本发明涉及医药
技术领域：
：，具体而言，涉及钙离子通道抑制剂的新应用。
背景技术：
：：沙粒病毒科病毒是有囊膜病毒，病毒包含有双节段，负链rna，分别为l片段(lsegment)，约7.3kb以及s片段(ssegment)长度约3.5kb。两个片段均采用双义编码的形式每个片段表达两种蛋白。其中lsegment编码rna依赖的rna聚合酶(rnadependentrnapolymerase，rdrp)又被称作l蛋白(lprotein，lp)，大小约200kda。lsegment同时编码z蛋白(zprotein)大小约11kda。ssegment编码核蛋白(nucleoprotein，np)，分子质量约为63kda和病毒囊膜糖蛋白(glycoprotein，gp)前体，分子质量75kda。病毒gp在表达阶段，合成后是一条多肽的长链。被细胞内信号肽蛋白酶，以及蛋白酶ski1/s1p切割为三个片段，三个片段分别为滞留的信号肽(stablesignalpeptide，ssp)此部分含有约58个氨基酸，在沙粒病毒中高度保守；gp1分子质量约40-46kd；以及gp2分子质量约35kda。gp1定位于囊膜糖蛋白外端，保护gp2的融合肽部分。gp2包含跨膜区定位于病毒膜表面。信号肽ssp滞留与囊膜蛋白处两次跨膜与gp2存在相互作用。沙粒病毒的gp复合体(gp-complex，gpc)是典型的i型膜融合蛋白，ssp、gp1和gp2共同组成蛋白的一个单体，gpc由三个这样的单体同源三聚形成。成熟的沙粒病毒直径约为40-200nm，呈现球型和椭圆形，电镜下中心处有致密的沙粒状核心，此为沙粒病毒名称的由来。病毒外围处有脂质囊膜，囊膜表面镶嵌gpc结构。gpc在病毒进入阶段扮演重要的角色。其gp1部分可以与细胞膜表面的病毒受体结合，病毒通过胞吞进入细胞中，在晚期内体以及溶酶体中发生膜融合现象。此时gp1脱落，暴露gp2融合肽部分，gp2在细胞的酸性条件下变构，形成连接病毒内容物与细胞质的孔洞，释放病毒np，lp和rna等内容物，从而使病毒开始发挥复制作用。病毒进入阶段作为病毒与宿主互作的生命周期的第一步可以作为药物设计的靶标。目前对所有沙粒病毒，均没有fda批准的疫苗，且没有特异性药物，现有药物对出血热的治疗效果也不佳。由于沙粒病毒的致病性，易传播性，以及治疗方案的局限性。因此，针对沙粒病毒特异性药物的研发显得十分关键且重要。鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的目的在于提供钙离子通道抑制剂的新应用。该新的应用扩大了钙离子通道抑制剂的使用范围，且为病毒抑制，特别是沙粒病毒的抑制提供新的药物，为出血热的治疗也提供新的药物。本发明是这样实现的：第一方面，实施例提供钙离子通道抑制剂在制备病毒抑制剂中的应用。在可选的实施方式中，所述钙离子通道抑制剂为钙通道选择性阻滞剂；优选地，所述钙通道选择性阻滞剂为二氢吡啶类化合物；更优选为马尼地平和乐卡地平中的任意一种。在可选的实施方式中，所述病毒抑制剂为抑制沙粒病毒的抑制剂。在可选的实施方式中，所述沙粒病毒包括旧世界沙粒病毒和/或新世界沙粒病毒导致的疾病；更优选地，所述旧世界沙粒病毒包括拉沙热病毒；更优选地，所述新世界病毒包括胡宁病毒、马秋波病毒、瓜纳瑞托病毒、沙比亚病毒和查帕雷病毒中的至少一种。在可选的实施方式中，所述病毒抑制剂通过抑制病毒进入阶段的膜融合过程，继而抑制病毒；优选地，所述病毒抑制剂通过抑制沙粒病毒的gp复合体所介导的细胞膜融合能力，继而抑制病毒。也就是钙离子抑制剂可以应用于制备抑制沙粒病毒的gp复合体所介导的细胞膜融的抑制剂中。进一步地，马尼地平和/或乐卡地平可以用于在制备抑制路约病毒gpc所介导的膜融合的抑制剂中。在可选的实施方式中，在细胞模型上，钙离子通道抑制剂对病毒的半数有效抑制浓度为1.81μm-2.42μm。第二方面，实施例提供钙离子通道抑制剂在制备治疗沙粒病毒介导的疾病的药物中的应用；在可选的实施方式中，所述沙粒病毒介导的疾病包括淋巴细胞脉络丛脑膜炎、拉沙热和出血热中的任意一种；出血热包括阿根廷出血热、玻利维亚出血热和委内瑞拉出血热中的任意一种。第三方面，实施例提供钙离子通道抑制剂在制备治疗出血热疾病药物中的应用；优选地，所述出血热疾病为病毒性出血热疾病；优选地，所述出血热疾病为沙粒病毒导致的疾病。在可选的实施方式中，所述钙离子通道抑制剂为钙通道选择性阻滞剂；优选地，所述钙通道选择性阻滞剂为二氢吡啶类化合物；更优选为马尼地平和乐卡地平中的任意一种；优选地，所述药物为抗病毒药物。本发明具有以下有益效果：本发明采用钙离子通道抑制剂能够良好的抑制病毒的生长，特别是抑制沙粒病毒的生长，扩大了钙离子通道抑制剂的使用范围，提升其应用前景，同时，也为抗病毒或者抑制病毒提供一种新的药物。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为马尼地平在vero以及a549细胞上对lujv重组病毒的抑制效果的分析图；图2为乐卡地平在vero以及a549细胞上对lujv重组病毒的抑制效果的分析图；图3为马尼地平对lujv，junv，macv，gtov，sbav和chapv六种病毒的抑制效果的分析图；图4为乐卡地平对lujv，junv，macv，gtov，sbav和chapv六种病毒的抑制效果的分析图；图5为vero细胞在马尼地平200μm，100μm，50μm以及25μm不同浓度处理24小时后的细胞活性的分析图；图6为vero细胞在乐卡地平200μm，100μm，50μm以及25μm不同浓度处理24小时后的细胞活性的分析图；图7为马尼地平在75μm时对于lujv病毒gpc所介导的膜融合的抑制的结果图。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。首先，本发明实施例提供一种钙离子通道抑制剂在制备病毒抑制剂中的应用。发明人意外地发现钙离子通道抑制剂对病毒有良好的抑制效果，特别是对沙粒病毒有良好的抑制效果。进一步地，上述沙粒病毒包括旧世界沙粒病毒和/或新世界沙粒病毒；更优选地，所述旧世界沙粒病毒包括拉沙热病毒；更优选地，所述新世界病毒包括胡宁病毒、马秋波病毒、瓜纳瑞托病毒、沙比亚病毒和查帕雷病毒中的至少一种。其中，哺乳动物沙粒病毒科病毒目前依据抗原性质、血清学、地理学和基因同源性可以分为两类：旧世界沙粒病毒(oldworldarenavirus)和新世界沙粒病毒(newworldarenavirus)。而旧世界沙粒病毒可以引起出血热疾病的两种病毒分别是拉沙热病毒(lassavirus，lasv)和路约病毒(lujovirus，lujv)。lasv主要流行于西非地区，是造成拉沙热(lassafever)的病原，lujv于2008年在南非约翰内斯堡爆发，导致严重的出血热疾病，lujv的所造成的临床学现象与lassafever的临床学现象十分相似，并且在2008年的爆发中造成了80％的致死率。而新世界沙粒病毒主要于南美洲流行。其包括胡宁病毒(junínvirus，junv)，马秋波病毒(machupovirus，macv)，瓜纳瑞托病毒(guanaritovirus，gtov)以及沙比亚病毒(sabiávirus，sbav)，上述四种新世界沙粒病毒曾在阿根廷，委内瑞拉，玻利维亚和巴西造成严重的病毒性出血热疾病。而新世界沙粒病毒科病毒除了以上四类，还包括查帕雷病毒(chaparevirus，chapv)以上病毒均被美国cdc列为a类病原。进一步地，上述钙离子通道抑制剂是通过抑制病毒进入阶段的膜融合过程，特别是抑制沙粒病毒的gp复合体所介导的细胞膜融合能力，继而抑制病毒侵害细胞，继而起到抗病毒的功效。也说明钙离子通道抑制剂可以应用于制备抑制沙粒病毒的gp复合体所介导的细胞膜融的抑制剂中。进一步地，钙离子通道抑制剂为钙通道选择性阻滞剂；优选地，所述钙通道选择性阻滞剂为二氢吡啶类化合物；更优选为马尼地平和乐卡地平中的任意一种。也就是说马尼地平和/或乐卡地平可以用于在制备抑制lujv病毒gpc所介导的膜融合的抑制剂中。且在细胞模型上，所述钙离子通道抑制剂对病毒的半数有效抑制浓度为1.81-2.42μm。采用上述钙离子通道抑制剂以及上述浓度能够更好地抑制病毒生长，起到抗病毒效果。本发明实施例采用的马尼地平，其结构式如下：马尼地平是第三代亲脂性，二氢吡啶类钙离子通道抑制剂，通过抑制平滑肌细胞表面的l-和t-型钙离子通道导致周围血管的舒张从而导致血压降低。马尼地平作为可原发性轻度至中度高血压的一线选择，通过美国国家食品药品管理局(u.s.food&durgadministration)的批准。本发明实施例采用的乐卡地平结构式如下：乐卡地平是和马尼地平类似，也是第三代亲脂性，二氢吡啶类钙离子通道抑制剂。与许多其他钙拮抗剂相比，起效较慢，因此作用时间更长。临床前证据表明，乐卡地平具有抗动脉粥样硬化的潜力，也可以预防器官损伤。进一步地，钙离子通道抑制剂在制备治疗沙粒病毒介导的疾病的药物中的应用。所述沙粒病毒介导的疾病包括淋巴细胞脉络丛脑膜炎、拉沙热和出血热的任意一种；优选地，出血热包括阿根廷出血热、玻利维亚出血热和委内瑞拉出血热中的任意一种。钙离子通道抑制剂对沙粒病毒感染细胞有良好的抑制效果，对沙粒病毒介导的疾病也有良好的治疗效果。进一步地，钙离子通道抑制剂在制备治疗出血热和/或拉沙热疾病药物中的应用；优选地，所述出血热疾病为病毒性出血热疾病；优选地，所述出血热和拉沙热疾病分别为沙粒病毒导致的疾病，该药物为抗病毒药物，所述钙离子通道抑制剂为钙通道选择性阻滞剂；优选地，所述钙通道选择性阻滞剂为二氢吡啶类化合物；更优选为马尼地平和乐卡地平中的任意一种。本发明构建两种病毒工具：病毒1：一系列表达沙粒病毒gpc以口炎病毒为骨架的病毒样颗粒，该病毒携带海肾荧光素酶(renillaluciferase，luc)报告基因，具体地，将lujv、junv，macv，gtov，sbav和chapv分别制备为上述病毒1。病毒2：基因组为口炎病毒但口炎病毒的gpc基因被lujv-gpc所替代的具有复制能力的重组病毒，该病毒含有绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，gfp)报告基因。药物：马尼地平和乐卡地平实验例1对病毒的抑制效果操作方法：(1)使用含有10％胎牛血清的dmem培养基分别对vero和a549细胞进行培养，在实验前一天使用胰酶对细胞进行消化。(2)对细胞进行计数以25000个细胞每毫升的浓度使用10％胎牛血清dmem将细胞均匀铺至96孔板。(3)实验当天使用2％dmem培养基分别对马尼地平和乐卡地平进行稀释，稀释至使用浓度(75μm，15μm，3μm，0.6μm，0.12μm，0.024μm)后将30μl药物转移至细胞孔中。药物与细胞共孵育一个小时。(4)一小时后将病毒(病毒1和病毒2，其中病毒1包括lujv，junv，macv，gtov，sbav和chapv)分别以moi＝0.1的用量稀释，将20μl病毒稀释液至于细胞孔中，病毒感染一个小时。(5)对96孔板进行换液操作若使用病毒样颗粒则换为2％胎牛血清dmem培养基。(6)24小时后通过收集luc酶活性或gfp荧光强度判断药物抑制活性。其中2％胎牛血清dmem培养基培养的细胞的感染率为100％以gfp荧光以及luc酶活为指标计算药物处理下的细胞活性。检测结果参见图1-图4。图1为马尼地平在vero以及a549细胞上对lujv重组病毒的抑制效果的分析图；图2为乐卡地平在vero以及a549细胞上对lujv重组病毒的抑制效果的分析图；图3为马尼地平对lujv，junv，macv，gtov，sbav和chapv六种假型病毒的抑制效果的分析图；图4为乐卡地平对lujv，junv，macv，gtov，sbav，chapv六种假病毒的抑制效果的分析图。根据图1-图4可知，马尼地平对lujv的ic50为1.81μm，药物乐卡地平对lujv的ic50为2.42μm。两种药物对junv，macv，gtov，sbav和chapv均有μm级别的抑制效果。实验例2细胞毒性操作方法：1)使用含有10％胎牛血清的dmem培养基对vero细胞进行培养，在实验前一天使用胰酶对细胞进行消化。2)对细胞进行计数以25000个细胞每毫升的浓度使用将细胞均匀铺至96孔板。3)实验当天使用2％胎牛血清dmem培养基对药物(马尼地平和乐卡地平)进行相应浓度的稀释(浓度为200μm，100μm，50μm以及25μm)。4)吸去原本培养基更换为含有药物的培养基，培养24小时。5)24小时后吸去含有药物的培养基，更换为5mg/mlmtt溶液，继续培养4-5小时。6)吸去mtt溶液使用50μldmso对细胞中的有色物质进行溶解。7)使用酶标仪对吸光度进行测量，其中2％胎牛血清dmem培养基培养的细胞的活性为100％以吸光度为指标计算药物处理下的细胞活性。检测结果参见图5和图6，其中，图5为vero细胞在马尼地平200μm，100μm，50μm以及25μm不同浓度处理24小时后的细胞活性的分析图；图6为vero细胞在乐卡地平200μm，100μm，50μm以及25μm不同浓度处理24小时后的细胞活性的分析图。根据图5和图6可知，马尼地平和乐卡地平在200μm，100μm，50μm以及25μm的浓度下对细胞均没有明显毒性，也说明了二者的安全性。实验例3膜融合实验操作方法：1)使用含有10％胎牛血清的dmem培养基对293t细胞进行培养，在实验的前一天用胰酶对细胞进行消化。2)对293t细胞进行计数以35000个细胞每毫升的浓度将细胞铺至24孔板中。)使用lipo2000对以pcaggs质粒为载体的lujv-gpc、以pcdna3.1为载体的cd63膜表面表达突变质粒以及pegfp-n1质粒进行转染，转染浓度为每孔250ng，并且使蛋白表达24小时。4)实验第二天天使用2％胎牛血清dmem培养基分别对药物(马尼地平和乐卡地平)进行稀释，将药物稀释至75μm的浓度，将稀释好的药物加入细胞孔中孵育一个小时。5)一个小时后移除含有药物的培养基使用柠檬酸和dmem配置的ph为5.0的酸化液对细胞进行酸化。6)2-3小时后使用荧光显微镜进行观察和拍照，记录细胞膜融合情况。结果参见图7，图7为马尼地平在75μm时对于lujv病毒gpc所介导的膜融合的抑制的结果图；根据图7可知，马尼地平可以抑制以上病毒gpc所介导的膜融合现象。综上所述，马尼地平和乐卡地平对沙粒病毒有良好的抑制效果，特别是良好的抑制lujv，junv，gtov，macv，sabv和chapv病毒感染细胞，可以用于沙粒病毒介导疾病，进一步扩大了钙离子通道抑制剂的使用范围。同时，马尼地平和乐卡地平细胞毒性低，保证了其在用于治疗沙粒病毒介导疾病时，副作用低。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 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