一种鬼臼毒素衍生物智能水凝胶及其制备和应用的制作方法

本发明涉及一种多重响应性智能水凝胶，尤其涉及一种鬼臼毒素衍生物多重响应性智能水凝胶及其制备方法，主要作为药物载体用于制备结肠靶向缓释药物中，属于生物医药领域。

背景技术：

鬼臼毒素是一种具有优异抗肿瘤活性的木脂素类化合物，其衍生物被广泛应用于包括小细胞肺癌、结肠癌、淋巴癌等癌症的治疗研究，并且已有依托泊苷和替尼泊苷两种药物被用于临床。针对鬼臼毒素类化合物存在的水溶性差和易产生耐药性的问题，目前对于鬼臼毒素的研究重点集中在三个方面，一是通过合成大量的鬼臼毒素衍生物，以期能够发现治疗效果更优的鬼臼毒素衍生物。二是以活性优异的鬼臼毒素衍生物为研究对象，通过药物控释载体的策略改善其水溶性和靶向性，最终提高其成药性。三是通过联合用药的策略改善其耐药性问题。GL-331是一种鬼臼毒素4β-芳基胺修饰的衍生物，其具有优异的DNA拓扑异构酶ΙΙ的抑制活性，活性为同类上市药物依托泊苷的5倍。因此，在改善GL-331水溶性基础上发展基于联合用用药策略的靶向控释载体对于其最终成药意义重大(K. H. Lee, et al. J. Med. Chem., 2004, 47, 5140-5148; W. Ha, et al. Carbohydr. Polym., 2011, 86, 513-519;.J. Yu, RSC Adv., 2014, 4, 58982-58989）。

人体结肠具有独特的菌群分布，可特异性产生诸如偶氮还原酶、糖苷酶等多种特殊酶系，这些酶系可有效降解含有聚多糖、偶氮类化合物等成分的药物载体，使药物在结肠定位释放，这类菌群触发型的给药系统具有特异性好、定位准确可靠等优点，并已有药物用于临床，如治疗肠炎的药物柳氮磺胺吡啶即利用结肠特有的偶氮还原酶实现药物在结肠的靶向释放。目前，菌群触发型给药系统的载体研究主要为单独使用聚多糖类或偶氮聚合物类材料，偶氮聚合物靶向性高、定位准确，但其降解产物毒性较大，聚多糖类材料生物相容性好，且具有独特的pH敏感特性，但其结肠靶向性效果难以控制。因此，结合GL-331的分子结构特点，将其通过偶氮键负载于聚多糖链上，进而构筑水凝胶材料，可在改善GL-331水溶性基础上充分利用结肠特有酶系，发展GL-331的结肠靶向给药系统，有效提高其成药性。此外，在前期研究中，我们以疏水药物分子为研究对象构筑了系列超分子水凝胶，并发现利用水凝胶高度亲水的内部结构可实现另外一种水溶性药物的高效负载。在负载GL-331的聚多糖水凝胶体系中，也可进一步负载水溶性抗癌药物，实现联合用药的目的(T. Nagano, et al. J. Am Chem.,2010, 132, 15846-15848; T. Cerchiara, et al. Carbohydr. Polym., 2016, 143, 124-130; W. Ha, et al. J. Mater. Chem. B, 2013, 1, 5532–5538; J. Yu, et al. RSC Advances, 2014, 4, 58982–58989; W. Ha, et al. ACS Appl. Mater. Interfaces2018, 10, 21149−21159.）。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种鬼臼毒素衍生物智能水凝胶的制备方法；

本发明的另一目的是提供上述鬼臼毒素衍生物智能水凝胶作为结肠靶向多药物控释载体在制备结肠靶向缓释药物中的应用。

一、鬼臼毒素衍生物智能水凝胶的制备及表征

本发明一种鬼臼毒素衍生物智能水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

（1）醛基化葡聚糖的制备及表征

将葡聚糖溶解到水中，加入高碘酸钠，室温搅拌2~5h；加入乙二醇继续搅拌1~3 h；然后在纯水中透析36 ~48 h，冻干，即得醛基化葡聚糖，标记为AD。AD的反应式如下：

其中，葡聚糖分子量为10000~100000，优选30000~60000；葡聚糖（按葡萄糖反应单元计）与高碘酸钠的摩尔比为1:0.5 ~1:5；葡聚糖与乙二醇的摩尔比为1: 0.5~1:5。

对得到的产物AD进行核磁共振分析（400 MHz），所使用的核磁共振仪为Bruker AVANCE Ш-400，溶剂为氘代二甲基亚砜。图1为AD的¹H-NMR谱图。在¹H-NMR谱图，9.63 ppm处的特征醛基氢信号证明葡聚糖中葡萄糖单元被成功氧化为醛基。

（2）偶氮键连接的鬼臼毒素衍生物的制备及表征

将4´-O-去甲-4β-溴-4-脱氧鬼臼毒素溶解于干燥的二氯甲烷中，氮气保护下加入缚酸剂碳酸钾搅拌2~10 min；再加入对二胺基偶氮苯室温搅拌2~12 h，然后过滤，减压浓缩，柱层析分离，即得偶氮键连接的鬼臼毒素衍生物，命名为4´-O-去甲-4β-对二胺基偶氮苯-4-脱氧鬼臼毒素，标记为GL331-azo。GL331-azo的反应式如下：

中间体4´-O-去甲-4β-溴-4-脱氧鬼臼毒素的合成参见文献方法J. Med. Chem,.1990, 33, 1364-1368)。其反应式如下：

4´-O-去甲-4β-溴-4-脱氧鬼臼毒素与碳酸钾的摩尔比为1: 0.1~ 1:10，优选1:1~ 1: 4；4´-O-去甲-4β-溴-4-脱氧鬼臼毒素与对二胺基偶氮苯的摩尔比为1:0.1~1:10，优选1:1~1:3。

对得到的产物GL331-azo进行核磁共振分析（400 MHz），所使用的核磁共振仪为Bruker AVANCE Ш-400，溶剂为氘代二甲基亚砜。图2、3分别为GL331-azo的¹H-NMR谱图和¹³C-NMR谱图。在¹H-NMR谱图，7.63-7.55,6.82-6.63 ppm处的峰显示出了偶氮苯骨架中的特征氢信号峰；6.83,6.57 ppm处的两个单峰为GL-331骨架中5位和8位的特征质子峰；6.01和5.99处的两个单峰为GL-331结构中-O-CH2-O-中的特征质子峰，5.00-3.05 ppm处的多组峰显示出了GL-331结构中其它质子的特征信号。¹³C-NMR谱图也显示出了偶氮苯结构单元和GL-331骨架中所有的特征碳信号。此外，高分辨质谱（HRMS）结果如下: C33H30N4O7Na for [M+Na]⁺, calculated 617.2007, found 617.2014。以上信息证明GL331-azo的结构式如上式所示。

（3）键合鬼臼毒素衍生物的醛基化葡聚糖制备及表征

将醛基化葡聚糖（AD）溶解到反应溶剂中，加入偶氮键连接的鬼臼毒素衍生物（GL331-azo），于60 ~75℃下搅拌12~36h；反应产物在纯水中透析48 ~72h，冻干，即得负载鬼臼毒素衍生物的醛基化葡聚糖，标记为AD-GL331。其反应式如下：

反应溶剂为水-二甲基甲酰胺（其中，水与二甲基甲酰胺的体积比为10:1~1:1）、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜中的任意一种。GL331-azo与醛基化葡聚糖AD（按葡萄糖反应单元计）的摩尔比为1:2~1: 20，优选为1:8 ~1:15。

对得到的产物AD-GL331进行核磁共振分析（400 MHz），所使用的核磁共振仪为Bruker AVANCE Ш-400，溶剂为氘代二甲基亚砜。图4为AD-GL331的¹H-NMR谱图。在¹H-NMR谱图，3.7，5.4-9.7 ppm处可见特征的GL331-azo结构中质子信号,2.9-4.8 ppm处可见特征的醛基化葡聚糖质子信号。以上信息表明GL331已成功通过偶氮键负载于葡聚糖链上。

（4）多重响应性智能水凝胶的制备

将负载鬼臼毒素衍生物的醛基化葡聚糖（AD-GL331）溶解于水中，再加入水溶性抗癌药物并超声2~10 min，然后加入羧甲基壳聚糖水溶液，超声5~10 min；混合物静置2~24 h，即得负载鬼臼毒素衍生物和水溶性抗癌药物的多重响应性水凝胶。

羧甲基壳聚糖的脱乙酰度为80%~95%，优选为85%~90%；羧甲基的取代度为60%~90%。优选为75%~85%。

水溶性抗癌药物为秋水仙碱、阿霉素、去氧氟尿苷、阿糖胞苷、奥沙利铂、表阿霉素、顺铂、卡铂、氟尿嘧啶中的任意一种。

多重响应性智能水凝胶中，键合鬼臼毒素衍生物的醛基化葡聚糖(AD-GL331)的质量浓度为1%~6%，优选为3%~5%；羧甲基壳聚糖的质量浓度为0.5%~4%，优选1%~3%；水溶性抗癌药物的质量浓度为0.1%~1%，优选为0.2%~0.5%。

二、多重响应性智能水凝胶性能测试

1、凝胶化与双药物负载

AD-GL331可溶解在水中形成均一的水溶液，从而有效改善鬼臼毒素衍生物的水溶性，当引入羧甲基壳聚糖溶液后，在超声条件下，可迅速转变为超分子水凝胶。凝胶的形成速度、强度取决于AD-GL331和羧甲基壳聚糖的浓度、比例。当羧甲基壳聚糖浓度为2wt%时，AD-GL331在浓度范围为1wt%~4wt%时均可形成负载鬼臼毒素衍生物的超分子水凝胶（见图5）。负载鬼臼毒素衍生物的超分子水凝胶在温和条件下即可生成，无需其他试剂或条件。这主要是因为醛基化葡聚糖链中剩余醛基与羧甲基壳聚糖链中氨基发生席夫碱反应从而产生交联点促使超分子水凝胶的形成。为了进一步负载另外一种亲水药物，0.1% ~ 1%的5-氟尿嘧啶和AD-GL331共同溶解于水中，加入2wt%羧甲基壳聚糖，在超声条件下即可得到负载双药物的超分子水凝胶。

使用旋转流变仪（HAAKE RS6000）测量形成的超分子水凝胶的流变学性质，测试条件：35 mm平行盘，测试温度20℃，盘间距1mm，振荡应力1 Pa；凝胶测试之前需室温静置72h。如图6所示，4wt%AD-GL331/2wt% 羧甲基壳聚糖超分子水凝胶样品在整个测量范围内的储能模量（G’）远远大于其损耗模量（G”），说明形成了超分子水凝胶并且超分子水凝胶具有永久的交联网络。

2、超分子水凝体外药物释放行为

制备含4wt%AD-GL331，0.5wt%5-氟尿嘧啶，2wt%羧甲基壳聚糖的负载鬼臼毒素衍生物和5-氟尿嘧啶的超分子水凝胶，加入5 mL模拟胃液（0.05M 盐酸溶液，pH 1.2），随后置于37℃水浴中。根据预先设定好的时间点，取出0.5 mL上清液，然后加入0.5 mL新鲜溶液，维持其体积在5 mL。培育2 h后，将凝胶转移至5 mL模拟小肠液（PBS，pH 6.8），根据预先设定好的时间点，取出0.5 mL上清液，然后加入0.5 mL新鲜溶液，维持其体积在5mL。培养3 h后，再将凝胶转移至5 mL模拟结肠液（PBS，pH 7.4，10 mM连二亚硫酸钠替代偶氮还原酶），继续培养6 h，根据预先设定好的时间点，取出0.5 mL上清液，然后加入0.5 mL新鲜溶液，维持其体积在5 mL。利用HPLC对不同时间点取出的溶液进行分析，GL-331的最大检测波长为259.6 nm，5-氟尿嘧啶的最大检测波长为265 nm。图7a为载药超分子水凝胶在模拟胃肠液中的释放行为，在整个模拟胃肠系统溶液释放过程中，GL-331与5-氟尿嘧啶表现出了截然不同的释放行为。5-氟尿嘧啶在模拟胃液、小肠液及结肠液中表现出了持续释放的能力，而GL-331在模拟胃液、小肠液中无释放，仅在含有连二亚硫酸钠（模拟偶氮还原酶）的结肠模拟液中释放，说明结肠中含有的偶氮还原酶可高效断裂偶氮键，使GL-331仅在结肠中释放。

进一步考察了载药超分子水凝胶在不同酶系作用下的体外释放行为。分别制备4份含4wt%AD-GL331，0.5wt%5-氟尿嘧啶，2wt%羧甲基壳聚糖的超分子水凝胶，随后分别加入7 mL PBS溶液、葡聚糖酶溶液（10 mg/mL）、纤维素酶溶液（10 mg/mL）、淀粉酶溶液（10 mg/mL），置于水浴摇床中培养，控制水温为37℃。根据预先设定好的时间点，取出2 mL上清液，然后加入2 mL新鲜溶液，利用HPLC对不同时间点取出的溶液进行分析。图7b为负载于凝胶中的5-氟尿嘧啶在不同酶作用下的释放行为。36h内，在葡聚糖酶存在下，5-氟尿嘧啶的释放量及速度明显高于其它酶，在36 h内的释放比例达到了60%以上。在纤维素酶存在下，5-氟尿嘧啶的释放量明显高于脂肪酶，在36 h内的释放比例达到了50%以上。这主要是因为葡聚糖酶和纤维素酶可选择性降解凝胶中的葡聚糖和羧甲基纤维素，从而引起凝胶的瓦解，使通过物理包埋作用负载到凝胶中的5-氟尿嘧啶快速从内部扩散出来。上述结果表明结肠中特有的聚多糖酶可选择性降解该凝胶，从而有效提高药物在结肠释放的靶向性，因此该水凝胶具有独特pH敏感、还原剂敏感和酶敏感的药物释放行为，可作为结肠靶向多药物控释载体用于制备结肠靶向缓释药物。

综上所述，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

1、本发明利用偶氮键将鬼臼毒素衍生物键合于聚多糖链上，可有效提高鬼臼毒素衍生物的水溶性，还可进一步制备水凝胶药物载体用于联合用药的研究；

2、本发明充分利用结肠菌群产生的偶氮还原酶和聚多糖酶系，通过使用聚多糖作为药物载体和利用偶氮键连接鬼臼毒素衍生物，可有效提高结肠给药的靶向性，改善鬼臼毒素衍生物的成药性；

3、本发明制备的水凝胶具有酸碱、还原剂和酶敏感的多重响应的药物释放行为，且制备方法简单、快速、高效。

附图说明

图1为醛基化葡聚糖（AD）的核磁共振氢谱图；

图2为4´-O-去甲-4β-对二胺基偶氮苯-4-脱氧鬼臼毒素（GL331-azo）的核磁共振氢谱图；

图3为4´-O-去甲-4β-对二胺基偶氮苯-4-脱氧鬼臼毒素（GL331-azo）的核磁共振碳谱图；

图4为键合鬼臼毒素衍生物的醛基化葡聚糖（AD-GL331）的核磁共振氢谱图；

图5为鬼臼毒素衍生物水凝胶的形成图；

图6为4wt%AD-GL331/2wt% 羧甲基壳聚糖水凝胶流变动力学测试图；

图7为4wt%AD-GL331/0.5wt%5-氟尿嘧啶/2wt%羧甲基壳聚糖水凝胶体外药物释放行为图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明鬼臼毒素衍生物智能水凝胶的制备做进一步说明。

实施例一

1、醛基化葡聚糖（AD）的制备

葡聚糖（Mn = 40000，3.0 g），溶解到100 mL水中，加入高碘酸钠（4.0 g），室温搅拌2 h，随后加入乙二醇（1.2 g），室温搅拌2 h后转移到纯水中透析48 h，冻干，即得目标产物（2.4 g，产率80%）。

2、4´-O-去甲-4β-对二胺基偶氮苯-4-脱氧鬼臼毒素（GL331-azo）的制备

（1）中间体4´-O-去甲-4β-溴-4-脱氧鬼臼毒素的合成：将去甲表鬼臼毒素（1.0 g，2.4 mmol）溶解于25 mL的干燥二氯甲烷中，冰浴冷却至0℃，通入干燥的溴化氢气体45 min，随后通入N2除去多余的溴化氢，减压浓缩即得目标物（1.1 g）；

（2）4´-O-去甲-4β-对二胺基偶氮苯-4-脱氧鬼臼毒素（GL331-azo）合成：取中间体4´-O-去甲-4β-溴-4-脱氧鬼臼毒素（462 mg，1mmol），溶解于10 mL的干燥二氯甲烷中，氮气保护下加入无水碳酸钾（414 mg，3 mmol）搅拌5min，随后加入对二胺基偶氮苯（254 mg，1.2 mmol），室温搅拌4h后，过滤，减压浓缩，柱层析分离，即得目标物GL331-azo（315 mg），产率53.3%。

3、键合鬼臼毒素衍生物的醛基化葡聚糖（AD-GL331）的制备

将醛基化葡聚糖AD（1.0 g）溶解到100 mL中，加入用10 mL二甲基甲酰胺溶解的GL331-azo（50 mg），75℃下搅拌24 h，在纯水中透析72 h，冻干，即得目标产物（0.62 g），产率59.0%。

4、鬼臼毒素衍生物负载5-氟尿嘧啶水凝胶的制备

将AD-GL331（40 mg）溶解到1 mL水中，加入5-氟尿嘧啶5 mg，超声5 min，随后加入1 mL羧甲基壳聚糖水溶液（2wt%），超声6 min，静置12 h，即得负载鬼臼毒素衍生物和5-氟尿嘧啶的多重响应性水凝胶。

实施例二

1、醛基化葡聚糖（AD）的制备：同实施例1；

2、GL331-azo的制备：同实施例1；

3、键合鬼臼毒素衍生物的醛基化葡聚糖（AD-GL331）的制备

将醛基化葡聚糖AD（420 mg）溶解到55 mL二甲基甲酰胺中，随后加入GL331-azo（110 mg），75℃下搅拌24 h，在纯水中透析72 h，冻干，即得目标产物（450 mg），产率84.9%；

4、鬼臼毒素衍生物负载5-氟尿嘧啶水凝胶的制备

将AD-GL331（30 mg）溶解到1 mL水中，加入5-氟尿嘧啶5 mg，超声5 min，随后加入1 mL羧甲基壳聚糖水溶液（4wt%），超声2 min，静置2 h，即得负载鬼臼毒素衍生物和5-氟尿嘧啶的多重响应性水凝胶。

实施例三

1、醛基化葡聚糖（AD）的制备：同实施例1；

2、GL331-azo的制备：同实施例1；

3、键合鬼臼毒素衍生物的醛基化葡聚糖（AD-GL331）的制备：同实施例2；

4、鬼臼毒素衍生物负载顺铂水凝胶的制备：将AD-GL331（40 mg）溶解到1 mL水中，加入顺铂3 mg，超声5 min，随后加入1 mL羧甲基壳聚糖水溶液（2wt%），超声2 min，静置2 h，即得负载鬼臼毒素衍生物和顺铂的多重响应性水凝胶。

实施例四

1、醛基化葡聚糖（AD）的制备：同实施例1；

2、GL331-azo的制备：同实施例1；

3、键合鬼臼毒素衍生物的醛基化葡聚糖（AD-GL331）的制备：同实施例2；

4、鬼臼毒素衍生物负载阿霉素水凝胶的制备：将AD-GL331（40 mg）溶解到1 mL水中，加入阿霉素2 mg，超声5 min，随后加入1 mL羧甲基壳聚糖水溶液（4wt%），超声2 min，静置2 h，即得负载鬼臼毒素衍生物和顺铂的多重响应性水凝胶。