解，得到10mg/mL的褐藻胶溶液；

粗滤：除去不溶杂质；

风味调配：过滤后的褐藻胶寡糖溶液中加入0.15％(w/w)的β-环糊精、15％(w/w)的木糖醇、0.15％(w/w)的柠檬酸及适量的香精，搅拌均匀；

杀菌：采用高压蒸汽灭菌，121℃杀菌30min；

灌装、封口：灌装采用20mL棕色口服液玻璃瓶，灌装前需对空瓶和瓶盖进行清洗消毒。

制得的口服液海带腥味胶轻，色泽呈深褐色或棕褐色，味道酸甜适度，口感细腻，没有异味，外观澄清透明，无肉眼可见杂质，允许有少量浑浊或沉淀，感官评价98分。

对比例1：

褐藻糖胶氧化降解时未加入氯化胆碱，其余部分和实施例2完全一致。

对比例2：

未对降解后的低分子褐藻糖胶进行修饰，其余部分和实施例2完全一致。

试验例1：

分子量的测定

将褐藻糖胶氧化降解后的反应液分别用截留分子量为10kDa、6kDa、2.5kDa和300Da的超滤膜进行超滤，得到四个组分Fa(6k Da～10kDa)、Fb(2.5kDa～6kDa)、Fc(300Da～2.5kDa)和Fd(小于300Da)，分别浓缩冻干。

采用苯酚—硫酸法进行总糖的测定；采用高效液相色谱法进行分子量测定。高效液相色谱图见图1。高效液相色谱法(HPLC)的测定条件如下：色谱柱为TSK-gel G2500PWxl，流动相为0.2mol/L NaCl，洗脱速度为0.5mL/min，柱温保持40℃，采用示差检测器检测，以右旋糖酐标准品，分别以标准品的保留时间和分子量的对数为横纵坐标，制作标准曲线。采用Agillent GPC软件计算样品洗脱峰的重均分子量(Mw)和数均分子量(Mn)，计算多分散系数D＝Mw/Mn。

高效液相色谱测得的褐藻糖胶氧化降解后的分子量分布图见图1。经计算得出降解后主要得到三个组分，各组分的重均分子量分别为7.42kDa、3.85kDa、1.51kDa，多分散系数分别为1.024、1.048、1.006。

试验例2：

硫酸根含量的测定：

根据试验例1所得3个组分的分子量，确定自由基氧化降解后，产物主要为重均分子量分别为7kDa、4kDa、1.5kDa的三个组分，采用截留分子量为10kDa、6kDa、2.5kDa和300Da的超滤膜和纳滤膜对降解产物进行分离，快速得到F1(6-10kDa)、F2(2.5-6kDa)和F3(小于2.5kDa)3个部分，分别浓缩冻干，采用离子色谱法测定硫酸根的含量。

将待测的3个组分在五氧化二磷于干燥器中减压干燥1h，称取3mg放入安瓿瓶中，加入1mL 2mol/L的三氟乙酸溶解，用氮气封管，后110℃水解8h；取出冷却至室温，60℃下，用氮气吹干三氟乙酸，再加入超纯水充分溶解，用氮气吹干，重复3次；加超纯水水溶解，定容至25mL。

色谱条件为：分离柱为Dionex Ionpac AS11-HC(4mm×250mm)；保护柱为Dionex Ionpac AG11-HC(4mm×50mm)；淋洗液为30mmol/L KOH，抑制器为ASRS ULTRAⅡ，抑制电流238mA，流速为1.0mL/min，进样体积25μL，程序时间8min。分别以标准品SO4^2-浓度和洗脱峰峰面积为横纵坐标制作标准曲线，每个样品做三个平行，取硫酸根峰面积的平均值，代入标准曲线计算各组分样品的硫酸根含量。硫酸根含量的测定结果见图2。

由图2可以看出，实施例2的F1(6-10kDa)、F2(2.5-6kDa)和F3(小于2.5kDa)三个不同分子量范围的组分中的硫酸根含量均高于对比例1，特别是F3组分，这说明，褐藻糖胶氧化降解时添加氯化胆碱，能够增加硫酸酯键强度，减少硫酸根的脱落，提高硫酸根含量。

试验例3：

降血压能力的测定：

取10周龄自发性高血压大鼠，体重400-420g，收缩压>180mmHg，适应性喂养1周后，随机分为2组，每组20只：

对照组：给蒸馏水；

给药组：给100mg/kg褐藻糖胶；

每日给药一次，共给药21d，每隔1d在给药后2h测定各组大鼠的血压，每只大鼠每次血压重复测定3次，取均值。大鼠血压的测定结果见图3。

由图3可以看出，实施例2对自发性高血压大鼠的降血压能力明显高于对比例1，这说明，褐藻糖胶氧化降解时添加氯化胆碱，能够提高硫酸根含量，从而提高低分子褐藻糖胶的降血压活性。

试验例4：

抗血栓能力的测定：

建立急性血於大鼠模型：取SD大鼠，随机分为对照组、模型组、给药组，每组20只，将模型组和给药组的大鼠用水合氯醛麻醉，分离左颈总动脉；铺展3cm×2cm薄膜将颈总动脉与周围组织隔离。用吸有20μL FeCl3溶液的1cm×1cm的滤纸包裹左颈总动脉，后去除纸片，生理盐水清洗后缝合颈部，滴注硫酸庆大霉素。给药组灌胃给药(褐藻胶寡糖100mg/kg)，每天1次，连续5天，对照组、模型组给予等容积蒸溜水。末次给药1h后，用10％的水合氯醛麻醉，仰卧位固定，剪取1cm血栓段血管，称重。剖开血管，除去管内血栓后再称取血管壁的重量。血栓湿重和血栓溶栓率的计算公式如下：

血栓湿重＝血栓和血管壁的湿重一血管壁的湿重

血栓溶栓率＝(模型组血栓湿重一给药组血栓湿重)/模型组血栓湿重×100％

血栓湿重和血栓溶栓率的测定结果见图4。

由图4可以看出，实施例2对急性血瘀大鼠模型的的血栓溶栓率明显高于对比例1、对比例2，这说明，褐藻糖胶氧化降解时添加氯化胆碱，能够提高硫酸根含量，提高低分子褐藻糖胶的抗血栓活性；低分子褐藻糖胶上接枝生物素后，能够提高抗血栓效用。

试验例5：

血液流变学指标的检测：

红细胞膜的制备：将上述给药组大鼠末次给药后空腹24h，眼眶取血。用新鲜肝素抗凝血4mL，3000rpm离心5min，取沉淀，加入5倍体积的等渗PBS稀释，1500rpm下离心5min，取沉淀，重复3次，得红细胞悬浮液，加入40倍体积的5mmol/L pH7.4的Tris-HCl预冷溶液，加入少量0.1mmol/L PMSF抑制蛋白，90Hz下超声处理10min，后4℃下静置4h，12000rpm离心10min，取沉淀，加入5mmol/L pH7.4的Tris-HCl，12000rpm离心10min，重复3次，得到近透明的膜。将其按照1∶1的比例悬浮在PBS溶液中。

红细胞膜表面生物学特性测定：分别根据相应的试剂盒说明书方法测定红细胞膜表面唾液酸含量，红细胞膜表面SOD、MDA水平。测定结果见图5。

血液流变学指标检测：取肝素抗凝血5mL，取全血1mL测定不同切变率下全血粘度，将血液在3000rpm条件下离心10min，取血浆1mL测定血浆粘度。微量毛细管法测定红细胞压积，wintrobe法测定红细胞沉降率，根据如下公式计算血沉方程K值：

K＝hEsn/[-(1-H+lnH)]

其中，hEsn为红细胞沉降率，H为红细胞压积。150s^-1和10s^-1切变率下全血粘度，血浆粘度测定结果见图6，红细胞压积、红细胞沉降率、血沉方程K值的测定结果见图7。

由图5可以看出，实施例2的红细胞表面唾液酸含量和红细胞膜表面SOD水平均明显高于对比例2；实施例2的血液流变学指标与模型组相比发生明显改变，而对比例2跟模型组相比没有明显改变，这说明，低分子褐藻糖胶上接枝生物素后，能够通过提高红细胞内SOD水平和提高红细胞膜表面受体唾液酸含量，提高细胞膜的流动性、降低粘度，减小红细胞的聚集指数，从而改善血液流变学，进一步提高抗血栓作用。

上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。

以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。