专利名称：具有抗心肌缺血作用的黄芪毛蕊异黄酮及其糖甙的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药技术领域。具体涉及具有抗心肌缺血作用的黄芪毛蕊异黄酮及其糖甙。
尽管黄芪对心血管的作用是肯定的，但就目前的研究而言，黄芪对心血管效应方面的药效物质是不清楚的。因此，有必要在现有的研究基础上进行深入的研究，阐明黄芪在心血管疾病治疗方面的药效物质基础和作用机制，
本发明提供了一种具有抗心肌缺血作用的黄芪毛蕊异黄酮(Calycosin)及其糖甙(Calycosin-7-O-β-D-glucoside)。
具有下列结构式 毛蕊异黄酮(calycosin)MW＝284毛蕊异黄酮糖甙HPCL图谱见图4。 毛蕊异黄酮糖甙(Calycosin-7-O-β-D-glucos ide)MW＝446毛蕊异黄酮糖甙HPLC图谱见图5。
本发明的黄芪毛蕊异黄酮及其糖甙的药理作用如下毛蕊异黄酮糖甙对大鼠心肌缺血-再灌注损伤的保护作用Wistar种大鼠离体心脏的LVDP(左室发展压力)、LEDVP(左室舒张末压)、±dP/dtmax(左室内压的最大上升和下降速率)和冠脉灌注压(CPP)经压力换能器连接生理信号处理系统记录。实验结果见表1。结果表明10-4M的毛蕊异黄酮糖甙能够抑制LVDP、±dP/dtmax的下降，抑制LVDP和CPP的上升。该研究说明毛蕊异黄酮糖甙具有较明显的抗心肌缺血和缺血-再灌注损伤的作用，生化指标正在测试中。此外，对急性心肌缺血的作用和心肌梗塞后的心肌重构作用，已经开始。
表1 毛蕊异黄酮糖甙(10-4M)对大鼠离体心脏缺血-再灌注损伤作用的血流动力学观察(x±s)
与对照组比较*P＜0.05毛蕊异黄酮对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)缺氧的保护作用血管内皮细胞经缺氧处理60-480分钟，HUVEC单层对分子量4,4000及77,000 FITC-右旋糖苷的通透性与对照值比较，明显增加(表2、3)。当内皮细胞在缺氧的同时，加入毛蕊异黄酮，HUVEC单层对右旋糖苷通透性明显减少，毛蕊异黄酮抑制HUVEC单层通透性增加是浓度依赖性的(表4)，说明毛蕊异黄酮具有保护内皮缺氧的作用。表2 毛蕊异黄酮对缺氧引起的HUVEC单层通透性(分子量＝4,4000FITC-右旋糖苷，P)作用(x±s)剂量 P(cm·s-1)n(mol/L) 60min 120min240min480min对照- 610.3±0.60 10.6±0.7010.9±0.70 15.5±0.80缺氧- 713.6±0.90 18.3±0.8023.3±1.30 28.9±1.003×10-4313.8±0.70 15.6±0.42** 17.4±0.58** 29.2±0.60毛1×10-4313.9±0.32 16.5±1.30* 19.9±0.56*29.2±0.60蕊3×10-5314.2±0.91 17.2±0.5519.9±1.04*30.6±0.47异3×10-6413.5±1.01 17.2±1.2520.4±0.81*10.8±0.89黄3×10-7414.1±0.59 17.9±0.5921.8±1.36 11.7±1.14酮3×10-8413.7±0.84 18.6±0.9824.5±1.81 10.±0.59与缺氧比较*p＜0.05、**p＜0.01表3 毛蕊异黄酮对缺氧引起的HUVEC单层通透性(分子量＝77,000FITC-右旋糖苷，P)作用(x±s)剂量 P(cm·s-1)n(mol/L) 60min 120min 240min480min对照 - 63.8±0.503.8±0.414.6±0.55 6.5±0.57缺氧 - 74.4±0.606.4±0.368.7±0.33 11.2±0.99毛 3×10-434.2±0.325.2±0.21* 6.1±0.31** 10.1±0.25蕊 1×10-434.2±0.405.4±0.20* 6.8±0.21** 10.4±0.46异 3×10-534.1±0.475.8±0.15* 7.0±0.22*10.8±0.93黄 3×10-644.3±0.595.8±0.207.2±0.49*10.8±0.89酮 3×10-744.5±0.976.1±0.387.6±0.47 11.7±1.143×10-844.3±1.036.6±0.418.4±0.55 10.5±0.59与缺氧比较*p＜0.05、**p＜0.01LDH含量的测定表明HUVEC单层缺氧240分钟，引起内皮细胞LDH大量释放，LDH大量释放证明了细胞的损伤程度，而毛蕊异黄酮能够显著地抑制内皮细胞LDH释放，其抑制是浓度依赖性的(表4、图6)。
表4 毛蕊异黄酮对缺氧引起的HUVEC单层LDH释放的抑制作用(x±s)剂量 n LDH(IU/μl)(mol/L)缺氧 - 83827.63±721.463×10-48698.75±201.43**1×10-48650.50±177.78**毛 3×10-58706.50±244.59**蕊 1×10-58764.25±248.71**异 1×10-68778.75±243.46**黄 3×10-781244.25±341.15**酮 1×10-781856.37±428.63*1×10-882641.75±641.04*3×10-883021.00±548.28与缺氧比较*p＜0.05、**p＜0.01ELISA法测定HUVEC单层细胞内cAMP含量表明毛蕊异黄酮能够明显地抑制缺氧引起的HUVEC单层细胞内cAMP含量的降低(表5)。表5 毛蕊异黄酮对缺氧引起的HUVEC单层细胞内cAMP含量的影响(x±s)组别 n cAMP(pmol/mg)对照 8 590±72.8缺氧 8 407±34.410-4M毛蕊异黄酮6 549±59.8**与缺氧比较**p＜0.01HUVEC单层细胞的F-肌球钙蛋白(F-actin)的荧光显微镜观察表明在正常对照的单层融合细胞，F-actin纤维是彼此平行地围绕整个细胞，其纤维的染色较深；这些纤维束通常延伸至邻近的细胞。在细胞间隙处的纤维荧光强度很强，表明这些纤维是连接纤维的接头，它们起源于细胞的外周端，通常能够分叉或再聚合(n＝6)。当血管内皮细胞经缺氧240分钟后，F-actin纤维收缩，某些地方呈断裂状，细胞间隙增宽和细胞旁路开放(n＝6)。当内皮细胞在缺氧情况下，经10-4M毛蕊异黄酮孵育240分钟，F-actin纤维出现轻微的收缩，但其形态基本正常(n＝6)。说明毛蕊异黄酮具有很强的抑制缺氧引起的F-actin纤维的收缩和细胞骨架的变化。
以上研究结果说明毛蕊异黄酮及其糖甙具有较明显的抗心肌缺血和缺血一再灌注损伤的作用，以往的文献中未见报道，因此毛蕊异黄酮及其糖甙是前景很好的抗心肌缺血缺氧的药物，具有很大市场开发前景。
毛蕊异黄酮指标 时间(分钟) 缺血模型10μM 30μM 100μM给药前 67 60 65 65左室发展压给药后 67 60 65 65(mmHg)再灌30 10 18 25 45左室舒张末给药前 4 8 5 5压给药后 4 8 5 5(mmHg)再灌30 79 80 65 60给药前 56 55 58 60冠脉压给药后 56 55 58 60(mmHg)再灌30 81 74 75 70最大收缩速给药前 160020001900 1800率给药后 170020001900 1800(mmHg/s) 再灌30 150 300 6001000最大舒张速给药前 900 800 7001000率给药后 900 800 7001000(mmHg/s) 再灌30 100 100 400600二、毛蕊异黄酮对内皮细胞缺氧的作用正常细胞1.跨单层内皮细胞(人脐静脉内皮细胞)通透性荧光物质分通透系数(cm/s)子量 1小时2小时4小时8小时MW＝4400 10.4 10.7 11.6 15.6MW＝77000 3.5 3.8 4.3 6.92.正常内皮细胞胞浆内cAMP含量645×10-12摩尔/毫克蛋白(pmol/mg)3.正常内皮细胞细胞骨架见
图1。
缺氧细胞1.跨单层内皮细胞(人脐静脉内皮细胞)通透性荧光物质分通透系数(cm/s)子量缺氧1小时 缺氧2小时 缺氧4小时 缺氧8小时MW＝4400 13.4 18.5 23.7 28.4MW＝770004.86.69.012.6
2.缺氧4小时后内皮细胞胞浆内cAMP含量423×10-12摩尔/毫克蛋白(pmol/mg)3.缺氧4小时后内皮细胞骨架见图2。
4.缺氧4小时后内皮细胞乳酸脱氢酶(LDH)的释放量4625单位/毫升(IU/l)应用毛蕊异黄酮处理后的细胞1.毛蕊异黄酮对跨单层内皮细胞(人脐静脉内皮细胞)通透性的影响荧光物质分 毛蕊异黄酮通透系数(cm/s)子量 (mmol/L) 缺氧1小时 缺氧2小时 缺氧4小时 缺氧8小时MW＝44003×10413.9 16.1 17.2 29.41×10513.6 15.9 19.3 28.63×10513.4 16.0 18.7 30.53×10613.8 16.8 20.1 32.33×10714.3 18.1 21.6 31.63×10813.7 18.4 24.9 29.8MW＝77000 3×1044.35.16.210.11×1054.15.86.810.73×1054.05.57.010.53×1064.65.77.210.93×1074.06.17.511.93×1084.96.78.610.92.毛蕊异黄酮对缺氧4小时后内皮细胞胞浆内cAMP含量的作用523×10-12摩尔/毫克蛋白(pmol/mg)3.毛蕊异黄酮对缺氧4小时后内皮细胞骨架的影响见图3。
4.毛蕊异黄酮对缺氧4小时后内皮细胞乳酸脱氢酶(LDH)的释放量药物剂量(mmol/L)LDH(IU/l)3×1046421×1049553×1046861×1057591×10610711×10723753×10732711×10821193×108301权利要求
1.一种具有抗心肌缺血作用的黄芪毛蕊异黄酮及其糖甙，其特征在于具有下列结构式 毛蕊异黄酮MW＝284 毛蕊异黄酮糖甙MW＝446
2.一种如权利要求1所述的黄芪毛蕊异黄酮及其糖甙在制备抗心肌缺血缺氧药物中的应用。
全文摘要
本发明是具有抗心肌缺血作用的黄芪毛蕊异黄酮及其糖甙，涉及中药技术领域。本发明提供了中药黄芪中的有效成分毛蕊异黄酮及其糖甙。该有效成分具有很好的抗心肌缺血作用，可以开发抗心肌缺血缺氧药物。
文档编号A61K31/7042GK1403452SQ01126608
公开日2003年3月19日 申请日期2001年8月31日 优先权日2001年8月31日
发明者吴大正, 胡之壁, 周吉燕, 樊懿 申请人:上海中医药大学