猴头菇多糖在制备预防和治疗结肠癌产品中的应用的制作方法

本发明属于医药领域，具体涉及猴头菇多糖在制备预防和/或治疗结肠癌产品中的应用。

背景技术：

结肠癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一。近年来，其发病率呈上升且年轻化趋势，是威胁人类生命健康的全球性疾病。虽然目前结肠癌的治疗已经取得了很大的进展，但是抗癌化学药物在治疗癌症的同时，也会对人体本身产生很大的毒性和副作用，导致很多患者在治疗后复发或转移。因此，从天然产物中寻找疗效高、毒性低的预防和/或治疗结肠癌的功能食品或药品等产品尤为重要。

猴头菇(hericiumerinaceus)，又称猴头菌，属于担子菌门basidiomycota，伞菌纲agaricomycetes，是我国一种著名的食药兼用菌。其子实体被应用于消化系统疾病的治疗已经有2000多年的历史。但关于该子实体多糖用于预防和/或治疗结肠癌没有研究和报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供猴头菇多糖的新用途。

本发明所提供的猴头菇多糖的新用途是其在制备如下1)-5)的产品中的应用：

1)预防和/或治疗结肠癌的产品；

2)抑制人结肠癌细胞生长的产品；

3)抑制人结肠癌细胞克隆集落形成能力的产品；

4)促进人结肠癌细胞发生凋亡的产品；

5)诱导人结肠癌细胞在s期发生阻滞的产品；

所述产品具体可为功能食品或药品；

所述应用2)中，所述人结肠癌细胞具体可为人结肠癌细胞hct-116、dld1、ht-29细胞中的至少一种；

所述应用3)中，所述人结肠癌细胞具体可为人结肠癌细胞hct-116；

所述应用4)中，所述人结肠癌细胞具体可为人结肠癌细胞hct-116；

所述应用5)中，所述人结肠癌细胞具体可为人结肠癌细胞hct-116。

上述应用中，所述猴头菇多糖通过包括如下步骤的方法制备得到：

1)将猴头菇粉用水浸提，离心，收集上清液，将所得上清液减压蒸发浓缩至粘稠状；

2)向步骤1)中浓缩后的浸提液中加入乙酸锌水溶液和亚铁氰化钾水溶液，搅拌，静置，离心，收集上清液，将所得上清液减压蒸发浓缩至粘稠状，得到浓缩液；

3)将步骤2)得到的浓缩液透析，向透析后的液体中加入无水乙醇，搅拌，静置过夜，离心，收集沉淀；

4)用水将步骤3)所得沉淀溶解，冷冻干燥，得到猴头菇多糖粉末，即可。

上述方法步骤1)中，所述猴头菇粉通过将新鲜的猴头菇干燥制得，所述干燥的温度可为50℃，时间可为4h；

所述猴头菇粉过100目筛；

所述浸提用水具体可为蒸馏水；

所述浸提用水与猴头菇粉的配比可为30-40ml：1g；

所述浸提的温度可为80℃，时间可为4h，

所述离心的条件为：6000rpm离心20分钟；

所述浸提可进行多次，具体可为3次；

上述方法步骤2)中，所述乙酸锌水溶液的质量百分浓度可为21.9％；所述亚铁氰化钾水溶液的质量百分浓度可为10.6％；

所述乙酸锌水溶液、亚铁氰化钾水溶液与浓缩后的浸提液的体积比可为0.9:0.9:10；

所述静置的温度可为室温，时间可为30min；

所述离心的条件可为6000rpm离心20min；

上述方法步骤3)中，所述透析用透析袋的截留分子量为3500da，

在所述透析过程中，每6小时换水一次，直至透析液电导率不变；

所述透析后的液体与无水乙醇的体积比可为1︰4；

所述搅拌的时间可为5分钟；

所述静置过夜的温度可为4℃；

所述离心的条件可为5000rpm离心15-20分钟；

上述方法步骤4)中，溶解用水具体可为蒸馏水，

所述溶解还包括65℃下搅拌助溶直至液体表观均匀的操作；

所得猴头菇多糖粉末置于4℃中保存备用。

本发明的再一个目的是提供一种预防和/或治疗结肠癌的产品、抑制人结肠癌细胞生长的产品、抑制人结肠癌细胞克隆集落形成能力的产品、促进人结肠癌细胞发生凋亡的产品或诱导人结肠癌细胞在s期发生阻滞的产品。

本发明所提供的预防和/或治疗结肠癌的产品、抑制人结肠癌细胞生长的产品、抑制人结肠癌细胞克隆集落形成能力的产品、促进人结肠癌细胞发生凋亡的产品或诱导人结肠癌细胞在s期发生阻滞的产品，其活性成分为猴头菇多糖或者通过上述方法制备的猴头菇多糖。

所述产品可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

需要的时候，在上述产品中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。

以所述猴头菇多糖为活性成分制备的预防和/或治疗结肠癌的产品、抑制人结肠癌细胞生长的产品、抑制人结肠癌细胞克隆集落形成能力的产品、促进人结肠癌细胞发生凋亡的产品或诱导人结肠癌细胞在s期发生阻滞的产品可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

本发明通过细胞实验证明：猴头菇多糖可以有效抑制人结肠癌细胞hct-116、dld1、ht-29细胞的生长；可以显著抑制hct-116细胞的克隆集落形成能力；可以促进人结肠癌hct-116细胞发生凋亡；可以诱导hct-116在-期发生阻滞；因此猴头菇多糖可在制备具有预防和/或治疗结肠癌作用的功能食品或药品中应用。

附图说明

图1为猴头菇多糖抑制人结肠癌hct-116、dld1、ht-29细胞存活率的实验图。

图2为猴头菇多糖抑制人结肠癌hct-116细胞的克隆集落形成实验图。

图3为猴头菇多糖促进人结肠癌hct-116细胞凋亡实验图。

图4为猴头菇多糖阻滞hct-116细胞周期实验图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中使用的猴头菇多糖，通过如下方法制备得到：

第一步：取过50℃干燥4h的猴头粉(过100目筛)，加蒸馏水80℃浸提4h，6000rpm离心20分钟，弃去沉淀，浸提3次，合并上清液并减压蒸发浓缩至粘稠状。

第二步：向第一步中浓缩后的液体中加入质量百分浓度为21.9％的乙酸锌和质量百分浓度为10.6％的亚铁氰化钾，充分搅拌，室温下静置30分钟，然后6000rpm离心20min取上清液，减压蒸发浓缩至粘稠状；所述的乙酸锌、亚铁氰化钾和浸提液体积比为0.9︰0.9︰10；

第三步：将第二步减压蒸发得到的浓缩液透析(透析袋截留量为3500da)，每6小时换水一次，直至透析液电导率不变；向透析后的液体中加入无水乙醇，涡旋30分钟后4℃静置过夜，然后5000rpm离心15-20分钟，收集沉淀；所述的提取液和无水乙醇体积比为1︰4；

第四步：用少量蒸馏水将第三步所得到的沉淀物溶解,65℃下搅拌助溶，直至液体表观均匀，用冷冻干燥机对其进行冻干，得到干燥絮状的多糖粉末，置于4℃中保存。

实施例1、猴头菇多糖对人结肠癌细胞存活率的影响

采用mtt法研究了猴头菇多糖对hct-116、dld1、ht-29细胞活力的抑制作用。取对数生长期的人结肠癌细胞hct-116、dld1、ht-29，0.2％胰酶消化，以6000个/100μl的细胞密度接种于96孔板中，在37℃，5％co2的培养箱中孵育24h。

细胞贴壁后，更换新鲜培养基，分别加入不同浓度的猴头菇多糖，每个浓度设5个复孔，同时设置空白对照组，在相同条件下继续孵育48h。吸掉旧培养基，pbs清洗2次，每孔加100μl的新鲜培养基，再加入20μl的mtt，继续孵育4h，吸掉孔中培养基，加入dmso150μl，震荡10min，充分溶解结晶，并在570nm处测每孔的吸光度值。细胞存活率％＝a实验组/a对照组x100％。

结果表明：与对照组相比，猴头菇多糖可以有效抑制结肠癌hct-116、dld1、ht-29细胞的增殖。猴头菇多糖对结肠癌hct-116细胞的抑制作用尤为显著。

实施例2、猴头菇多糖对人结肠癌细胞hct-116细胞细胞克隆的影响。

通过细胞克隆集落形成实验，进一步验证猴头菇多糖对hct-116细胞的增殖能力的影响。

选取对数生长期的hct-116细胞，用0.2％胰酶消化，按1000个/每孔的细胞密度接种于6孔细胞培养板里，37℃,5％co2的培养箱中培养24h；细胞贴壁后，换新鲜培养基，分别加入不同浓度的猴头菇多糖，每个浓度设3个复孔，在相同条件下继续孵育6天。弃掉每孔的培养基，pbs清洗3次，室温条件下用免疫染色固定液固定细胞1h，0.1％结晶紫染色30min并在体视显微镜下观察hct-116细胞克隆形成情况。

结果表明：猴头菇多糖对hct-116细胞的克隆集落形成有明显抑制作用，显示了该多糖对hct-116细胞增殖的长期抑制效果。随着猴头菇多糖浓度的增加，对hct-116细胞的克隆集落形成的抑制作用愈发明显。

实施例3、细胞凋亡检测

分别用0、0.3、0.6mg/ml猴头菇多糖处理hct-116细胞48h，采用annexinv/pi双染法检测猴头菇多糖对细胞凋亡的影响。

结果显示0.3，0.6mg/ml猴头菇多糖处理后，hct-116细胞的凋亡率分别为16.03±1.32％和29.75±0.96％，证实猴头菇多糖可诱导结肠癌hct-116细胞发生凋亡(如图3a，3b，3c所示，图3a，3b，3c为流式细胞仪检测0，0.3，0.6mg/ml猴头菇多糖对人结肠癌hct-116细胞诱导的细胞凋亡图；图3d表示猴头菇多糖对细胞凋亡率的影响)。

实施例4、细胞周期检测

分别用0、0.3、0.6mg/ml猴头菇多糖处理hct-116细胞48h，70％预冷乙醇固定后，采用流式细胞仪检测猴头菇多糖对细胞周期的影响。

结果显示：猴头菇多糖可将hct-116细胞阻滞在s期(如图4a，b，c所示，图4a，b，c表示流式细胞仪检测猴头菇多糖0，0.3，0.6mg/ml对人结肠癌hct-116细胞的周期图，图4d表示各周期细胞所占比例)。