专利名称：川楝素作为p型钙通道的一种特异阻断剂的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从植物川楝中提取的三萜化合物—川楝素的用途。
目前已发现的P型Ca2+通道阻断剂主要有两类三种(Trends Neurosci.，1889-98，1995；Trends Neurosci，19440-444，1996)。一类是从蜘蛛毒分离的FTX(funnel web spider toxin)和ω-Agatoxin IVA。其中，前者在N型和P型通道间缺乏特异选择性(Mol.Pharmacol.，50939-946，1996；Ann.N.Y.Acad.Sci.，63580-89，1991；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9110576-10580，1994；Neuropharmacology，331211-1219，1994)；另一类是从海产芋螺提取的ω-conotoxin MVIIC，除P型外它还阻断N型，Q型和R型Ca2+通道，对这几种Ca2+通道缺乏特异性(Neuropharmacology，331211-1219，1994；J.Mol.Biol.，263297-310，1996；J.Neurosci.，18641-647，1998；FEBS.Lett.，414480-484，1997)。从上述资料看出，目前尚无一种只选择地作用于P型Ca2+通道的特异阻断剂。而ω-agatoxin IVA也只能把P型和Q型通道介导的电流阻断，将P/Q通道与其它型Ca2+通道区分开来，还难以将P型与Q型通道介导的Ca2+流完全分离，这也是目前常把ω-agatoxin IVA阻断的通道统称为P/Q通道的原因。
在离子通道研究中，特别是Ca2+通道研究中，ω-agatoxin IVA是必不可少的试剂，也是最昂贵的通道试剂，只有少数几个厂家生产，报价为一个最小包装(5微克)50美金。因此，寻求一种新的，特异性地作用于P型Ca2+通道的阻断剂，是人们所十分期望的，具重要价值。
发明人经过大量的实验，证明从川楝韧皮中分离、纯化的川楝素是P型Ca2+通道的一个新的特异阻断剂，它只阻断P型Ca2+通道介导的Ca2+流，对其它几种Ca2+通道都无抑制作用。所以能把P型Ca2+通道同与它电生理学特性相近的N型和Q型分离开来，将成为用以分离P型Ca2+通道的新的有力工具。川楝素的这种专一阻断P型Ca2+通道的特性，也预示着它应用于临床实际的前景和重要价值。
为能够进一步理解本发明的实质内容，以下将通过记录细胞膜上Ca2+通道介导的电流，观察它在施加含川楝素的溶液灌流后的变化，证明川楝素可作为P型Ca2+通道特异阻断剂的应用。
1.实验方法简介本发明利用两种实验方法—①全细胞膜片箝记录(whole-cellpatch clamp recording)和②运动神经末梢周膜下记录(Perineuralrecording)，记录通过细胞膜Ca2+通道的电流，观察川楝素的作用。这些方法都是研究离子通道，记录通道电流的经典方法，已被广泛应用于科学研究20余年。
①全细胞膜片箝记录以持续更新的细胞外液灌流细胞，在显微镜下用细胞内液灌充的玻璃微电极与细胞表面形成千兆欧姆高阻抗封接(giga-seal)，再施以负压将隔离的膜片吸破，使电极内液与细胞内沟通，这就得到了全细胞记录构型。电极信号输至膜片箝负反馈放大器，记录通过细胞膜离子通道的电流。该方法的具体步骤可参见经典文献Pfluger’s Arch，39185-100，1981，以及本发明人(施玉梁)的论文(Pfluger’s Arch，433617-625，1997；Brain Res.，75147-53，1997)。本发明用于鉴定川楝素对P型Ca2+通道的作用的仪器，软件，实验操作，数据处理、溶液配制和试剂等与上述文献报道的基本相同。
记录Ca2+通道电流时，按一般惯例，利用钡离子(Ba2+)代替Ca2+作为通过Ca2+通道电流的载流子，即以Ba2+流作为流过Ca2+通道的电流的量度。
对研究中所利用的细胞，按照有关文献提供的方法进行分离、培养，记录通过Ca2+通道的电流大鼠小脑浦肯野神经元(Purkinje Neuron)，按Mintz等的报告(Nature 355827-829，1992；Neuron 785-95，1992；J.Neurosci.，112259-2269，1991)分离、保存；按这些文献报告的方法配制灌充记录微电极的溶液和灌流细胞的外液，记录Ca2+通道电流。
NG108-15细胞按Furuya等(Dev.Brain Res.，11229-234，1983)和本发明人施玉樑等文献(Brain Res.，75147-53，1997；AflugersArch 433617-625，1977)所描述的方法培养、分化；按文献(Neuroscience，87265-274，1998；生理学报，46575-580，1994)报告的成份配制灌充记录微电极的溶液和灌流细胞的外液，记录Ca2+通道电流。
观察川楝素的作用时，直接将经乙醇重结晶的川楝素(纯度＞98％)溶于灌流细胞的外液，终浓度为1-100μmol/L。
②神经周膜下记录是一种将微电极插入接近终板的运动神经末梢束周膜下腔，记录膜电流，研究运动神经末梢离子通道的方法，文献(Pflugers Arch，406190-197，1986；Pharmacol.Exp.Ther.，2791229-1236，1996)和发明人(施玉樑等)的论文(Toxicon.38177-185，2000；J.Neurol.Sci.130165-170，1995)对该方法已有详细报道。Ca2+流在小鼠运动神经末梢可被分为Q型Ca2+通道介导的快Ca2+流和P型Ca2+通道介导的慢Ca2+流两个成份，以分别观察药物对它们的作用。本项发明中利用同样的实验标本，溶液和试剂，同样实验方法记录Ca2+流，鉴定川楝素的作用。
2.结果采用上述方法记录到通过细胞膜上Ca2+通道电流后，将川楝素加至灌流细胞的外液，观察通道电流的变化，结果表明①P型Ca2+通道介导的电流迅速降低，直至消失，完全被抑制；②川楝素抑制P型Ca2+通道电流的作用是剂量依赖的。川楝素浓度低于1微摩尔(μmol/L)时作用不明显，大于10微摩尔均有抑制作用。作用部分可逆，即用不含川楝素的溶液冲洗后，Ca2+流有部分恢复，抑制部分解除；③用同样测试方法观察川楝素对通过其它型Ca2+通道的电流的影响，结果表明它对通过N型，L型，T型和Q型Ca2+通道的电流均无抑制作用，反而使通过L型Ca2+通道的电流稍有增加。
结果清楚地证明，微摩尔数量级浓度的川楝素专一地阻断通过P型Ca2+通道的电流，而对通过其它型Ca2+通道的电流无抑制效应，川楝素是P型Ca2+通道的一个新的特异性阻断剂。
图2.川楝素(87微摩尔)对小鼠运动神经末梢周膜下记录的两种Ca2+流的作用，图3.川楝素对T型Ca2+通道的作用。
图4.川楝素对N型和Q型Ca2+通道的影响。
实施例1利用浦肯野神经元进行的实验，证明川楝素阻断P型Ca2+流。该细胞的特点是几乎全部Ca2+通道为P型(残留的近10％中N型和L型各占＜5％)，即90％的Ca2+流由P型通道介导(Nature，355827-829，1992；Neuron，785-95，1992；J.Neurosci，112259-2269，1991)。采用上述全细胞膜片箝记录方法，记录到正常的Ca2+通道电流后，用含35微摩尔浓度川楝素的溶液灌流细胞，即可观察到电流迅速降低，2-4分钟被抑制90％，残留部分正好是各占＜5％的N型和L型。实验结果见
图1和表1中最后一列数据。
图1中，A为一例原始记录，细胞由去极化测试电压(从-80mV至-10mV)诱发的通过P型Ca2+通道的电流(control)在35微摩尔川楝素作用后(After TSN)几乎完全消失，用不含川楝素的溶液冲洗后又部分恢复(wash)。B为由一系例类似A的实验，得到的在不同测试电压下的通道电流值(纵座标)对电压(横座标)作图，绘制的电流-电压关系曲线。曲线-●-(control)为加川楝素前，-■-(TSN)为加川楝素灌流后。图中每点为5次实验平均值±SEM。
实施例2利用小鼠运动神经末梢进行的实验，证明川楝素阻断P型Ca2+通道介导的电流，而对Q型介导的Ca2+流无影响。采用上述神经周膜下记录方法，记录神经末梢Ca2+流的两个成份，即Q型通道介导的快Ca2+流和P型通道介导的慢Ca2+流(NeuroReport，15333-336，1993；J.Pharmacol.Exp.Ther.2791229-1236，1996)。在得到正常对照记录后，以含87微摩尔川楝素的溶液灌流标本，发现慢Ca2+流逐渐降低，直至完全消失，而快Ca2+流不受影响。结果实例示于图2。
图中自左至右第一个正相波(向上)为快Ca2+流(ICa.f)，第二正相波为慢Ca2+流(ICa.s)。在得到对照记录(control)后，加川楝素(TSN)，快Ca2+流(由Q型通道介导)无变化，由P型通道介导的慢Ca2+流(ICa.s)则完全被抑制。
实施例3利用未分化的NG108-15细胞，证明川楝素对T型Ca2+通道介导的电流无影响。未分化NG108-15细胞只有低激活阈值的T型Ca2+通道(Neuroscience，87265-274，1988)。采用全细胞膜片箝记录方法，记录到Ca2+通道电流后，以含川楝素浓度为87微摩尔的溶液灌流细胞，对电流无影响。证明川楝素对T型Ca2+通道电流没有作用。结果示于图3和表1中第一行数据。
图中A为通道电流的电流值(纵座标)-电压(横座标)关系曲线。-□-(control)和-Δ-(2min TSN)分别为加川楝素(87微摩尔)前和2分钟后的曲线，图中每一点为7次实验平均值±SEM。两条曲线完全重合，证明川楝素不影响T型通道。B为由去极化测试电压(从-80mV至-20mV)诱发的通道电流原始记录，加川楝素前(control)，后(TSN)完全重合，证明川楝素不影响T型通道。
实施例4利用分化的NG108-15细胞，证明川楝素不影响N型和Q型Ca2+通道。NG108-15细胞分化后除T型外还有N型，L型和Q型。采用上述全细胞膜片箝记录方法，在-40mV测试电压下可将T型通道失活，记录到通过包括N，L和Q型通道的高激活阈值Ca2+流。再用尼弗的平(Nifedipine)将L型Ca2+通道阻断后，剩下的为通过N和Q型Ca2+通道的电流。在这种情况下，以含川楝素(87微摩尔)的溶液灌流细胞，通道电流保持不变，证明川楝素对N型和Q型Ca2+通道没有影响。结果示于图4和表1中第三行(标以“抗Nifedipine”)数据。
图中在Nifedipine存在下由去极化测试电压(从-40mV至+10mV)诱发的通道电流，即通过N和Q型通道的电流(Nifedipineresistant)，加入川楝素(87微摩尔)后无变化(After TSN)，证明川楝素对N型和Q型Ca2+通道无作用。
实施例5利用分化NG108-15细胞，证明川楝素不抑制L型Ca2+通道介导的电流，而是使之稍有增大。同样利用全细胞膜片箝记录方法，在-40mV测试电压下将T型通道失活，记录高激活阈值Ca2+流(包括N，Q和L型)，再以含川楝素(35-87微摩尔)的溶液灌流细胞，发现通道电流不是降低而是稍有增大(见表1中第二行数据)，这种增大在加入Nifedipine将L型Ca2+通道阻断后消失(见表1中第三行数据)，证明川楝素对L型通道亦无抑制作用，而是使之稍稍增大。
表1川楝素对通过Ca2+通道的电流的作用对照 加川楝素后*变化 例数 P§(电流密度PA/PF，±SEM)未分化NG108-15细胞(-20mV) 10.08±2.3910.07±2.13-0.1％7 ＞0.75分化NG108-15细胞高阈值电流(10mV) 6.45±1.44 8.12±2.00 +25.9％ 7 ＜0.0025抗Nifedipine高阈值电流(10mV) 5.58±2.76 5.45±2.69 -2.3％15 ＞0.25大鼠浦肯野细胞(-20mV) 79.40±28.54.10±2.65 -94.22％ 5 ＜0.0001*施加川楝素浓度NG108-15细胞87微摩尔，浦肯野神经元35微摩尔，§以配对student’s t-检验的与对照差异的显著性。
权利要求
1.川楝素作为P型Ca2+通道阻断剂的应用。
2.如权利要求1所述的应用，川楝素浓度大于1微摩尔时有效。
全文摘要
本发明公开了川楝素作为P型钙通道的一种特异阻断剂的应用。发明人经过大量的实验，证明从川楝韧皮中分离、纯化的川楝素是P型Ca
文档编号A61K31/35GK1403079SQ0112660
公开日2003年3月19日 申请日期2001年8月31日 优先权日2001年8月31日
发明者施玉樑, 王文萍 申请人:中国科学院上海生命科学研究中心